Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературных данных 11
1.1. Гены транскрипционных факторов AP-1 11
1.1.1.Общая характеристика и структура системы AP-1 11
1.1.2. Участие системы AP-1 в синтезе интерлейкинов 13
1.1.3. Участие системы AP-1 в синтезе коллагена I типа 14
1.1.4. Роль транскрипционных факторов АР-1 в патогенезе заболеваний кожи 15
1.2. Патогенез склеродермии 17
1.2.1. Сосудистая дисфункция 17
1.2.2. Аутоантитела при склеродермии 19
1.2.3. Нарушение синтеза коллагена. Цитокины и хемокины 22
1.2.4. Оксидантный стресс 28
1.3. Клиника очаговой склеродермии 29
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Общая характеристика пациентов 43
2.2. Общая характеристика метода терапии 52
2.3. Определение уровня экспрессии генов семейств Jun, Fra, Fos и A T F в режиме реального времени 58
Глава 3. Результаты исследования 64
3.1. Особенности экспрессии генов системы AP-1 у пациентов с очаговой склеродермией 64
3.2. Клиническая эффективность наружной терапии препаратом такролимус 0,1% у пациентов с очаговой склеродермией 83
Глава 4. Обсуждение результатов 98
Выводы 118
Практические рекомендации 119
- Общая характеристика и структура системы AP-1
- Нарушение синтеза коллагена. Цитокины и хемокины
- Определение уровня экспрессии генов семейств Jun, Fra, Fos и A T F в режиме реального времени
- Клиническая эффективность наружной терапии препаратом такролимус 0,1% у пациентов с очаговой склеродермией
Общая характеристика и структура системы AP-1
Транскрипционные факторы - ДНК-связывающие белки, имеющие селективную аффинность к специфическим нуклеотидным последовательностям и играющие ключевую роль в регуляции активности РНК-полимеразы II и экспрессии генов. Белок-активатор-1 (AP-1) - один из наиболее хорошо изученных членов этой группы, обладающий высоким сродством к 7-bp последовательности раннего промотора SV40. Он относится к группе димерных белков с «лей-циновой молней», включающей члены семейств Jun, Fos и активирующего транскрипционного фактора (ATF) и состоящей из большого числа различных комбинаций гетеро- и гомодимеров, при этом состав транскрипционного фактора определяет регулируемые им гены.
AP-1 регулирует большое число генов, вовлеченных в процессы пролиферации, морфогенеза, апоптоза и дифференцировки, а также клеточной защиты. Многие AP-1-зависимые гены кодируют другие транскрипционные факторы, цитокины, их рецепторы и ферменты, ответственные за метаболизм межклеточных сигнальных молекул.
c-Jun - наиболее изученный компонент системы AP-1. c-jun протоонкоген был впервые выделен из вируса саркомы птиц 17 в 1987 году в качестве клеточного гомолога ретровирусного онкогена -jun [Maki et al., 1987] и вскоре после этого был определен как основной компонент AP-1 [Bohmann et al., 1987]. c-Jun - ядерный белок, в небольших количествах экспрессируемый во многих типах клеток. Его экспрессия усиливается под воздействием факторов роста, цитоки-нов и ультрафиолетового излучения. Ген с-Jun человека - протоонкоген, в котором, как и во многих немедленно-ранних генах, не хватает интронов, он быстро и кратковременно активируется без необходимости синтеза нового белка. Цито-кины, факторы роста, стресс, бактериальные, вирусные инфекции и онкогены активируют c-jun и индуцируют его экспрессию в различных клетках. Во время пролиферации фибробластов c-jun отрицательно регулирует экспрессию p53. Считается, что данный ген участвует в контроле клеточного цикла, активируя промотер циклина D1 во время перехода M-G1 [Bakiri et al. ,2000].
