Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Роль Mycoplasma genitalium в развитии уретритов человека 16
1.1.1. Биология М. genitalium 19
1.1.2. Патогенез микоплазменной инфекции для человека 26
1.2. Методы лабораторной диагностики микоплазменной инфекции 27
1.2.1. Культуральный метод 28
1.2.2. Метод клеточных культур 29
1.2.3. Серологические методы 29
1.2.4. Иммуннол огический метод 30
1.2.5.Методы амплификации нуклеиновых кислот 30
1.2.5.1 .Метод полимеразной цепной реакции 30
1.2.5.2. ПНР в «режиме реального времени» 31
1.2.5.3. НАСБА «в реальном времени» 32
1.2.5.4. Метод транскрипционно-опосредованной амплификации 33
1.2.5.5. Сравнительный анализ методов лабораторной диагностики микоплазменной инфекции 33
1.3. Клинические проявления уретрита, ассоциированного с Mycoplasma genitalium, у мужчин 35
1.4. Особенности современной терапии уретритов, ассоциированных с М. genitalium
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Клиническая характеристика пациентов и методы клинико-инструментального обследования 46
2.2. Лабораторные методы исследования
2.2.1. Микроскопическое исследование материала 49
2.2.2. Молекулярно-биологическое исследование материала 50
2.2.2.1 Метод ПЦР «в реальном времени»
2.2.2.2. Метод количественной оценки содержания M.genitalium 53
2.2.2.3. Метод НАСБА «в реальном времени» 54
2.2.2.4. Использование метода ПЦР для определения мутаций в гене 23 S рРНК , ассоциированных с устойчивостью к джозамицину 58
2.2.2.5. Метод прямого секвенирования 5 8
2.3.Этиотропная терапия пациентов с уретритом 59
2.4. Статистическая обработка полученных результатов 61
ГЛАВА 3. Клинико - эпидемиологическая характеристика обследованных пациентов
3.1. Социально - демографическая характеристика обследованных пациентов 63
3.2. Характеристика сексуального поведения обследованных пациентов 67
3.3. Клинические особенности течения уретритов, вызванных Mycoplasma genitalium, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, у мужчин 71
3.4. Клинические и лабораторные маркеры уретритов у мужчин, вызванных Mycoplasma genitalium, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae
ГЛАВА 4. Уретрит у мужчин, вызванный mycoplasma genitalium: клинические особенности и оптимизация методов диагностики
4.1. Результаты клинических исследований особенностей течения уретрита, вызванного Mycoplasma genitalium, у мужчин 82
4.2. Сравнение диагностической значимости методов ПЦР «в реальном времени» и НАСБА «в реальном времени», используемых для выявления Mycoplasma genitalium у пациентов с уретритами 84
4.2.1. Идентификация Mycoplasma genitalium в клиническом материале (уретральный мазок или первой порции мочи) методами ПЦР«в реальном времени», НАСБА «в реальном времени» 85
4.2.2. Сравнение аналитической чувствительности методов ПЦР «в реальном времени» и НАСБА «в реальном времени» при идентификации
Mycoplasma genitalium в клиническом материале 91
ГЛАВА 5. Терапия уретрита, вызванного mycoplasma genitalium, у мужчин: мониторинг клинико лабораторных показателей .
5.1. Динамика клинических проявлений и лабораторных показателей при лечении джозамицином уретрита, ассоциированного с Mycoplasma genitalium, у мужчин 94
5.2. Изучение скорости элиминации Mycoplasma genitalium в зависимости от бактериальной нагрузки при терапии джозамицином уретрита мужчин, вызванного микоплазменной инфекцией
ГЛАВА 6. Мониторинг бактериальной нагрузки при эрадикации mycoplasma genitalium и формирование резистентности у пациентов с негонококковыми уретритами при терапии джозамицином
6.1. Определение взаимосвязи формирования антибиотической резистентности и бактериальной нагрузки М. genitalium, установленной до лечения джозамицином 104
6.2. Использование метода ПЦР для определения в 23S рРНК гене мутаций, которые коррелируют с устойчивостью Mycoplasma genitalium к макролидам 106
6.3. Анализ последовательности 23S-p РНК, выделенной из джоз-амицин-резистентных изолятов Mycoplasma
genitalium 108
ГЛАВА 7. Обсуждение результатов 113
Заключение 130
Выводы 132
Список литературы
- Патогенез микоплазменной инфекции для человека
- Молекулярно-биологическое исследование материала
- Клинические особенности течения уретритов, вызванных Mycoplasma genitalium, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, у мужчин
- Сравнение диагностической значимости методов ПЦР «в реальном времени» и НАСБА «в реальном времени», используемых для выявления Mycoplasma genitalium у пациентов с уретритами
Введение к работе
Актуальность проблемы
