Содержание к диссертации
Введение
Часть 1. Обзор литературы 15
Глава 1. Иммунный ответ при лепре, серологические показатели и их клиническое значение 15
Глава 2. Белки острой фазы при микобактериозах (клиническое значение, особенности) 25
Глава 3 Бактериальная персистенция при лепре 35
Часть II. Собственные исследования и ихобсуждение 45
Глава 4. Материалы и методы исследования 45
4 1 Характеристика клинического материала 45
4.2 Характеристика тест-систем 47
4.3 Методы исследования 49
Глава 5. Серодиагностика у больных лепрой в стадии клинического регресса и её клинико-прогностическая ценность 60
Глава 6. Прогностическая ценность определения иммуноглобулинов класса IgG у больных лепрой в стадии регресса заболевания 85
Глава 7 Содержание лактоферрина и ферритина у больных лепрой при бактериальной персистенции и их клиническое и прогностическое значение 119
Глава 8 Белки острой фазы как специфические маркёры активности лепрозного процесса 145
8 I С- реактивный белок 146
8. 3 аг - макроглобулин 164
Заключение 175
Выводы 185
Практические рекомендации 187
Список литературы 189
- Иммунный ответ при лепре, серологические показатели и их клиническое значение
- Серодиагностика у больных лепрой в стадии клинического регресса и её клинико-прогностическая ценность
- Содержание лактоферрина и ферритина у больных лепрой при бактериальной персистенции и их клиническое и прогностическое значение
- 3 аг - макроглобулин
Введение к работе
Актуальность темы.
Сформулированная более 20 лет назад концепция искоренения лепры оказалась не реализованной. Согласно данным ВОЗ, в 70 странах мира насчитывается 1.8 млн. больных лепрой, ежегодно регистрируется 500-800 тыс. новых случаев заболевания. В настоящее время большинство больных проживает в странах Юго-Восточной Азии, Африки, Латинской Америки, Региона Западной части Тихого океана. Предложенное инспекторами ВОЗ сокращение сроков комбинированной терапии лепры до двух лет при многобацилярной форме и до шести месяцев малобактериальной формы привело к тому, что в последние десятилетия участились случаи рецидивов болезни. (Weekly Epidemiolojical Record, W.H. O., Geneva, 1997, №23).
На территории Российской Федерации продолжают регистрироваться спорадические случаи заболевания. Основным очагом лепры по-прежнему остаётся Астраханская область, хотя за последнее десятилетие больные лепрой были выявлены и в девятнадцати других регионах России. 70% больных находятся на амбулаторном лечении. Как правило, это бактериоскопически негативные больные с клинически регрессирующей лепрой (Ющенко А.А. с соавт., 2001).
Микобактерии лепры способны длительно персистировать в макрофагах человека (Вишневецкий Р.Ф., 1993; Treo М. et al., 1961; Chaudhuri S. et al., 1998), что беспечивается комплексом разнообразных механизмов (изменяются антигенная структура, вирулентность, инвазивность и др.).
В связи с этим больные, выписанные на амбулаторное лечение с персистирующими формами M. leprae, могут быть источником заражения, осложняя эпидемиологическую ситуацию.
В этих условиях существующие методы оценки эффективности амбулаторного лечения и клинического состояния больных лепрой (общий осмотр, периодическая оценка наличия микобактерий в коже и слизистой носа) не способны адекватно оценить степень стойкости регресса заболевания.
Известно, что на разных стадиях развития лепрозного процесса в сыворотке крови больных обнаруживаются антитела к отдельным антигенным детерминантам M.leprae, которые являются маркерами присутствия возбудителя в организме и служат индикатором активности или регресса лепрозной инфекции (Дегтярёв О.В., 1998; Meng M. et al., 1993; Parkash O. et al., 1995).
Более 30% больных с регрессом клинических проявлений, бактериоскопически негативных (БИН=0), имеют высокие титры антител к M. leprae, что позволяет выявить среди них группу лиц с риском активации лепрозного процесс (Дячина М.Н. с соавт., 1991). Однако, наличие или отсутствие антител к M. leprae не всегда может служить критерием излеченности, так как при отсутствии клинических признаков заболевания антитела к антигенам M.leprae могут появляться из депо гликолипидных антигенов M. leprae (ФГЛ – 1 и ЛАМ), т.е. антигенная персистенция может индуцировать антительную реакцию, несмотря на прекращение химиотерапии (Meeker H. C. et al., 1990; Miller et al., 1984). Обнаруженные антитела в сыворотке крови у больных с данной инфекцией могут являться следовыми или анамнестическими (Roche P.W. et al., 1993; Joshi B. et al., 2001).
Таким образом, серологическая диагностика, направленная на выявление активности специфического патологического процесса, не всегда раскрывает конкретную причину специфических серологических реакций при отсутствии клинических признаков заболевания. Поэтому поиск новых, дополнительных и доступных для широкой практики диагностических тестов по контролю эффективности лечения и оценки критериев излеченности является актуальной проблемой лепрологии.
Спектр антительного ответа больных лепрой на различные антигенные детерминанты характеризуется большой вариабельностью. В активной стадии заболевания доминируют иммуноглобулины класса IgG (Dhandaynthapani S. et al., 1992). Одни исследователи считают, что антительный ответ IgG класса обеспечивается тремя из четырёх изотипов – IgG1, IgG2, IgG3 – независимо от уровня Т-клеточной активности (Hussain R. С. et al.,1994, 1995). Другие установили разницу распознавания антигенов М. leprae субклассами IgG1, IgG3 в полярных группах больных. Они связывают это с дифференцированной Т- клеточной активностью больных с полярными типами лепры (Sheela R., 1995; Jefferis R. et al., 1992). А. Kifayet и соавт. (1996) считают, что дифференцированное определение иммуноглобулинов субклассов IgG1 и IgG3 не только может быть перспективным тестом в серодиагностике лепры, но открывает возможности для оценки роли гуморальных механизмов иммунитета и развития патологического процесса.