Как и c-Jun, транскрипционный фактор JunB играет роль в регуляции экспрессии генов в ответ на воздействие факторов роста. JunB обладает схожей первичной структурой и способностью связывать ДНК, как и cJun, с отличиями в строении транскрипционного домена. В N-концевой области JunB отсутствуют сериновые остатки в позициях 63 и 73, что необходимо для MAPK-зависи-мого фосфорилирования. Тем не менее треониновые остатки в позициях 102 и 104, фосфорилируемые JNK, соответствуют треониновым остаткам в позициях 91 и 93 cJun [Li et al., 1999]. JunB и c-Jun значительно отличаются в своей способности активировать транскрипцию. В то время, как C-Jun - эффективный активатор промотеров c-Jun и коллагеназы, JunB таковым не является, по сути ин-гибируя активацию данных промотеров. Было показано, что JunB и c-Jun функционируют как антогонисты в контроле клеточной транскрипции, дифференци-ровки и экспрессии AP-1 зависимых таргетных генов.
JunD - наиболее распространенный из экспрессируемых в тканях белков AP-1 [Hirai et al., 1989]. Высказывалось предположение об антагонизме JunD и с-Jun в регуляции клеточного цикла и пролиферации. Тем не менее пролиферация фиробластов, лишенных JunD, ограничена, что подтверждает способность JunD как ингибировать, так и активировать прогрессию клеточного цикла в зависимости от потребностей клетки [Meixner et al., 2004].
Важный шаг в изучении транскрипционного фактора AP-1 был сделан после обнаружения способности онкопротеина c-Fos связываться с аналогичной последовательностью ДНК, что и c-Jun [Rauscher et al., 1988]. с-fos - немедленно-ранний портоонкоген c быстрой и ранней транскрипционной активацией в ответ на митогенные стимулы [Greenberg et al., 1984]. Как и c-Jun, c-FOS вовлечен в процессы пролиферации, дифференцировки, трансформации и апоптоза. По аналогии с Jun-белками все белки данной группы содержат в структуре гидрофобную лейциновую молнию bZIP, регулирующую белок-белковые взаимодействия, а также основной участок, отвечающий за связывание с ДНК. Они не способны формировать гомодимеры после активации, но формируют гетероди-меры с белками Jun [Halazonetis et al., 1988]. Этот белок экспрессируется в незначительных количествах в большинстве типов клеток, но его синтез быстро и кратковременно усиливается в ответ на различные стимулы, как, например, факторы роста и стресс. с-Fos белки ассоциированы с различными биологическими процессами: от прогрессии клеточного цикла, до клеточной трансформации и онкогенеза [Shualin et al., 2001]. Высокие уровни этого белка могут быть обнаружены в растущей кости, центральной нервной системе и некоторых ге-мопоэтических клетках, как мегакариоциты [Dony et al., 1987; Caubet et al., 1989; Smeyne et al., 1992]. Онкогенные свойства c-Fos были продемонстрированы при повышенной экспрессии, которая приводила к формированию остеосар-ком из хондробластов и остеокластов [Grigoriadis et al., 1993]. c-Fos совместно с c-Jun индуцируют транскрипцию генов цитокинов путем взаимодействия с ядерными факторами активации T-лимфоцитов (NFAT) [Сhian et al., 1998; Macian et al., 2000]. Последовательное связывание NFAT белков с AP-1 улучшает взаимодействие с ДНК и транскрипционную активность, индуцируемую AP-1 и NFAT факторами по отдельности. В регуляторных участках большинства генов участки, связывающие AP-1, прилежат к связующим участкам других транскрипционных факторов, в частности NFAT. Белки семейства ядерных факторов активированных Т-лимфоцитов являются объектом пристального изучения, будучи мишенями таких иммуносупрессантов, как циклоспорин А. NFAT белки, экспрессируемые в большинстве клеток иммунной системы, играют ключевую роль в транскрипции генов цитокинов, а также других генов, необходимых для иммунного ответа. В промотерных участках многих генов NFAT-связующий участок соседствует с участком AP-1, расположенном на расстоянии в 3 базовые пары, формируя комбинированную регуляторную последовательность размером в 15 базовых пар. С этой последовательностью связывается мономер NFAT и c-Jun:c-Fos AP-1 димер. Комбинированные регуляторные элементы со связывающими участками для AP-1 и NFAT встречаются в промотерах и интронах генов IL-2, IL-4, интерферона- и других цитокинов и их рецепторов [Chinenov et al., 2001]. При связывании антигена с мембранным рецептором совместный эффект NFAT и AP1 активирует данные гены во время дифференцировки лимфоцитов и моноцитов [Macian et al., 2005].