Во всем мире негонококковые уретриты (НГУ) относятся к числу значимых заболеваний мочеполовых путей, т.к. представляют серьезную проблему для здравоохранения и создают угрозу репродуктивному здоровью населения (А.А. Кубанова с соавт., 1999; В.А. Аковбян, 2007). Ежегодно в мире регистрируется до 50 млн. случаев НГУ в год, а в России - около 350000 случаев НГУ (В.А. Аковбян, 2007; В.И. Кисина с соавтор., 2008). Медико-социальная значимость данной проблемы определяется тем, что НГУ наиболее часто встречаются у молодых людей: преимущественно в возрасте 20 - 24 лет (В.В. Чеботарев, 1999; В.А. Молочков с соавт., 2006; J. Paavonen, W. Eggert-Kruse, 1999; . Krieger, . Riley, 2004; . Miller, 2006; P. J. Horner, 2007). Большое значение в развитии НГУ имеют облигатные патогены: Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Herpes Simplex Virus типов 1 и 2, Mycoplasma genitalium, а также условно-патогенная микрофлора (например, Ureaplasma urealyticum, U. parvum, Gardnerella vaginalis). Приблизительно в половине случаев этиология НГУ неизвестна (R.L. Cook et al., 2005; C.S. Bradshaw et al., 2006; T. Yoshida et al., 2007; E. Bjrnelius, 2010). Уретриты, вызванные M. genitalium, стоят на втором месте по частоте встречаемости среди НГУ после хламидийной инфекции (M. Shahmanesh et al., 2009), но реальный уровень заболеваемости остается неизвестным из-за недостаточной диагностики заболеваний. Имеется большое количество сообщений зарубежных исследователей о том, что уретрит, вызванный M. genitalium, может протекать в острой, персистирующей или рецидивирующей форме (P.J. Horner et al., 2001; J.S. Jensen, 2004; C.S. Bradshaw et al., 2006; Shahmanesh et al., 2009; E. Bjrnelius, 2010), однако в России подобные исследования не проводились.
В настоящее время M. genitalium - это один из мало изученных возбудителей уретрита у мужчин. Именно поэтому вопросы диагностики и этиотропной терапии с учетом чувствительности M. genitalium к антибактериальным препаратам являются актуальной проблемой современной медицины. Бактериологические (микроскопические, культуральные) и серологические методы не позволяют выявлять M.genitalium: в связи с чрезвычайно малыми размерами патоген не обнаруживается при световой микроскопии и относится к разряду труднокультивируемых, а кроме того микоплазмы обладают низкими иммуногенными свойствами (J.S. Jensen, 2004; M.R.H. Nusbaum et al., 2004; . Bally., N. 2006; W.H. Gbelin et al., 2006).
В настоящее время как во всем мире, так и в нашей стране, в клинико-лабораторной практике для диагностики M. genitalium используют методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) и обладающие специфичностью, высокой аналитической чувствительностью, унифицированным протоколом лабораторного анализа, объективностью интерпретации полученных результатов и быстротой выполнения исследования (J.S. Jensen, 2006). Наибольшее развитие получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленный на выявление ДНК возбудителя. Однако чувствительность различных ПЦР тестов зависит от выбранной тест-системы и типа клинического материала, что соответственно отражается на результатах по выявлению патогена (А.М. Савичева, 2010). Так, в работе А.С. Беньковича (2009) показано, что частота выявления уретритов, вызванных M. genitalium, от общего количества уретритов среди мужчин Ленинградского областного кожно-венерологического диспансера составила 9,6%. При этом доля уретритов, вызванных M. genitalium, составила 10,2% от общего числа НГУ, а доля от всех НГНХУ – 11,9%. При этом в зарубежных исследованиях указывают, что доля случаев уретритов, вызванных M. genitalium,у мужчин составляет от 18 до 50% (например: Х. Хандсфилд, 2004; W. Heying, 2001). Это может быть связано с тем, что при исследовании первой порции мочи А.С. Бенькович (2009) использовал только один метод МАНК – ПЦР. Известно, что тесты ПЦР обладают крайне низкой чувствительностью для данного типа клинического материала. Таким образом, на настоящий момент актуален поиск высокоэффективных методов выявления M. genitalium в неинвазивном клиническом материале (моча – первая порция), т.к. данный клинический материал содержит большее количество ингибиторов ПЦР, чем уретральный мазок.
Использование технологии флуоресцентно-меченных зондов позволило разработать тесты МАНК нового поколения с детекцией и анализом результатов в режиме реального времени («ПЦР в реальном времени»), а также принципиально новые методы, которые направлены на выявление РНК возбудителя. К методам амплификации РНК относится метод транскрипционный амплификации – «НАСБА в реальном времени». Мишенью для НАСБА служат молекулы РНК рибосом патогена, что дает целый ряд преимуществ перед любым методом ПЦР. Во-первых, количество рибосом в одной клетке M. genitalium превышает 1000, в то время как даже многокопийные участки ДНК, используемые в качестве мишени для ПЦР, единичны. Тем самым с помощью «НАСБА в реальном времени» можно выявлять возбудителей и в тех случаях, когда их количество слишком мало и недостаточно для выявления методом ПЦР. Во-вторых, в то время как ДНК – достаточно стабильный материал и обнаружение ДНК еще не означает наличие жизнеспособных микроорганизмов, РНК – является крайне нестабильным материалом и достаточно быстро деградирует при гибели и разрушении клеток микроорганизмов. Это дает возможность не только правильно судить о наличии текущей инфекции, но и более точно и надежно оценивать результаты проведенного лечения.