В настоящее время внимание исследователей привлекает группа минорных белков: С-реактивный белок (СРБ), 2 – макроглобулин (2 – МГ), связанный с беременностью 2 – гликопротеин (СБАГ), лактоферрин (ЛФ). Установлено, что динамика концентрации индивидуальных белков сыворотки крови (БОФ) является одним из показателей активности или регресса инфекции и может быть использована в качестве критерия адекватности проводимого лечения.
Известны работы по определению некоторых индивидуальных белков сыворотки крови у больных лепрой. Так, повышение уровня СРБ обнаружено у больных лепроматозным типом лепры в активной стадии болезни (Ющенко А.А., 1964, Кулагин П.П., 1970; Memon R.А. et al., 1996). R.Hussain и соавт. (1995, 1999), R.Shella и соавт. (1995) выявили повышение уровня СРБ при лепрозной реакции и его заметное снижение при острых реактивных состояниях.
К числу малоизученных белков при лепре можно отнести сывороточный лактоферрин и ферритин, которые обладают защитными свойствами, ингибируя размножение ряда микроорганизмов путём связывания железа (Aninolfi M.C. et al.,1981; Borner C. et al.,1986).
Имеются данные об изменении концентрации лактоферрина в сыворотке крови больных лепроматозным типом лепры в сравнении со здоровыми донорами и корреляции его уровня с бактериальной нагрузкой (Parkash O. et al.,1993).
Важную роль в развитии гранулематозного воспаления играют ингибиторы протеаз, в частности 2- МГ. Этот протеин обладает иммунорегуляторной ативностью (James K., 1980; 1990), образует защитный барьер против патогенных микробов, активируя макрофаги и нейтрофилы (Веремеенко К.Н. с соавт., 1987). У больных с признаками лекарственной устойчивости отмечается снижение 2– МГ в сыворотке крови (Долгов В.В. с соавт., 1999).
Связанный с беременностью гликопротеин (СБАГ) является регулятором уровня иммуноглобулинов и индикатором воспаления при вялотекущих и латентных формах инфекций (Никулина Д.М. с соавт., 1991; 1998).
Приведённые выше работы констатировали лишь факт обнаружения белков острой фазы в сыворотке крови больных лепрой, не уточняя роль протеинов в механизме специфической и неспецифической активности при лепре.
Учитывая, что в настоящее время более 70% всех учтённых больных лепрой находятся на амбулаторном лечении и диспансерном наблюдении, а среди этой категории нередки случаи активации патологического процесса, обусловленные наличием персистирующих форм M.leprae, применение обычных рутинных методов лабораторного обследования не позволяет осуществлять эффективный контроль за специфической химиотерапией и устанавливать надёжный критерий излечённости. Поэтому актуальна разработка новых лабораторных программ и создание дифференциально-диагностических тестов и алгоритмов для верификации природы патологии у больных в стадии регресса при БИН=0, наиболее адекватно отражающих состояние регресса или активации специфического процесса.
Цель исследования.
Разработать систему комплексной клинико-лабораторной диагностики активности лепрозного процесса и бактериальной персистенции у больных лепрой в стадии регресса заболевания для мониторинга эффективности проводимой химиотерапии и своевременного предупреждения активации специфического лепрозного процесса.
Задачи исследования.
-
Исследовать динамику уровня антител к комплексу нативных и видоспецифическому синтетическому антигенам M.leprae у больных лепрой в стадии регресса заболевания. Определить степень прогностической ценности данного лабораторного теста.
-
Изучить и оценить клинико-диагностическое значение субклассов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 как маркёров активации лепрозного процесса у амбулаторной группы больных.
-
Изучить содержание индивидуальных белков «острой фазы» (СРБ, СБАГ, 2 – МГ) в крови больных лепрой и оценить их клиническую и прогностическую ценность, выявить связь между их динамикой и наличием персистирующих M.leprae в организме больных с регрессом заболевания.
-
Изучить содержание лактоферрина и ферритина в организме больных лепрой, находящихся в стадии регресса заболевания. Выявить зависимость между уровнем железосодержащих протеинов и возможной активацией лепрозного процесса
-
Обосновать применение многостороннего комплексного клинико-лабораторного мониторинга за группой амбулаторных больных с целью оценки адекватности проводимой химиотерапии и своевременного предупреждения активации специфического лепрозного процесса.
Научная новизна исследования.
Впервые проведено изучение спектра иммуноглобулинов класса IgG у больных лепрой в стадии регресса заболевания и оценено комплексное клинико-диагностическое значение их изотипов. Впервые показана роль субкласса IgG3 как маркёра возможной активации лепрозного процесса.
Впервые изучено содержание лактоферрина и ферритина в крови больных лепрой, находящихся на амбулаторном лечении. Показана прямая связь между уровнем их содержания и наличием очагов персистенции. Определена их роль как маркёров активации лепрозного процесса.
Впервые изучено содержание БОФ: СРБ, СБАГ и 2- МГ у пациентов в стадии регресса заболевания. Определена их клиническая и прогностическая ценность при наблюдении за состоянием специфического инфекционного процесса у данной категории больных.
Впервые на основе полученных данных разработана и обоснована система комплексной клинико-лабораторной диагностики активности лепрозного процесса и бактериальной персистенции у больных лепрой в стадии регресса заболевания.
Научно-практическая значимость работы.
Разработана система комплексной клинико-лабораторной диагностики активности лепрозного процесса и бактериальной персистенции у больных лепрой в стадии клинического регресса заболевания.