Белок-активатор-1 - ключевой белок, регулирующий синтез коллагена I типа, индуцируемый TGF-1. Cемейство TGF включает примерно 40 цитоки-нов, вовлеченных во многие физиологические процессы и регулирующие клеточную пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и миграцию. Как отмечалось выше, сигнальный путь TGF-1 играет ключевую роль в аномальной аккумуляции коллагена I и III типа при склеродермии. При связывании со своими лиган-дами рецепторы TGF формируют димерные трансмембранные комплексы, состоящие из рецепторов I и II типов, обладающих активностью тирозиновых ки-наз. Совместно с Smad белками рецепторы TGF регулируют деятельность системы AP-1 c помощью MAP киназ. Важно отметить, что Smad белки обладают низкой аффинностью к ДНК, и их связывание с регуляторными участками генов требует взаимодействия с другими транскрипционными факторами, в частности cJun и ATF-2 [Leask et al., 2004]. Транскрипция, индуцируемая TGF, регулируется cFos/cJun-комплексом совместно с белками Smad3 и Smad4 путем физического и функционального взаимодействия. Smad белки могут изменять TGF-индуцированную транскрипцию без c-Jun и c-Fos, но в основном они связываются с доступными AP-1 белками за счет Smad3-c-Jun взаимодействия. Этот полипротеинный комплекс является более стабильным и транскрипционно более активен [Zhang et al., 1998]. Smad белки вовлечены в регуляцию экспрессии генов cJun, JunB и коллагеназы 1 [Ten Dijke P. et al. 2004] .
Нарушение синтеза коллагена. Цитокины и хемокины
Повышенный синтез коллагена фибробластами, выделенными из очагов поражения, является одной из основных характеристик склеродермии и может быть тесно связан с ее патогенезом. В основе такой формы тканевого ответа лежит активация фибробластов, вызывающая повышенное отложение клетками внеклеточного матрикса, являющееся главным признаком заболевания [Влади-мирцев В.А., 1982]. Можно сказать, что суть процессов, лежащих в основе патогенеза склеродермии схожа с заживлением раны, вышедшим из-под контроля. Многие исследования позволяют предположить, что ключевую роль в данном процессе играет трансформирующий фактор роста (TGF-). В биоптатах у пациентов со склерозирующими заболеваниями кожи, включающими системный склероз и ограниченную склеродермию, был выявлен повышенный синтез TGF-1 [Higley et al., 1994]. Эффект TGF- 1 на мезенхимальные клетки - синтез компонентов внеклеточного матрикса. Было обнаружено, что TGF-1 повышает экспрессию генов, отвечающих за синтез коллагена I, III, VI, VII, X типов, фибронектина и протеогликанов. Также в субпопуляции фибробластов был выявлен синтез различных изоформ TGF- и тканевого ингибитора металлопроте-иназ - 3 (TIMP-3) [Mattila et al., 1998]. TGF- повышает экспрессию TIMP-3, а TIMP-3 ингибирует распад коллагена. Таким образом, синтез экстрацеллюляр-ного матрикса усиливается за счет ингибирования деградации матрикса, вызванного снижением синтеза протеаз [Massague et al., 2000].