Актуальность настоящего исследования обусловлена необходимостью объективной оценки эффективности использования «НАСБА в реальном времени», направленного на идентификацию M. genitalium в рамках алгоритма ведения пациентов с НГУ. В нашей стране диагностика уретрита современными высоко - технологичными методами не регламентирована нормативными документами, и поэтому требуется тщательное изучение всех аспектов их применения для диагностики микроорганизма и интеграции полученных результатов в алгоритм клинико-лабораторного обследования (Г.А. Дмитриев, 2004; А.М. Савичева, 2007).
Этиотропное лечение уретритов, вызванных M. genitalium, основано на применении антибактериальных препаратов различных групп. В настоящее время опубликованы единичные работы, посвященные антибиотикотерапии уретритов, вызванных M.genitalium, т.к. количество штаммов M. genitalium, доступных для изучения их чувствительности к антибиотикам ограничено. При этом полученные данные весьма противоречивы, что подчеркивает необходимость дальнейшего изучения этого микроорганизма и поиска эффективных вариантов терапии. Препаратом выбора при инфицировании M.genitalium традиционно считается азитромицин, который назначается 5-дневным курсом. Однако, участившиеся случаи клинических неудач при применении азитромицина диктуют необходимость поиска альтернативных режимов терапии (C.S. Bradshaw et al., 2006).
Целью настоящего исследования явилось изучение клинических проявлений, оптимизация методов диагностики и совершенствование лечения уретритов, вызванных Mycoplasma genitalium, у мужчин.
-
Изучить этиологическую структуру уретритов у мужчин и определить частоту выявляемости уретрита, вызванного Mycoplasma genitalium.
-
Изучить клинические особенности течения уретрита, вызванного Mycoplasma genitalium, у мужчин, включая хронические формы заболевания.
-
Определить диагностическое значение методов молекулярно-генетического исследования («НАСБА в реальном времени» и «ПЦР в реальном времени») для идентификации M. genitalium.
-
Сравнить диагностическое значение различных видов клинического материала (уретральный соскоб или первая порция мочи), используемого для идентификации M. genitalium и оценить возможность использования неинвазивной методики забора материала.
-
Разработать алгоритм ведения мужчин с уретритом, вызванным Mycoplasma genitalium, и изучить его эффективность с учетом динамики клинических проявлений и элиминации нуклеиновых кислот Mycoplasma genitalium в процессе терапии.
Научная новизна работы.
На основании комплексного клинико-лабораторного обследования пациентов с уретритами определена их этиологическая структура и частота выявления M. genitalium. Определены особенности клинического течения поражений урогенитального тракта, ассоциированных с M. genitalium. При этом показано, что уретрит, вызванный M. genitalium, протекает преимущественно в острой форме, однако не имеет специфических клинических признаков и проявлений.
Проведена сравнительная оценка идентификации M. genitalium
в двух видах клинического материала (уретральный соскоб и первая порция мочи) при использовании двумя принципиально разными методами амплификации нуклеиновых кислот: ПЦР в реальном времени и NASBA в реально времени.
Впервые оценена возможность использования независимых молекулярно-биологических методов диагностики «НАСБА в реальном времени» и «ПЦР в реальном времени», позволяющих достоверно установить наличие инфекции по двум типам генетического материала ДНК и РНК при асимптомном и хроническом течении заболевания.
Разработан патогенетически-обоснованный, высокоэффективный метод контроля эффективности терапии НГУ, обусловленного M. genitalium, с учетом клинических проявлений и характера течения инфекционного процесса.
Практическая значимость.
Показана высокая диагностическая эффективность NASBA при детекции инфекционного агента в клиническом материале, полученном неинвазивным путем (моча), у пациентов с уретритом, вызванным M. genitalium.
Применение разработанного алгоритма клинико-лабораторного обследования пациентов и терапии уретрита, вызванного M. genitalium, позволяет достоверно выявлять инфекционный агент, в том числе в случаях мало - и асимптомного течения заболевания, своевременно назначать адекватную терапию на ранних стадиях патологического процесса и контролировать эффективность лечения.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Этиологическая структура НГУ у мужчин репродуктивного возраста на современном этапе характеризуется сочетанием патогенных или условно-патогенных возбудителей, среди которых особое значение отводится M. genitalium. НГУ, вызванные M. genitalium, преимущественно протекают в форме острого уретрита, однако не имеют специфических клинических признаков и проявлений.