Предлагаемый подход в оценке состояния больных позволяет оценить адекватность и эффективность проводимых лечебно-профилактических мероприятий у больных с регрессом заболевания и находящихся в активной стадии, а также своевременно предупредить возможную активацию специфического лепрозного процесса.
Новые сведения, полученные в ходе проведённого исследования, выявили достоверные признаки персистирующих M.leprae в организме; а также установлена роль лактоферрина, ферритина, С-реактивного белка, СБАГ, 2-МГ, субклассов иммуноглобулинов класса IgG при специфическом лепрозном процессе в различных клинических стадиях.
Предложен способ определения M.leprae у больных с регрессом заболевания (Патент № 2137137) и способ диагностики лепры (Патент № 124730).
Основные положения, выносимые на защиту.
-
При отсутствии клинических признаков заболевания у больных лепрой спектр антител к видоспецифическому и перекрёстно реагирующим антигенам M.leprae не может дать исчерпывающей информации о конкретной причине наличия специфических серологических реакций.
-
Уровень продукции иммуноглобулинов субкласса IgG3 служит маркёром бактериальной персистенции у больных амбулаторной группы.
-
Концентрация лактоферрина и ферритина в крови больных лепрой коррелирует с особенностями течения специфического процесса.
-
Продукция 2- МГ у больных лепрой является показателем, влияющим на степень активности специфического инфекционного процесса.
-
Существует корреляционная зависимость между уровнем СБАГ в крови больных лепрой и возможной активацией лепрозного процесса.
-
У серопозитивных больных лепрой в стадии клинического регресса повышение СРБ коррелирует с ухудшением соматического состояния, обусловленного обострением специфических осложнений.
Внедрение полученных результатов.
По материалам работы получены 2 патента. Разработанные методы комплексной клинико-лабораторной диагностики активности лепрозного процесса и бактериальной персистенции внедрены в работу клинического и биохимического отдел ФГУ «НИИ по изучению лепры Росздрава».
Материалы диссертации используется при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах кожных и венерических болезней и микробиологии ГОУ ВПО АГМА.
Апробация работы, публикации.
Основные положения диссертации были представлены на: симпозиуме «Иммунодиагностика и иммунореабилитация при лепре, туберкулёзе и других хронических заболеваниях» (Астрахань, 1998); конференции «Актуальные вопросы дерматологии и венерологии» (Астрахань, 1998); 2-ой Всеросийской научной конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998); Международном Конгрессе по иммунореабилитации (Догомыс, 1998); 76-ой итоговой научно-практической конференции сотрудников АГМА (1999); Научно-практической конференции «Современные аспекты клиники, диагностики и лечения инфекций, передаваемых половым путём, наиболее распространённых дерматозов и микозов. Эпидемиологические подходы к анализу заболеваемости и диагностики ЛПУ.» (Москва, 1999); 15-ом Международном Конгрессе по лепре (Китай, 1998); 3-ем Конгрессе Балтийской ассоциации дерматовенерологов (Латвия, 2000); конференции «Актуальные проблемы биологии и медицины» (Астрахань, 2000); 5-ом симпозиуме «Новое в дерматовенерологии андрологии, гинекологии: наука и практика (2000); 8-ом Всеросийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2001); 2-ой школе-семинаре и научной конференции молодых учёных с международным участием (Москва, 2001); 16-ом Международном Конгрессе по лепре (Бразилия, 2002); 1-ом Российском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2003), 9-ый Всероссийский съезд дерматовенерологов (Москва 2005), областных научно-медицинских обществах по дерматовенерологов (Астрахань, 1998-2005), микробиологов, эпидемиологов, паразитологов (Астрахань, 1999-2005).
Объём и структура диссертации.
Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, выводов, заключения, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Материалы изложены на 223 страницах машинописного текста, включая 47 таблиц и 22 рисунка. Список литературы состоит из 359 работ, из них 119 отечественных и 240 зарубежных авторов.
Иммунный ответ при лепре, серологические показатели и их клиническое значение
Иммунный ответ при заболевании лепрой рассматривают как процесс тесного взаимодействия активированных макрофагов и Т-лимфоцитов. При этом главную роль в защите макроорганизма от М. leprae играет клеточный иммунитет. Известно, что у здоровых людей, как правило, макрофаги активируются микобактериями и развивают к ним естественную резистентность. При лепре захват макрофагами микобактерий приводит либо к их размножению, либо к их разрушению.
В первом случае имеет место избирательная нереагируемость (анергия) на М. leprae, вследствие чего хозяин не может сформировать адекватный клеточный иммунный ответ. В результате этого организм лишается зашиты от инфекционного агента и развивается много-бактериальная форма (РВ) болезни -лепроматозньїйтип епдиріаУ.С. et al, 1993)
Во втором случае формируется мало-бактериальная форма лепры (MP), характеризующаяся благоприятным течением болезни: сопровождающаяся высоким уровнем клеточного иммунного ответа и слабой продукцией антител против антигенов М. leprae.
В последние годы особое внимание уделяется вопросам определения интенсивности продукции антител при лепре.
Между антителообразованием и клеточным звеном иммунного ответа имеется обратная корреляционная зависимость. Неблагоприятное течение с массивным обсеменением при лепроматозном типе лепры сопровождается высоким уровнем антителообразования и практическим отсутствием реакций клеточного иммунитета (Gillis Т. P. et al, 1993; Rojas-Espinoza О. И. et al, 1994). Высокий уровень антител при этой форме лепры свидетельствует о неблагоприятном течении болезни (Дегтярев О.В с соавт., 1995, Banica D. et al, 1993; Douglas J. Т. et al., 1998). При малобактериальной форме лепры наблюдается низкий уровень антителообразования и высокий Т- клеточный иммунный ответ (Ridley D.S.etai., 1966).