Члены суперсемейства TGF- не только стимулируют синтез внеклеточного матрикса, но также контролируют на расстоянии все функции фибробла-стов, ответственные за регенерацию: синтез цитокинов, экспрессию интегринов и цитокиновых рецепторов, а также пролиферацию, дифференцировку и апо-птоз. В добавок TGF- влияет на воспаление, пролиферацию эпидермиса и ан-гиогенез и все важные составляющие процесса репарации. Эта особая плей-отропия действий согласуется с наблюдением, что воспалительные клетки, эн-дотелиоциты и кератиноциты, в дополнение к фибробластам, синтезируют рецепторы к TGF- и сами способны секретировать TGF- [Derynck et al., 1997].
Как было отмечено выше, процесс отложения компонентов внеклеточного матрикса при склеродермии можно сравнить с заживлением раны. Физиологическое заживление раны является самоограниченным процессом: когда в ране откладывается достаточное количество матрикса, фибробласты или переходят в изначальное покоящееся состояние или подвергаются апоптозу. Отложение матрикса ограничено и, таким образом, рубцевание предотвращается [O Kane S et al., 1997]. Напротив, при патологическом рубцевании фибробласты, активированные неизвестным «травмирующим» стимулом продолжают синтезировать компоненты матрикса и профибротические цитокины, даже после достижения полного заживления. Временные и пространственные ограничения утрачиваются и развивается хронический прогрессирующий склероз. При склеродермии фибробласты сами секретируют TGF-, а также фактор роста соединительной ткани (CTGF) [Shi-Wen et al., 2000]. Кроме того, фибробластах при склеродермии повышена экспрессия тканевого ингибитора металлопротеиназ и ингибитора активатора плазминогена I (PAI-1), тогда как синтез коллагеназы I нарушен [Shimuzu et al., 2008].
Существует три изотипа рецепторов TGF-1: I, II и III, причем I и II изо-типы участвуют в передаче сигналов TGF-1. Рецепор к TGF-1 II типа (TGF-1RII) связывает TGF-1, затем в процесс вовлекается рецептор к TGF-1 I типа (TGF-1RI) с формированием гетеромерного комплекса. Комплекс может играть роль прямого транскрипционного фактора, а может не напрямую регулировать транскрипцию генов путем взаимодействия с другими транскрипционными факторами. В коже нормального человека мРНК TGF-1RI и TGF-1RII экспрессируется в значительном количестве в волосяных фолликулах и сальных железах, в умеренном количестве в эпидермисе и кровеносных сосудах и в незначительном количестве в веретеновидных клетках между пучками коллагено-вых волокон. Методом гибридизации in situ в биоптатах кожи у больных ограниченной склеродермией была выявлена повышенная экспрессия мРНК TGF-1RI и TGF-1RII в волосяных фолликулах, сальных железах и веретеновидных клетках, и умеренная в эпидермисе и кровеносных сосудах. В биоптатах больных склеродермии наблюдалось повышенное количество веретеновидных клеток и повышенная экспрессия мРНК TGF-1RI и TGF-1RII. При большем увеличении было установлено, что веретиновидные клетки морфологически соответствуют фибробластам. При иммуногистохимическом исследовании был также выявлен повышенный синтез TGF-1RI и TGF-1RII в фолликулах, сальных железах и фибробластах, а также в круглых клетках вокруг кровеносных сосудов. При окрашивании гематоксилином, было установлено, что данные клетки морфологически соответствовали лимфоцитам. Оба типа рецепторов синтезируются в одинаковом количестве [Kubo et al., 2001]. В исследованиях in vitro установлено, что повышенная экспрессия мРНК этих рецепторов коррелирует с повышенным уровнем мРНК 2(1) коллагена [Kawakami et al., 1998]. Таким образом, можно предположить, что повышение уровня синтеза TGF и увеличение числа его рецепторов ведет к повышенному синтезу компонентов внеклеточного матрикса, включая коллаген. Фибробласты чувствитеьны к эффектам
TGF и находятся в персистирующем активированном состоянии, поддерживаемом за счет аутокринно/паракринной регуляции с участием сигналов TGF и CTGF. Механизм данной регуляции может быть объяснен слудующим образом. Воспалительные клетки, инфильтрирующие очаг поражения секретируют TGF . В ответ происходит активация фибробластов и секреция ими (аутоин-дукция) TGF и CTGF. Данные цитокины стимулируют синтезировавшую их клетку и прилежащие фибробласты, которые таким образом сами становятся активированными. В результате устойчивого паракринно/аутокринного воздействия на фибробласты происходит прогрессивное отложение внеклеточного матрикса и тканевой фиброз. Данная особенность патогенеза может быть подтверждена возможностью нормализовать повышенную продукцию коллагена с помощью нейтрализующих антител к TGF [Ihn et al., 2001].