-
Диагностическая чувствительность методов «НАСБА в реальном времени» составляет 100% и не зависит от вида клинического материала, взятого для исследования (моча или отделяемое уретры), что особенно важно при асимптомных и хронических случаях заболевания.
-
Применение комплексного клинико-лабораторного обследования больных позволяет повысить точность дифференциальной диагностики НГУ. С учетом отсутствия патогномоничных признаков инфекции и с целью выбора наиболее эффективной схемы лечения это позволяет значительно снизить вероятность получения дискордантных результатов, в короткие сроки выявить возбудителя.
-
Использование двух молекулярно-биологические методов позволяет достоверно установить наличие инфекции и оценить эффективность проведенной терапии.
Внедрение в практику
Результаты исследований и разработанные рекомендации внедрены в практическую работу а ФГУ «ГНЦ Дерматовенерологии Росмедтехнологий». Разработанный алгоритм ведения мужчин больных уретритом с применением методов амплификации нуклеиновых кислот для идентификации этиологического агента рекомендован для использования в практической работе дерматовенерологов, урологов, репродуктологов, т.к. данный алгоритм позволяет оптимизировать диагностику НГУ, вызванного M.genitalium, у мужчин.
Апробация работы
Основные результаты работы изложены и обсуждены на Х Всероссийской конференции дерматовенерологов (Москва, 2006); Шестой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней – 2007» (Москва, 2007); The 23-rd IUSTI-Europe Conference on sexually transmitted infections and HIV/AIDS, October 11-14, 2007; 11-ый Всемирный конгресс IUSTI (Кейптаун, ЮАР, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них в рецензируемых научных изданиях – 2.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав, содержащих результаты соответствующих исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 таблицами и 17 рисунками. Библиографический указатель включает 209 источника, из которых 54 отечественных и 155 зарубежных авторов.
Патогенез микоплазменной инфекции для человека
Микроорганизмы, впоследствии названные микоплазмами, были открыты Nocard и Roux в 1898г. Микоплазмы имеют широкое распространение природе и обнаружены у млекопитающих, птиц, рыб, насекомых и растений (С.Н. Борхсениус и др., 2000).
На настоящий момент установлено, что человек является естественным хозяином 16 видов микоплазм (О.И. Немченко, Е.В. Уварова, 2007; В.Н. Прилепская с соавт., 2007; A.M. Савичева с соавт., 2008; A. Uuskula, Р.К. Kohl, 2002), из них наиболее значимы М. fermentans , M.genitalium, М. hominis и М. pneumoniae (В.Е.Ноников, М.Г. Воробьева, 2006; М.А. Гомберг с соавтор., 2007). К возбудителям уретритов относят М. genitalium, М. hominis и U. urealyticum. Кроме этих видов микоплазм из образцов, взятых из УГТ, также были выделены М. fermentans М. penetrans М. pirum, М. pneumoniae, М. primatum и М. spermatophilum (М.А. Гомберг с соавтор., 2007)
Согласно современной таксономии М. genitalium относится к царству Prokaryotae, отделу Tenericutes, классу Mollicutes, порядку Mycoplasmatales, семейству Mycoplasmataceae. Семейство Mycoplasmataceae состоит из 2 родов: Mycoplasma, включающего около 107 видов, и Ureaplasma - 3 вида (К-Е. Johansson, В. Pettersson, 2002).
Микоплазмы - эубактерии, у которых отсутствует клеточная стенка, характеризуются полиморфизмом микроструктур и многообразием форм репродукции. Это одни из самых мельчайших из известных самореплицирующихся организмов (D.R. Brown et al, 2007; S.L. Iverson-Cabral et al., 2006). Диаметр их клетки не превышает 300 нм. Для рода Mycoplasma характерно то, что его представители являются факультативными анаэробами, для роста им необходимы холестерол или иные стеролы, оптимальная температура роста составляет 37С или выше, они не способны к гидролизу мочевины (D.R. Brown et ah, 2007); размер генома составляет от 580 kb (М genitalium) до 1350 kb (М. mycoides); фермент NADH-дегидрогеназа локализован в цитоплазме (ICSB Subcommittee on the taxonomy of Mollicutes, 1995; CM. Fraser et al, 1995). У микоплазм аденин-тиамин богатый геном (Н. F. Svenstrup et aL, 2002; J.S. Jensen, 2006), триптофан кодируется UGA стоп-кодоном (S.L. Iverson-Cabral et al., 2006; D.R. Brown et al, 2007). На основании сравнительного анализа рибосомальных генов 16S рРНК, род Mycoplasma был разделен на 3 кластера: hominis, pneumoniae и fermentans (К-Е. Johansson, В. Pettersson, 2002; D.R. Brown et al, 2007).