Для обнаружения антител к М. leprae чаще всего применяют препараты из M.leprae, представляющие собой многокомпонентную антигенную систему, способную к поликлональной активации В-лимфоцитов (Buchanan Т.М. et al., 1984).
В качестве антигенных препаратов используют М leprae, выделенные от животных с экспериментальной лепрозной инфекцией (Young D.B., 1981; Douglas J. Т. et al, 1984; Klatser PR., 1994). Специфичность таких систем колеблется в пределах 84-100%, чувствительность в интервале 49-94%. Причина недостаточной эффективности заключается в том, что микобактерии имеют перекрестно-реагирующие антигены (Melsom R. С. et al., 1982; Britton W.J. et al., 1987).
В 80-х годах из M. leprae был выделен видоспецифический антиген - фе-нольный гликолипид-1 (ФГЛ-1), имеющий уникальную структуру концевой углеводной детерминанты (Вгеппап Р., 1984; Hunter S. W. etal, 1981; 1982).
Показана специфичность связывания ФГЛ-1 в системе иммунофермент-ного анализа (ИФА) с IgM-антителами в сыворотках больных лепрой. Однако его гликолипидная природа ограничила возможность использования ФГЛ-1 в качестве антигена в серологических реакциях из-за аполярности и гидрофобно-сти его молекулы (Cho S.N. et al., 1983, Young D В et at, 1983) С помощью мо-ноклональных антител к ФГЛ-1 была подтверждена специфичность его концевого моносахарида- 3,6-ди-метилглюкозы (Young D.B. et al., 1988) и проведен синтез аналогов ФГЛ-1 на основе моно-, ди- и трисахаридной детерминант (Бовин Н.В. с соавт., 1990; Сухенко Л.Т., 995;
Cho S.N et al., 1984; Fujiwara Т. et al., 1984) Синтезированные сахара были конъюгированы с BSA и в виде гликоконъюгатов полусинтетические аналоги ФГЛ-1 стали использоваться в качестве антигенов в ИФА для выявления IgM антител в сыворотке крови больных (Brett S.J. et al., 1986, Cho S N. et al., 1984, Harboe M. et al., 1998). Следует отметить, что водорастворимые гликоконъюга-ты оказались удобны в работе; специфичность теста колеблется от 90% до 100% (Cho S. N. et al., 1992; Levis W.R. et al., 1986; Smith R.G., 1992), его чувствительность составила 95% (Levis W.R. et al., 1986; Roche R.W. et al., 1990; Samuel N, 1985).
Уровень антител, определяемый с помощью данного антигена, в основном коррелирует с БИН (Brett S.J. et al., 1986; Douglas J.T. et al., 1987; Meeker H.C. et a!., 1986). Химиотерапия приводит к снижению уровня антител к ФГЛ-1 через 1,5-2 года, что даёт возможность проводить мониторинг эффективности лечения больных лепрой {Baumgart К. W et al., 1993; Brett S.J. et al., 1986; Chin-A-LienR.A. etal., 1992; Cho S.N. et al., 1992; Hussain R. etal., 1990).
Необходимо отметить, что у больных с мало-бактериальными формами лепры чувствительность теста ИФА - ФГЛ-1 является низкой: антитела выявляются только у 30-50% таких больных в активной стадии болезни и их уровень не всегда коррелирует с БИН (Cartel J.L. et al., 1990; Meeker H.C. et al., 1990; Дегтярёв O.B., 1998).
Успехи генной инженерии и молекулярной биологии позволили получить рекомбинантные белки М. leprae и моноклональные антитела к различным её эпитопам ( Ilangumaran S. et al., 1996; Sathish M. et al., 1987; Shinnick T. et al., 1987). Это послужило началом новых исследований, направленных на поиск антител не только к ФГЛ-1, но и другим идентифицированным антигенам М. leprae, для оценки их диагностической и прогностической роли.
Ilangumaran S и соавт (1996) считают, что при первичном воздействии М. leprae антитела вырабатываются сначала на поверхностные антигены пепти-догликанового комплекса и на протеиновые антигены, перекрестно реагирующие с другими микобактериями, а не на видоспецифические протеины М. leprae, антительная реакция на которые появляется уже при развившейся болезни. Первый протеиновый антиген с М.м. 35кДа был выделен из M.smegmatis и явился высоко специфичным в серодиагностике лепры (Miller R.A et al., 1984; Roche P.W.etal., 1990; 1993; UlrichM. et al., 1991). Полагают, что белок с М.м. 35 кДа является для человека основной и относительно специфичной мишенью на М leprae и потенциальным компонентом диагностического теста при лепре. Показана его высокая гомология по ДНК-последовательности с М. leprae ( Tnccas J. A. et al., 1996). Установлено, что титр lgG-антител к антигену 35кДа в сыворотках крови больных лепрой коррелирует с БИН и снижается во время лечения (Klaster PR et al., 1989, Meeker НС. et al., 1990) Lyons N.F. и соавт (1988) считают, что антиген 35кДа можно использовать в противоле-прозных программах для контроля за химиотерапией.
Другим перекрёстно реагирующим антигеном М. leprae является липоа-рабиноманнан (ЛАМ), выделенный из M.tuberculosis ЛАМ - сильный В-клеточиый иммуноген. Иногда у больных лепрой антитела определяются только к ЛАМ, а к другим микобактериальным антигенам они отсутствуют (Meeker H.C.etal, 1990; Miller R.A. etal., 1984;MwathaJ. et al., 1988).