ИЛ-4 также регулирует пролиферацию фибробластов, экспрессию генов и синтез компонентов экстрацеллюлярного матрикса, таких как коллаген и синас-цин. Было установлено, что ИЛ-4 повышает синтез тканевого ингибитора ме-таллопротеиназ 2 (TIMP-2) в дермальных фибробластах за счет каскада мито-ген-активных протеиновых киназ, а также за счет усиления синтеза TGF . Увеличение продукции ИЛ-4 выявлено в сыворотке, а также в активированных периферических мононуклеарных клетках крови пациентов с системным склер зом [Elovic et al., 1998]. Было показано, что уровень ИЛ-4 повышен в образцах, взятых из пораженных участков кожи у пациентов со склеродермией [Okanoet al., 1996]. Важно отметить, что уровни ИЛ-4 в сыворотке крови у пациентов с очаговой склеродермией были повышены на 14-47% в сравнении с группой контроля [Veldhoen et al., 2006]. Профибротическая активность ИЛ-4 приводит к усиленной продукции экстрацеллюлярного матрикса опосредованно через Stat6 белок. Stat6 может усиливать транскрипцию гена TGF .
Определение уровня экспрессии генов семейств Jun, Fra, Fos и A T F в режиме реального времени
В качестве материала для молекулярно-биологического исследования были взяты образцы кожи диаметром 4 мм, полученные с помощью пункцион-ной биопсии. Забор материала из пораженного и непораженного участков кожи проводили под местной анестезией 1% раствором ультракаина с помощью дерматологического пробойника соответствующего диаметра (4 мм). Биопсии из непораженных участков кожи выполнялись на расстоянии около 3 см от пораженной кожи. Производилась быстрая заморозка образцов пораженной кожи в жидком азоте. Время от начала процедуры забора биоптатов до замораживания не превышало 15 секунд. Исследование было одобрено Локальным комитетом по этике при Институте общей генетики РАН и соответствует принципам, изложенным в Декларации Хельсинского соглашения. Анализ экспрессии генов, кодирующих компонентов транскрипционного фактора AP1 в биоптатах кожи из очагов склеродермии.
Выделение РНК из биоптатов проводилось на колонках Qiagen согласно стандартному протоколу RNeasy Mini Kit для кожи. Чтобы освободить препараты РНК от примесей ДНК проводилась их обработка ДНКазой Qiagen.
Далее к фрагменту ткани добавляли 300 ц! RLT буфера (содержащего -МЕ) и проводили немедленную гомогенизацию. К полученному гомогенату добавляли 590ul ddH20 и 10ul протеиназы К (10 мг/мл, AppliChem, USA) и перемешивали методом пипетирования. Смесь инкубировали 10 мин при 55С, а затем центрифугировали 3 мин при 10000g при комнатной температуре, а супер-натант (около 900ц1) переносился в новую пробирку.
К супернатанту добавляли половину объема (около 450ц1) этанола 96%. 700ц1 образца, включая преципитат, переносили на RNeasy mini колонку, вставленную в 2-х мл пробирку, и центрифугировали 15 сек на скорости ЮОООоб/ мин. Жидкость из пробирки удалялась, после чего повторяли предыдущий этап.