В 1980 году из оделяемого уретры мужчин с негонококковым нехламидийным уретритом был выделен новый микроорганизм, который по своим морфологическим, биохимическим и молекулярно-генетическим характеристикам был отнесен к классу Mollicutes, и получил название М. genitalium (D. Taylor-Robinson, 2002). Этот вид относится к кластеру pneumoniae, в которую так же входят М. pneumoniae, М. alvi, М. gallisepticum, М. imitans, М. pirum, М. testudinis, М. amphoriforme (Jensen J.S., 2006). В 1995 году был полностью секвинирован геном М. genitalium (580 kb), а в 1996 - геном М. pneumoniae (816 kb). Показано, что все кодируемые гены М. genitalium имеют своих аналогов в большем геноме М. pneumoniae (СМ. Fraser et al, 1995; J.S. Jensen, 2006). Геном (470 генов) M. genitalium является самым малым среди микоплазм и среди всех известных свободноживущих организмов. Предполагают, что геном М. genitalium содержит минимальный набор генов, необходимых для независимой жизни (Jensen J.S., 2006). М. genitalium является исключительно патогеном человека. В связи с трудностью культивирования и медленным ростом микроорганизма на питательных средах, биологические свойства Мgenitalium исследованы хуже, чем у других генитальных микоплазм.
Вопрос о месте предпочтительной колонизации M.genitalium оставался дискутабельным долгое время. Это связано с тем, что М. genitalium выделяли из образцов взятых как из урогенитального, так ректального (D. Taylor-Robinson et al, 2003) и респираторного (СМ. Bebear et al, 2000; L.B. Duffy et al, 2000; D. Taylor-Robinson, 2002) трактов. К настоящему времени, установлено, что М. genitalium предпочтительно колонизирует УГТ (J.S. Jensen, 2006). Так же доказано, что М. genitalium передается половым путем (Е. Bjornelius et al., 2000; F.E. Keane et al., 2000; L.E. Manhart et al., 2007). Однако, как и в случае с М. pneumoniae, ясно, что возможно распространение М. genitalium с кровью. Так, при экспериментальном моделировании уретрита на животных моделях зарегистрировано выделение жизнеспособных микоплазм из крови самцов шимпанзе (в 2 из 5 случаев) после инокуляции их чистой культурой М. genitalium (Tully J.G, 1986). В медицинской литературе описан случай M.genitalium - ассоцированного энцефалита у 5 летней девочки (D. Taylor-Robinson, 2002).
М. genitalium принадлежит к подвижным видам бактерий, имеет колбообразную форму, используя удлиненную терминальную структуру для обеспечения скользящего движения, внедрение в слои слизи, покрывающие эпителиальные клетки, прикрепления к поверхности клеток и проникновение в них. Средняя скорость её движения составляет 0,1 мкм/с (Jensen J.S., 2006). Способность М. genitalium к прикреплению к поверхности эукариотических клеток определяется рецепторами, которые содержат нейраминовую кислоту, что обусловливает выраженное цитопатогенное действие и формирование клеточного воспалительного ответа (О.В. Решетников, А.А. Хрянин, 2008). Высокие адгезивные свойства М. genitalium подтверждаются способностью прикрепляться не только к эпителиальным клеткам, но даже к стеклу и пластику (О.В. Решетников, А.А. Хрянин, 2008). За прикрепление к поверхностям клеток организма-хозяина отвечают белки-адгезины, главным из которых у M.genitalium является белок MgPa (A.M. Савичева с соавтр., 2008а; J.S. Jensen, 2006). Так же в связывании M.genitalium с детерминантой хозяина принимают участие два высоко иммуногенных белка Р140 и Р110 (кодируемых генами mgl91 и mgl92, соответственно). Важно отметить, что эти белки, по-видимому, подвержены антигенным вариациям и их отсутствие значительно редуцирует колонизацию клеток организма-хозяина (М.Л. Stein, J.B. Baseman, 2006).
Размножается M.genitalium делением, часто неравномерным. Из-за отсутствия клеточной стенки, деление цитоплазмы у микоплазм значительно отстает от репликации генома, что приводит формированию многоядерных форм. Жизненный цикл и метаболизм микоплазм связан с клетками организма-хозяина. Микоплазмы истощают энергетические резервы клеток-хозяина, нарушают синтез белков, нуклеиновых кислот, привносят новую генетическую информацию. Микоплазмы искажают структуру активной поверхности клетки, что может приводить к нарушениям процессов всасывания, метаболизма, экскреции и обмена биологическими сигналами с другими клетками и системами организма (А.С. Бенькович с совтор., 2008; О.И.Немченко, ЕВ. Уварова, 2007).