Показана сравнительная оценка трех серологических тестов AT - ФГЛ-1, AT - 35кДа и AT - ЛАМ при различных формах лепры и тяжести лепрозного процесса. При MB форме лепры чувствительность тестов AT - 35кДа, AT -ФГЛ-1 соответствует 92% и 91%, а при одновременном использовании обоих тестов - 100% Слабая корреляция наблюдается между уровнем AT - 35кДа и AT -ЛАМ, корреляция между уровнем AT - ФГЛ-1 и AT - ЛАМ отсутствует Отмечена гетерогенность серологического ответа на все три антигена в группе РВ-больных в активной стадии болезни независимо от показаний БИН. Сочетание тестов позволяет выявлять большую группу серопозитивных больных, чем любой тест в отдельности. У 49% больных с MB формой лепры отмечается серо-позитивность в каком-либо из используемых тестов. Больные с глубокими ин-валидизирующими расстройствами являются высоко серопозитивиыми по сравнению с больными их не имеющими.
Серодиагностика у больных лепрой в стадии клинического регресса и её клинико-прогностическая ценность
Основным этапом медицинской реабилитации больных лепрой является продолжительное стационарное лечение. При достижении клинического регресса, бактериальной негативности и полной эпидемиологической безопасности для окружающих больного выписывают на амбулаторное лечение. В настоящее время более 70% всех учтённых больных лепрой находятся на амбулаторном лечении.
Эффективность противолепрозного лечения амбулаторных больных регулярно контролируется общим осмотром, а также путём периодической оценки наличия микобактерий в коже: анализом скарификатов, определением бактериоскопического индекса (БИН), гистологического исследования кожных биоптатов. Однако, хронический характер болезни, генерализация специфического процесса, медленный регресс под влиянием химиотерапии могут привести к появлению персистирующих форм М leprae в различных органах и тканях: печени, селезёнке, лимфатических узлах, периферических нервах. В этих случаях выше указанные методы клинико-бактериоскопического контроля становятся неэффективными.
Ранее нами было показано (Дегтярёв О.В., 1998) что в сыворотках крови больных с активной формой лепры регистрируется высокий уровень антител к М.іергае, который отражает степень антигенной нагрузки и может служить хорошим индикатором регресса, устойчивости или прогрессирования инфекции. В связи с этим можно предположить, что специфическое антителообразование индуцируется М.іергае, которые присутствуют во внутренних органах и тканях.
Под нашим наблюдением находились 240 больных. Из них 193-м пациентам на основании клинико-лабораторных исследований был поставлен диагноз - лепрамотозный (LL), а 47 - погранично-лепрамотозный тип лепры.
Все 240 больных проживают (или проживали при жизни) на территории Астраханской эндемичной зоны и получают (или получали при жизни) амбулаторное лечение в НИИ по изучению лепры в течение последних 5-20 лет. При выписке на амбулаторное лечение они находились в состоянии клинического регресса и были бактериоскопически негативны
Дважды в год перед назначением очередного курса специфической терапии эти больные посешали амбулаторию института, где каждому из них проводили клинический осмотр и лабораторные исследования, которые состояли из анализа скарификатов, определения БИН и серологического контроля за уровнем антител к M.leprae в сыворотке крови.
На момент формирования группы 155 пациентов из 240 были серопозитивными, 85 - серонегативными. У серонегативных больных уровень антител в сыворотке крови к Dis - BSA, УЗД M.lufii, УЗД M.leprae и УЗД M.avium не превышал фоновых значений за весь период нашего наблюдения. Больные серопозитивной группы, находясь на амбулаторном лечении, получали монотерапию препаратами сульфонового ряда: дапсоном и солюсульфоном. Больные серонегативной группы - курсами моно- и комбинированную специфическую химиотерапию.
Больные указанных групп отличались по характеру течения и осложнениям лепрозного процесса (табл. 1).
Так, у серопозитивных больных рецидивы наблюдались несколько чаще, чем у серонегативных пациентов, и составляли 19,4% и 15,3% соответственно. В обеих группах около 30% человек имели полиневриты, находящиеся вне обострения. Среди серопозитивных пациентов выявлена высокая степень лепрозных осложнений, которая была представлена специфическими полиневритами, осложнёнными трофическими язвами и остеомиелитом, в стадии обострения или подострого течения (62%), специфическими поражениями органов зрения (1,9%) и внутренних органов (0,65%). У серонегативных больных лепрозные осложнения в стадии обострения составили лишь 2,5% (рис.2).
Для изучения спектра антительного ответа нами были использованы антигены: в ИФА DiS - BSA, УЗД М-Іергае, УЗД M.lufti, в ВИЭФ - УЗД МЛергае, УЗД M.avium Набор данных антигенов был применен для получения более полной и целостной картины состояния лепрозного процесса.
DiS-BSA - синтетический препарат - представляет собой специфический антиген, т.к. имеет уникальную структуру концевой углеводной детерминанты, присущую только МЛергае.
УЗД МЛергае - нативная многокомпонентная антигенная система, способная к поликлональной активации В-клеток. В связи с технологическими особенностями её получения (выделения и очистки) теряет некоторые специфические свойства и, несмотря на то, что является потенциальным маркёром присутствия МЛергае в организме, не может дать исчерпывающих сведений.
Учитывая данные обстоятельства, мы применили УЗД М.avium и УЗД MJufii.
УЗД M.avium является одним из перекрестно реагирующих антигенов с МЛергае. Имеет электрофоретическую подвижность а2-глобулинов, что даёт возможность обнаружить антитела к нему в сыворотках крови больных лепрой во встречном иммуноэлектрофорезе (ВИЭФ) (Лазовская А.Л. с соавт., 1997).
УЗД M.Iufu - также перекрёстно реагирующий антиген, полученный из материала, выращенного на искусственных питательных средах. Имеет ряд свойств, характерных для МЛергае: сульфоночувствительность, способность вызывать в эксперименте лепроподобный патологический процесс, наличие ДОФА - оксндазной активности, присутствие специфических для МЛергае антигенных детерминант и др (Юшин М.Ю. с соавт., 1994; 1995;1998; Саламатина О. С. с соавт., 1998; Portaels F., 1980).