Колонка промывалась с помощью 350ul Buffer RW1, после чего производилась обрабо тка ферментом ДНКазой. Для этого 10ц1 исходного раствора DNase I с 70ul Buffer RDD добавляли на поверхность силикагеля и оставляли при комнатной температуре на 15 мин. Колонку промывали 350ul Buffer RW1 и дважды 500 ul Buffer RPE.
РНК элюировали 60ul RNAase-free Н2О
Концентрация РНК измерялась с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США), после чего образцы выравнивали по концентрации в ddHbO.
Обратная транскрипция проводилась следующим образом. В пробирки для ПЦР объемом 200 мкл вносили: буфер, dNTP, 100 ед. обратной транскриптазы MMLV (Promega), 20 ед. ингибитора РНКаз RNasin (Promega), 500 нг oligo(dT) прайм еров (ДНКСинтез) и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл, после чего осуществлялось термостатирование смеси один час при 37С. Для контроля отсутствия примеси ДНК в образце РНК проводили ПЦР на фрагмент гена JUND (forward primer 5 -AGCTCACAGTTCCTCTACCC-3 , reverse primer 5 -GCTGGTTCTGCTTGTGTAAATC-3 ) без обратной транскрипции.
С целью контроля выделения РНК и обратной транскрипции, а также для нормализации количества РНК в образцах проводили ПЦР с праймерами на « ге н д ома шн его хо зя йс т ва» G APD H (fo r wa r d pri m e r 5 GCMTCCTGCACCACCAACT, reverse primer 5 -YGCCTGCTTCAC CACCTTC).
ПЦР в реальном времени проводили в 96-луночных оптических плашках с использованием меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб. Реакцию проводили с использованием 2,5-х кратной реакционной смеси с референсным красителем ROX (Синтол). Праймеры и пробы были синтезированы фирмой «ДНК-Синтез» (табл.8).
Амплификация проводилась в ПЦР-амплификаторе Bio-Rad, iQ4, с использованием следующей программы: (1) в течение 4 мин денатурация при 95С, (2) в течение 15 сек денатурация при 94С, (3) в течение 15 сек отжиг при 55С, (4) в течение 15 сек элонгация при 72С, (5) этапы 2-4 повторяли 50 раз. Экспериментальная работа по изучению экспрессии генов была произвежена на базе лаборатории функциональной геномики Института общей генетики РАН.
Для приготовления стандартов производилось лигирование продуктов амплификации в T-вектор pALA (Евроген). С помощью набора QIAprep (Qiagen) осуществлялось выделение плазмиды. Концентрацию плазмиды измеряли на спектрофотометре Eppendorf.
Экспрессию генов-мишеней нормализовали на ген домашнего хозяйства GAPDH.
В качестве стандартов была использована серия из четырех десятикратных разбавлений. Для обсчета результатов использовались данные реакции ПЦР в реальном времени со следующими параметрами: эффективность праймеров в реакции ПЦР в реальном времени не менее 95%; коэффициент корреляции не менее 0,99; наклон кривой (slope) -3,4±0,2.
Обработку результатов полимеразной цепной реакции проводили методом 2-CT, который показывает, во сколько раз изменяется экспрессия гена в пораженном образце по сравнению с непораженным. Ct рассчитывалось как Ct = Ct(пораженной кожи) – Ct(непораженной кожи) и каждое значение Ct = Ct(исследуемый ген) – Ct(GAPDH). Эксперименты проводили в трехкратной повторности для каждого образца [Livak et al., 2001].