Молекулярно-биологическое исследование материала
Настоящее комплексное клинико-лабораторное обследование 320 мужчин в возрасте от 18 до 66 лет, обратившихся в консультативно- диагностический центр ГНЦДК, было проведено в период с декабря 2006г по январь 2008г. Пациенты обращались с субъективными признаками воспалительного процесса в области уретры. Пациенты условно были разделены на две группы: основная (п= 271 или 84,7%), и контрольная (п= 49 или 15,3%). Критерии включения в основная группу: наличие жалоб харакерных для уретрита (выделения из мочеиспускательного канала, зуд и т.п.) и/или наличие ПМЯЛ ( 4 в поле зрения) при микроскопии уретрального мазка. В контрольную группу были включены из 49 мужчины, не имеющих клинических симптомов урогенитальных заболеваний, обратившихся с целью профилактического обследования. Пациентов контрольной группы по субъективным и объективным критериям можно рассматривать как здоровых лиц. Однако здесь необходимо подчеркнуть некоторую условность такой характеристики, поскольку лица из указанной группы посещали врача с мотивировкой «провериться после сомнительных сексуальных контактов», что свидетельствовало о принадлежности данных лиц к группе риска и не исключало наличие у них инфекции в инкубационном периоде. Все пациенты были обследованы на С.trachomatis, N. gonorrhoeae, T.vaginalis, HSV1/2 и т.д., включая M.genitalium.
Из основной группы в группу исследования были выделены 51 пациент, инфицированных М. genitalium. Критерии включения: мужчины в возрасте 18 лет и старше; отсутствие системной и/или местной антибактериальной терапии в течение предшествующих 2-х месяцев; пациенты с положительными результатами ПНР на М. genitalium; отсутствие гонококковой, хламидийной, трихомонадной и герпетической инфекций; отсутствие клинических признаков осложнений урогенитальной инфекции: уретропростатита, везикулита, орхоэпидидимита; отсутствие указаний на непереносимость джозамицина и других макролидов в анамнезе; отсутствие тяжелых нарушений функции печени с признаками печеночной недостаточности.
Все обследования проводили амбулаторно.
Все мужчины получили информацию общего характера о проводящемся исследовании. После получения письменного информированного согласия пациента на проведение обследования и лечения оформлялась индивидуальная тематическая карта больного (см. Приложение І), в которой указывали необходимую демографическую информацию, анамнез заболевания, клинические симптомы в динамике, результаты лабораторного и инструментального обследования, физикальные данные, регистрироваться клиническая, микробиологическая эффективность джозамицина и т.д. На основании данных, полученных при обследовании 320 мужчин, была создана база данных. При предварительном клиническом и лабораторном обследовании у всех пациентов, составивших исследуемую группу, было исключено наличие клинически выраженных соматических заболеваний.
При обследовании пациентов проводили анализ урологического и сексуального анамнеза, оценку состояния органов мочеполовой системы, наличие и характер выделений из уретры.
При физикальном обследовании определяли состояние органов мочеполовой системы, наличие и характер уретральных выделений.
Инструментальное исследование мочеиспускательного канала проводилось с помощью сухого уретроскопа УР-ВС-1 для оценки состояния слизистой оболочки переднего отдела уретры и определения состояния семенного бугорка и слизистой оболочки простатического отдела уретры (цвет, гладкость, блеск, прозрачность, складчатость, характер сосудистого рисунка). Уретроскопия использовалась для исключения инфравезикальной обструкции (стриктура, опухоль, инородное тело), что могло явиться причиной уретрита с длительным течением. При обследовании мужчин производили взятие биологического материала для бактериологического, бактериоскопического и молекулярно-биологического исследований.
Для лабораторных исследований от каждого пациента был получен следующий клинический материал: 1. Уретральный мазок для микроскопического исследования. 2. Уретральный мазок для молекулярно-биологического исследования 3. Образец первой порции свободно выпущенной мочи (ППМ) для молекулярно-биологического исследования
Всем пациентам основной и контрольной групп проводили лабораторное обследование, включавшее микроскопическое исследование клинического материала уретры и идентификацию возбудителей инфекций урогенитального тракта. До получения материала из мочеиспускательного канала пациентам рекомендовалась задержка мочеиспускания в течение 4-5 часов. Головку полового члена в области наружного отверстия мочеиспускательного канала обрабатывали стерильным ватным тампоном, смоченным 0,9%-ным раствором NaCl. Затем получали клинический материал с передне-боковых стенок уретры, на глубине 2-3 см. От каждого пациента одновременно было получено по 4 образца клинического материала уретры с помощью отдельных одноразовых стерильных урогенитальных зондов (Россия).
От каждого пациента была получена ППМ в объеме 15-25 мл, с интервалом от предыдущего мочеиспускания более двух часов. Для молекулярно-биологического исследования использовали 1 мл мочи, которую центрифугировали, удаляли супернатант, а осадок обрабатывали с целью получения очищенного препарата ДНК. Обработка осадка мочи и образцов мазков из уретры проводилась с использованием набора «ДНК-сорб-АМ» производства ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. ПЦР-исследование проводилось с использованием набора реагентов «Амплисенс Mycoplasma genitalium-FRT» с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени на приборе RotorGene 3000 (Corbett Research, Австралия).