Для определения фоновых показателей оптической плотности уровня антител и определения критерия серопозитивности нами было обследовано 800 здоровых доноров, не имевших контакта с больными лепрой (табл.2).
В ВИЭФ критерием серопозитивности для УЗД МЛергае и УЗД M.avium служило наличие или отсутствие реакции в системе - +/-.
Полученные результаты показали, что суммарный уровень серопозитивности у каждого из 155 больных серопозитивной группы составил 68 ± 11,2 %. В сравнении с клинически активными больными, взятыми нами в качестве положительного контроля (25 человек), эта группа амбулаторных больных была гетерогенной по спектру антительного ответа: на УЗД Mleprae высокий антительный ответ наблюдался у 36%, на УЗД M.lufu - у 40%, УЗД М. avium - у 35% больных, на специфический антиген DiS - BSA - у 48% пациентов (рис.3).
Интервалы колебаний и средние показателей ОП уровня антител на использованные антигены у больных серопозитивной группы представлены в таблице 3.
Содержание лактоферрина и ферритина у больных лепрой при бактериальной персистенции и их клиническое и прогностическое значение
Из всех физиологически активных микроэлементов, способных влиять на исход взаимодействия макро- и микроорганизма, наиболее важную роль играет железо. Это связано с тем, что большинство бактерий являются феррумзависи-мыми и для их роста и повышения вирулентности абсолютно необходим этот элемент. Однако, несмотря на то, что связанного железа в плазме крови, грудном молоке и других биологических жидкостях, для роста микробов более чем достаточно, количество в них несвязанных ионов железа, доступных для усвоения их микроорганизмами, в несколько тысяч раз меньше необходимого для их нормального роста.
Лактоферрин (ЛФ) - железосвязывающий протеид с молекулярной массой 83000 Д, обнаружен во всех биологических жидкостях организма В настоящее время достоверно известно о бактерицидной и бактериостатической роли ЛФ, обусловленной способностью этого белка связывать ионы железа, необходимые для жизнедеятельности микробной клетки и (или) способностью присоединяться к клеточной мембране, блокируя, таким образом, ее" транспортные функции (AmnoldR. et al., 1977; Masson P. L. et al.,1966). Кроме того, ЛФ принимает участие в регуляции гуморальных и клеточных иммуногенологнческих реакций, в противовоспалительных процессах, воздействует на систему комплемента, регулирует гранулоцитопоэз (Broxmewer Н.Е. et al., 1980; Duncan R.L. et al, 1981}
Ферритин (ФР) - сложный белок, депонирующий железо. Являясь водорастворимым протеином, он играет важную биологическую роль, связывая свободные ионы железа, а затем мобилизуя их для синтеза гемоглобина и железосодержащих энзимов, имеет М. м. 450000 Д, состоит из 24 белковых субъединиц двух типов, которые различаются между собой аминокислотной последовательностью, антигенными детерминантами и изоэлектрическими точками. Известно, что его содержание в сыворотке крови у людей отражает изменение запасов железа в организме (Milman N. et al.,1986; Yinnon A. etal., 1988)
J.M. Grande (1996), N. E. Morrison (1995) утверждают, что для размножения внутри клеток M.leprae жизненно необходимо железо, т.к. они являются внутриклеточными облигатными феррумзависимыми паразитами.
О Parkash и соавт. (1993) отмечают, что антитела к ЛФ коррелируют с БИН. На основании этого можно сделать вывод, что для роста M.leprae в организме хозяина необходимо наличие свободного железа.
Следовательно, исход конфликта между инвазирующим микроорганизмом и защитными механизмами хозяина зависит от концентрации железа и его метаболизма в организме хозяина.
Учитывая выше изложенное, мы поставили перед собой задачу исследовать содержание лактоферрина и ферритина в сыворотках крови больных лепроматозным типом лепры в стадии регресса заболевания и установить коррелятивные связи между количеством железосодержащих белков в сыворотках крови больных, характером течения инфекционного процесса, персистенцией микобактерий лепры и возможностью возникновения рецидива.
Нами в ИФА были исследованы в динамике сыворотки крови от 240 больных лепроматозным типом лепры, находящихся на амбулаторном лечении, и 25 больных (контрольная группа) с активной формой лепры. Из 240 человек 155 пациентов по антительному ответу на специфические и перекрестно реагирующие антигены были серопозитивными, 85 - серонегативными. Для сравнения использовали также данные, полученные от здоровых доноров (100 чел.) и больных с другими инфекционными заболеваниями (200 чел.). Полученные результаты представлены в таблице 20.
Больных лепрой в активной стадии, в исследованной нами группе, как правило, в начале заболевания при наличии активных проявлений специфического процесса по сравнению со здоровыми донорами отличал высокий уровень ЛФ (р 0,001), который проявлял себя как типичный белок острой фазы. По мере стихания клинических проявлений, его уровень стабилизировался и был сопоставим с концентрацией ЛФ здоровых доноров
Для этой группы характерны показатели больной П., 1954 года рождения История болезни №3849.
Поступила в клинику НИИ по изучению лепры 1907 94 года. Первые признаки заболевания появились в 1992 году.
При поступлении; в области левого глаза имеется бляшка овальной формы красного цвета, напряженная, с блестящей поверхностью, с чёткими границами, отёчная. На кожных покровах верхней трети ягодицы, в области поясницы отмечается очаговая инфильтрация с нарушением чувствительности.
БИН=0. Гистологическое исследование: активно формирующийся инфильтрат погранично-лепроматозной структуры с большим количеством гомогенных зернистых форм М leprae.
Больной назначено комбинированное лечение.