Оценка снижения индекса активности очаговой склеродермии mLoSSI, а также отдельно изменений индексов эритемы и толщины очага на момент посещения для 4 разных временных отметок (первичный визит, повторные посещения через 4 недели, 8 недель и 12 недель) проводилась с помощью непараметрического метода Фридмана и двухфакторного дисперсионного анализа (two-way ANOVA). Статистический анализ данных осуществлялся с помощью программ SPSS v.21 и Prism 6 Graphpad. Метод Фридмана применялся в связи с небольшим количеством испытуемых, а также поскольку нельзя было подтвердить допущение о нормальности распределения. Достоверными считались различия при p 0.05. При общей достоверности результатов проводились апостериорные сравнения с помощью критерия Вилкоксона. Критический уровень значимости определялся с помощью поправки Бонферрони для учета потенциального увеличения вероятности совершения ошибки 1 рода. Для данного исследования критический уровень составил 0,0125. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеквадратичные отклонения.
Клиническая эффективность наружной терапии препаратом такролимус 0,1% у пациентов с очаговой склеродермией
Клиническая оценка эффективности терапии мазью такролимус 0,1% осуществлялась с помощью индекса активности очаговой склеродермии, измерявшегося до начала терапии, в процессе и по ее завершении и учитывающего распространенность и тяжесть клинической симптоматики.
C этой целью анализировались следующие клинические критерии: исчезновение эритемы и венчика роста по периферии очагов, уменьшение их размеров, уменьшение инфильтрации.
Все пациенты завершили полный курс лечения и не пропустили ни одного контрольного визита.
На фоне применения препарата такролимус в основной группе отмечалась более выраженная положительная динамика в отношении клинических проявлений бляшечной склеродермии (рис.12). У пациентов основной группы ре -гресс клинической симптоматики в среднем составлял для эритемы 86,2% и для индурации – 71,2%, что достоверно лучше, чем в контрольной группе – 38,2% и 34,9% соответственно.
В группе контроля также отмечалось выраженное снижение показателей, однако изменение их динамики не было столь значительным (табл.19).
Таким образом, наиболее выраженное снижение общего показателя индекса тяжести патологического процесса отмечалось в группе, применявшей та-кролимус, при этом суммарный индекс снизился на 75,2%, в то время, как в группе контроля редукция составила 37,2%.
При сравнительном анализе изменения индекса активности склеродермии mLoSSI и его показателей при повторяющихся измерениях у двух групп пациентов была выявлена следующая динамика.
После наружного применения мази такролимус 0,1% у 40 пациентов в основной группе клиническое выздоровление отмечалось у 6 (15,0%), значительное улучшение - у 20 (50,0%), улучшение у 2 (5,0%), стабилизация процесса у 8 пациентов (20,0%), и у 4 больных (10,0%) отсутствовал эффект от лечения. Таким образом, терапевтический эффект наблюдался у 70,0% больных. В группе пациентов, получавших стандартное наружное лечение стероидами сильного класса терапевтический эффект отмечался лишь в 32,5% случаев, при этом снижение клинического выздоровления не отмечалось ни в одном случае. Из 40 испытуемых только у 6 (15,0%) больных удалось достигнуть значительного улучшения, у 14 (35,0%) отмечалось улучшение, стабилизация состояния - у 10 (25,0%) пациентов. У 10 (25,0%) больных отсутствовал эффект от проводимой терапии значительное клиническое улучшение достигнуто у 2 (5,0%), улучшение наблюдалось у 11 (27,5%), у 22 (55%) - стабилизация процесса, отсутствовал эффект у 5 больных (12,5%). Таким образом, у 39 (87,5%) больных констатирован терапевтический эффект.
При сравнении динамики индекса активности очаговой склеродермии mLoSSI во время наружной терапии с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA были выявлены следующие закономерности.