Клинические особенности течения уретритов, вызванных Mycoplasma genitalium, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, у мужчин
При исследовании 98 образцов уретральных мазков и 98 образцов ППМ от 46 пациентов, инфицированных микоплазмой, методом ПЦР «в реальном времени», выявлялся высокий уровень сигнала М. genitalium. Данные представлены в таблице 18.
Сравнительный анализ клинического материала (уретральный мазок и ППМ) методом ПЦР «в реальном времени» при определении М. genitalium (lg ГЭ/мл) Клинический материал Число образцов Среднее значение Минимальное значение Максимальное значение Стандартное отклонение уретральный мазок 98 3,36 0,8 7,2 2,18 ППМ 98 3,30 0,7 6,2 1,70
В контрольной группе во всех пробах (уретральный мазок и ППМ) от 49 здоровых человек был получен валидный сигнал внутреннего контроля, а сигнал ДНК М. genitalium не выявлялся. Во всех 98 образцах уретральных мазков и ППМ от пациентов с симптомами и без симптомов уретрита, ассоцированного с микоплазмой, выявлялся высокий уровень сигнала М. genitalium: в уретральном мазоке значения С находились в пределах от 0,81g до 7,2 lg , что соответствует значениям от 0,8 х 10 до 2x10 ГЭ/мл, в ППМ - от 0,71g до 6,21g , что соответствует значениям от 0,7x10 до 2x106 ГЭ/мл. Данные таблицы 18 показывают, что уровень сигнала М. genitalium в образцах уретральном мазоке выше, чем в ППМ. Это различие в 3,361g и 3,301g между исследуемыми клиническими материалами высоко статистически достоверно (г=0,6727 при р 0,05).
Для выявления зависимости между измерениями концентраций М. genitalium в клиническом материале разного типа (уретральный мазок и ППМ) методом ПЦР «в реальном времени» был проведен регрессионный анализ и построена регрессионная модель (Рисунок 11).
Корреляция результатов измерения концентраций М. genitalium методом ПЦР «в реальном времени» в клиническом материале
По оси абсцисс (х): концентрация М. genitalium (в логарифмах копий ДНК/мл), измеренная в образцах первой порции мочи (ППМ); по оси ординат (у): концентрация М. genitalium (в логарифмах копий ДНК/мл), измеренная в образцах - уретральном мазоке (УрМ) Данная модель описана уравнением у = 0,5252х + 1,5357, R =0,45, где R2 - коэффициент детерминации,
Полученное уравнение линейной регрессии показывает, что выявлена высокая степень совпадения (р 0,05) при тестировании образцов разного типа клинического материала (уретральный мазок и ППМ) методом ПЦР «в реальном времени».
При исследовании 98 образцов уретральных мазков и 98 образцов ППМ от 48 пациентов, инфицированных микоплазмой, методом НАСБА «в реальном времени», выявлялся высокий уровень сигнала М. genitalium. Результаты представлены в таблице 19.
В этом эксперименте, так же как и в предыдущем в контрольной группе во всех пробах (уретральный мазок и ППМ) от 49 здоровых человек не выявлялся сигнал 16S-pPHK М. genitalium. Во всех 98 образцах уретральных мазков и 98 образцах ППМ от пациентов, как с симптомами, так и без симптомов уретрита, ассоциированного с микоплазмой, выявлялся высокий уровень сигнала М. genitalium. В образцах уретральных мазков значения уровеня сигнала М. genitalium находились в пределах от 1,3 до 7,8 UE, , в ППМ - от 1,2 до 7,4 UE, Данные таблицы 19 показывают, что уровень сигнала М. genitalium в образцах уретральных мазков выше, чем в ППМ. Это различие в 4,13 UE и 4,04UE между исследуемыми клиническими материалами высоко статистически достоверно (г=0,5658 при р 0,05).
Для выявления зависимости между измерениями концентраций М. genitalium в клиническом материале разного типа (уретральный мазок и ППМ) методом НАСБА «в реальном времени» так же был проведен регрессионный анализ и построена регрессионная модель
По оси абсцисс (х): уровень сигнала М. genitalium (в условных единицах флюоресценции, UE), измеренный в образцах - уретральный мазок (УрМ); по оси ординат (у): уровень сигнала М. genitalium (в условных единицах флюоресценции, UE), измеренный в образцах первой порции мочи (ППМ) Полученное уравнение линейной регрессии показывает, что выявлена высокая степень совпадения при тестировании образцов разного типа клинического материала (уретральный мазок и ППМ) методом НАСБА «в реальном времени».