Во время стационарного лечения специфический процесс у пациентки протекал без признаков реактивных состояний. После проведённого лечения высыпания на коже регрессировали.
БИН=0. Гистологическое исследование: атрофия эпидермиса, инфильтрат не характерной структуры без М leprae.
Как видно из табл. 21, у больной П. в крови выявлялся стабильно невысокий уровень антител. Концентрация ЛФ в начале заболевания была высокой.
По мере стихания клинических проявлений специфического процесса уровень ЛФ стабилизировался и приближался к величине у здоровых доноров.
Полученные нами результаты подтверждают мнение ряда исследователей (Сухарев А.Е. с соавт., 1990; Бородихина СВ., 1998, Юркина Э.А, с соавт., 1998; Parkash О et al., 1993) о том, что отклонение концентрации такого белка остой фазы как ЛФ в крови человека от нормальных величин коррелирует с бактериальной нагрузкой и отражает изменения в функционировании иммунной системы, и, следовательно, может иметь диагностическое и прогностическое значение при различных заболеваниях.
Нами в группе активных больных выявлено несколько пациентов, которые, на наш взгляд, заслуживают особого внимания. Состояние таких больных в рамках нашего исследования наглядно демонстрируют больной К. и больной А..
Больной К.,1935 года рождения. История болезни №3863 (см. гл.6).
Анализ динамики спектра антител и уровня ЛФ больного К (табл.22) свидетельствует, что у пациента наряду с высокой серопозитивностью, положительным БИН, активными проявлениями специфического процесса выявляется очень низкий уровень ЛФ, сопоставимый с таковым у серопозитивных больных амбулаторной группы. Данный факт, с нашей точки зрения, может свидетельствовать о наличие в организме больного персистирующих форм M.leprae.
Больной А., 1967 года рождения. История болезни №3859.
Поступил в НИИ по изучению лепры 5.01.97 года
При поступлении: лепрозный процесс носил распространенный характер с поражением кожи, слизистых оболочек и нервов.
БИН=0,83+. Гистологическое исследование: инфильтраты лепроматозной структуры с большим количеством М. leprae.
Госпитализирован в клинику с диагнозом: лепроматознын тип лепры. Специфический полиневрит.
Получал комбинированное лечение. Специфический процесс у больного отличался нестабильным течением, сопровождался обострением по типу ле-прозно узловатой эритемы (ЛУЭ) (табл.23).
У больного А выявлена стабильная серопозитивность и низкий уровень ЛФ, что коррелирует с нестабильным течением специфического процесса и его активацией.
Parkash О.М и соавт (1993) установили для больных с ЛУЭ характерна высокая концентрация сывороточного ЛФ за счет ряда факторов, таких как стимуляция полиморфноядерных нейтрофилов посредством фагоцитоза М. leprae и иммунных комплексов, а также за счёт их распада и разрыва во время некроза повреждённой ткани.
Мы считаем, что низкая концентрация данного белка у описанных нами активных больных, представляющих исключение, свидетельствует о наличии в их организме персистирующих микобактерий лепры, которые используют ЛФ для своей жизнедеятельности.
При исследовании сыворотки крови у больных серопозитивной и сероне-гативной групп, находящихся в стадии клинического регресса, выявлена существенная разница в уровне ЛФ. Его концентрация в каждой из этих групп также достоверно отличалась от таковой у активных больных.
Обращает на себя внимание значительное снижение уровня лактоферрина в сыворотках крови у пациентов серопозитивной группы по сравнению с другими больных (р 0,001): из 155 пациентов, обследованных нами, только 13% показали концентрацию ЛФ по величине сопоставимую с таковой у серонегатив-ных или активных больных.
Следует также отметить, что, как правило, величина ЛФ у больных всех групп коррелировала со средним уровнем антител. Однако, при индивидуальном рассмотрении в динамике, эти показатели не всегда абсолютно идеально соответствовали друг другу.
В качестве типичного примера, характеризующего связь между уровнем ЛФ и антительным ответом у больных серопозитивной группы приводим наблюдения за больной М.
Больная М, 1936 года рождения. История болезни № 2556.
3 аг - макроглобулин
Альфа?- макроглобулин (а2 - МГ) - транспортный белок, составляющий около 97% от общего количества макроглобулинов у здоровых лиц. Обладая специфичностью в отношении протеолитических ферментов, СІ2 - МГ выполняет защитные функции, инактивируя большинство протеаз, оказывающих деструктивное воздействие на тканевые структуры различных органов Кроме того он обладает протективными свойствами против тех классов микроорганизмов, которые оказывают свое воздействие на хозяина, выделяя протеолитические ферменты, а также влияет на способность макрофагов и нейтрофилов мигрировать в очаге воспаления (Литвинов В.И., Мороз A.M., 2001; Джумакулиева О.Х., 1992; Адамбеков Д.А. с соавт., 1996).
Под нашим наблюдением находилось 258 больных многобактериальной формой лепры. Из них 240 в стадии регресса заболевания (155 серопозитивных по уровню антительного ответа и 85 серонегативных) и 18 человек в активной стадии болезни. Для сравнения мы исследовали образцы крови от 118 больных с острыми инфекционными заболеваниями и с кожной патологией. За норму для жителей Астраханского региона были приняты результаты, полученные Трубниковым ГА. (1997) при исследовании здоровых доноров. Норма составила 320-640 мг/л.
В результате проведённых исследований выявлено значительное увеличение продукции а,-МГ у больных с активным лепрозным процессом Данный белок у этих больных в 2,5-5 раз превышал таковой у здоровых лиц и больных лепрой в стадии регресса заболевания, серонегативных по антительному ответу, а также в 1,5 раза - у больных с другой патологией (табл. 42).