Динамика изменения индекса активности очаговой склеродермии (p=0.0044) под влиянием проводимых методов лечения в двух группах с измерениями показателей на 0, 4, 8 и 12 неделях соответственно Как видно из графиков на рисунке 13 в обеих группах больных, получавших наружную терапию, наблюдалось отчетливое снижение индекса активности склеродермического процесса от визита к визиту с начала лечения до момента окончания исследования на 12 неделе. При этом в группе, получавшей мазь такролимус 0,1% отмечалось более выраженное снижение показателя. Дисперсионный анализ продемонстрировал высокую статистическую значимость воздействия лечения на снижение индекса mLoSSI (p=0.0044). Также наблюдалась выраженная статистически значимая зависимость эффекта терапии от времени (p 0.0001 при F (3, 234) = 177.8). Статистически значимое взаимодействие факторов (лечение и длительность) p 0.0001 подтверждает различие во влиянии терапии на изменение индекса во времени и свидетельствует о более высокой эффективности такролимуса.
При анализе отдельных составляющих индекса mLoSSI было выявлено статистически достоверный регресс эритемы в очагах, как в группе, применявшей стероидные препараты, так и у пациентов, получавших лечение такроли-мусом 0,1% (P=0.0004). Наблюдалась высокая статистическая значимость влияния длительности применения препарата на результаты терапии (F (3, 117) = 121.9, P 0.0001). Статистически значимое взаимодействие длительности терапии и эффекта применяемых препаратов (P = 0.0067) подтверждало различия во влиянии проводимой терапии на уменьшение эритемы и высокую эффективность такролимуса 0,1% (рис.14).
Аналогичная картина наблюдалась при анализе изменений инфильтрации во времени (рис.15). Степень уплотнения очага достоверно уменьшалась в зависимости от длительности курса терапии, при этом степень выраженности лечебного эффекта имела достоверную зависимость от нанесенного препарата. У больных, применявших наружно такролимус к 12 неделе лечения очаги были менее инфильтрированными и более эластичными (P 0.0001).
При индивидуальном анализе изменений индекса активности mLoSSI под воздействием наружного нанесения препарата такролимус 0,1% применялся статистический метод Фридмана для исследований с серией измерений во времени. Результаты метода Фридмана продемонстрировали статистически достоверное снижение активности склеродермического процесса на фоне лечения та-кролимусом 2=49,299, р 0,001 (рис.16). Апостериорный анализ с помощью метода Вилкоксона с критическим уровнем значимости 0,0125 показал, что статистически достоверное снижение индекса mLoSSI наблюдалось в каждый временной промежуток между повторными визитами пациентов (таблица 20). Только у одной пациентки из исследуемых 40 отсутствовал эффект от наружной терапии, и индекс mLoSSI сохранялся на одном уровне от визита к визиту вплоть до завершения курса терапии. Впоследствии данная пациентка была переведена на стационарное лечение, где был назначен циклоспорин А.
К 12 неделе лечения снижение индекса активности более, чем на 75%, отмечалось у 26 (65%) пациентов. В течение первого месяца достоверное снижение активности процесса (р 0,001) отмечалось у 34 (85%) пациентов, на 8 неделе терапии положительная динамика наблюдалась у 36 (90%) человек, к завершению курса у 31 (78%), у 8 (20%) пациентов после достоверного снижения индекс активности сохранялся на одном уровне.
Ни у одного пациента не наблюдалось усиление активности процесса в течение всего курса терапии. Полной ремиссии с mLoSSI=0 удалось достичь у 3 (7,5%) пациентов. Лучше терапии поддавались больные с единичными очагами на стадии эритемы. Отсутствие или незначительное снижение индекса активности наблюдалось у пациентов с генерализованной формой очаговой склеродермии. Таким образом, под влиянием применения такролимуса 0,1 уже, начиная со второго визита (4 недели) отмечалось достоверно значимая положительная динамика в отношении основных клинических проявлений очаговой склеродермии (табл.20).
![Применение широкополосного интенсивного импульсного светового излучения при лечении пациентов с розацеа [Электронный ресурс]](/i/i/4492/183536.png "Применение широкополосного интенсивного импульсного светового излучения при лечении пациентов с розацеа [Электронный ресурс] Галкина Ольга Анатольевна")