Примером, характеризующим больных активной группы, может служить больная Б., 1950 года рождения История болезни №3848 (см. гл. 6)
Как видно из таблицы 43, у больной Б на фоне высокого антителообразо-вания и выраженной клинической картины выявлены высокие показатели ov МГ. Это свидетельствует о более благоприятном течении лепрозного процесса, заключающемся в более быстрой элиминации возбудителя и доброкачественном течении осложнений.
Среди активных пациентов, как мы отмечали в предыдущих главах, выявлено четверо больных, которые отличались от подавляющего большинства представителей этой группы по изучаемым показателям. Характерным представителем этих пациентов является больной А., история болезни №3859 (см. гл. 7).
Как видно из таблицы 44, у больного А. выявлен низкий уровень щ -МГ, коррелирующий с клиническими проявлениями лепрозного процесса и его осложнениями.
В данном случае значительное снижение уровня а2-МГ отражает несостоятельность клеточного звена иммунитета больного за счет дополнительной бактериальной нагрузки на организм: возможно имеющей место персистенции М leprae.
У серопозитивных больных амбулаторной группы концентрация о.2 - МГ была также значительно выше, чем у серонегативных больных и здоровых доноров и была сопоставима с уровнем этого белка у лиц с другой патологией (табл.41).
В качестве примера приводим наблюдения за больной Д., 1945 года рождения. История болезни № 3090.
Поступила в НИИ по изучению лепры 3.12 62 года.
Первые признаки заболевания наблюдались летом I960 года, когда на нижних конечностях и на лице появились высыпания.
При поступлении кожа диффузно инфильтрирована, отмечаются лепромы, величиной с вишнёвую косточку, плотной консистенции, синюшного цвета Специфические изменения со стороны лорорганов.
БИН =11,5+. Гистологическое исследование: лепроматозный инфильтрат с наличием большого количества М.leprae.
Госпитализирована в клинику с диагнозом: лепроматозный тип лепры. Получала лечение в виде монотерапии.
В процессе лечения высыпания на коже регрессировали- БИН =0.
Гистологическое исследование: инфильтраты со структурой не характерной для лепры. М.іергае не обнаружены.
5.12.86 года больная выписана на амбулаторное лечение. Находясь на амбулаторном лечении периодически госпитализировалась с обострением хронического специфического полиневрита
Результаты исследований представлены в таблице 45
Как видно из таблицы, у больной Д на фоне интермитирующего антите-лообразования в сыворотке крови определяются достоверно высокие концентрации 0.2-МГ. Клиническая картина у данной пациентки характеризовалась вяло протекающим хроническим специфическим полиневритом.
Среди серопозитивных лиц амбулаторной группы выявлена небольшая популяция пациентов с низкой продукцией Оі - МГ. Для таких больных было типичным наличие длительных, тяжело протекающих, осложнений специфического процесса, таких как у больного Э., 1932 года рождеїшя. История болезни № 3273.
Поступил в клинику НИИ по изучению лепры 21.02.1966 года
Первые признаки заболевания у больного появились весной 1965 года: отёки на лице и руках.
При поступлении: активный распространённый процесс с наличием диффузной инфильтрации всего кожного покрова.
В процессе лечения высыпания на коже регрессировали. 12.07.70 года больной был выписан на амбулаторное лечение.
БИН=0 Гистологическое исследование: инфильтрат лепроматозной структуры с наличием небольшого количества зернистых форм М.leprae Фиброз ткани дермы.
Находясь на амбулаторном лечении, больной получал монотерапию. Госпитализировался по поводу рецидива заболевания (26 12 1973 года) и обострений специфического полиневрита, трофических язв (1982-1997г г), хронического остеомиелита костей правой стопы (1998г.).
Как видно из наших наблюдений, у представленного (табл.46) больного на фоне высоких титров антител и низкого уровня а2 МГ в сыворотке крови имеют место тяжелые осложнения лепрозного процесса, обусловленные, на наш взгляд, наличием персистирующих микобактерий лепры.
У большинства пациентов серонегативной группы уровень исследуемого белка не отличался от нормы (табл.42). Для этих больных были характерны не тяжелые осложнения специфического процесса, протекавшие доброкачественно и недлительный период времени
Исключением являлись некоторые больные этой группы, у которых периодически повышался суммарный уровень антител и концентрация а.2 - МГ, коррелирующие с обострениями осложнений лепрозного процесса
Типичным представителем таких больных является больная Ф., 1939 года рождения. История болезни № 3288 (табл.47).
Поступила в клинику НИИ по изучению лепры 15.06 1966 года. Считает себя больной с декабря 1964г., когда заметила на бёдрах желтовато-коричневые пятна.
При поступлении: на лице, туловище, конечностях отмечаются очаговые инфильтраты, на предплечьях и голенях имеется диффузная, глубокая инфильтрация
БИН=0 Гистологическое исследование: лепроматозный инфильтрат с наличием гомогенных М.leprae.
Госпитализирована в клинику НИИ с диагнозом лепроматозный тип лепры Назначена специфическая монотерапия.
В процессе лечения высыпания на коже регрессировали. БИН=0.
Гистологическое исследование: лепроматозный инфильтрат регрессирующего характера с наличием небольшого количества разрушающихся лепро-матозных клеток и зернистых М.leprae.
26.06.1973 года больная выписана на амбулаторное лечение. Назначена монотерапия. Находясь на амбулаторном лечении, из-за наличия хронического гепатита принимала специфические препараты нерегулярно. В 1976 году была госпитализирована в клинику по поводу рецидива заболевания С 1982 года периодически находилась на лечении по поводу хронического специфического полиневрита.
Похожие диссертации на Новые диагностические алгоритмы активности лепрозного процесса и мониторинг эффективности лечения больных лепрой в амбулаторных условиях