Совпадение результатов оцениваемых методов (ПЦР «в реальном времени» и НАСБА «в реальном времени») было получено для 208 (91,6%) из 227 образцов уретральных мазков и для 219 (98,2%) из 227 образцов ППМ. Анализируя 227 образцов уретральных мазков, собранных за период проведения терапии, методами ПЦР «в реальном времени» и НАСБА «в реальном времени» выявлено, что ПЦР-позитивны были 77 (34,8%) из 227 образцов, а НАСБА-позитивны - 96 (38,8%). Т.о. 19 (8,4%) из 227 образцов различались по позитивности — все эти образцы были НАСБА-позитивны, но ПЦР-негативны. При анализе 227 образцов ППМ, собранных за период проведения терапии, методами ПЦР «в реальном времени» и НАСБА «в реальном времени» выявлено, что ПЦР-позитивны были 86 (37,9%) из 227 образцов, а НАСБА-позитивны - 94 (41,4%). Т.о. по позитивности различались 8 (3,5%) из 227 образцов: НАСБА-позитивные образцы были ПЦР-негативны. Необходимо отметить, что во время проведения исследования клинического материала (уретральные мазки и ППМ) не было зарегистрировано ни одного образца НАСБА-негативного, но ПЦР-позитивного. Следует обратить внимание и на то, что количество положительных результатов как методом НАСБА, так и методом ПЦР было больше при тестировании ППМ, чем при тестировании мазков из уретры. Исходя из полученных данных статистически достоверно, что моча, как материал для исследования на M.genitalium, более информативна, чем уретральный мазок независимо от выбранного МАНК, что подтверждает ранее полученные данные (J.S.Jensen, 2004)
Различия между методами ПЦР «в реальном времени» и НАСБА «в реальном времени» были статистически значимыми при анализе клинического материала как ППМ (г=0,6727 при р 0,05), так и уретрального мазка (г=0,5658 при р 0,05), что подтверждает более высокую аналитическую чувствительность метода «НАСБА в реальном времени» вне зависимости от типа клинического материала и уровня бактериальной нагрузки. Так же при анализе полученных данных, установлено, что результаты анализов чаще совпадают (вне зависимости от метода МАНК) при использовании образцов ППМ. Это подтверждает, что для диагностических мероприятий предпочтительным типом клинического материала являются образцы ППМ
Сравнение диагностической значимости методов ПЦР «в реальном времени» и НАСБА «в реальном времени», используемых для выявления Mycoplasma genitalium у пациентов с уретритами
В работе A. Khryanin (2003) было установлено, что частота выявления М. genitalium у мужчин, явившихся в кабинет анонимного обследования и лечения ИППП, определена в 37% случаев. При этом моноинфекция М. genitalium составила 47%, а в виде различных бактериальных и вирусных микст-инфекций —53%. В литературном обзоре, опубликованном S. Ishihara с коллегами (2004), приведены данные о распространенности М. genitalium. Микоплазма была выявлена в 13-42%) у мужчин с НГУ и в 18-46% у мужчин с НГНХУ. Частота выявления М. genitalium у мужчин без симптомов уретрита составила от 0 до 9%. D. Taylor-Robinson с соавторами (2009) протестировали образцы из уретры методом ПЦР на наличие N. gonorrhoeae, С. trachomatis и М. genitalium у 172 мужчин. М. genitalium диагностирована у 12 (21%) из 57 пациентов с хламидийной инфекцией. Моноинфекция М. genitalium была определена у 25 (28,1%) из 89 мужчин, не инфицированных ни гонококками, ни хламидиями, причём у 24 (96%) из 25 пациентов имелись симптомы и признаки уретрита. Из 31 пациента, у которых не было симптомов или признаков уретрита, только 3 мужчины (9,7%) были инфицированы М. genitalium (таблица 30).
В настоящем исследовании М. genitalium у мужчин с уретритом диагностировалась реже, нежели С trachomatis. Частота выявления С. trachomatis и М. genitalium от общего числа пациентов с НГУ составила 45,5% и 21,1%, соответственно. Полученные нами результаты отражают показатели встречаемости С. trachomatis и М. genitalium в этиологической структуре НГУ, полученные в других исследованиях (таблица 30). В частности, в Европейских стандартах диагностики и лечения ИППП (2006) - доля НГУ хламидийной этиологии описана в пределах 30-50%, а для M.genitalium - в среднем около 20%.
Распределение пациентов, инфицированных этими двумя патогенами, по возрасту значительно не отличались, что указывает на то, что эти пациенты могут иметь общий поведенческий и биологический профиль. Достоверно значима связь между М genitalium и мужским уретритом, независимо от выявления С. trachomatis, обнаруженная в настоящем исследовании, явно указывает на этиологическую роль микоплазмы в развитии уретрита. Ведь только у 2 (3,9%) из 51 пациентов инфицированных М. genitalium наблюдали микст-инфекцию с С. trachomatis. Данные настоящего исследования подтверждают результаты ряда других работ, касающихся связи между М. genitalium и НГУ в общем, и НГНХУ, в частности (например, Jensen J.S., 2004). Согласно данным международной литературы, показано, что многие из инфицированных М genitalium не имеют симптомов, что облегчает распространение инфекции (P. Horner, 2007; S. Yokoi et al., 2007; Shahmanesh M. et al., 2009). Однако в настоящем исследовании выявлено, что у двух третей пациентов уретриты, вызванные С trachomatis или М. genitalium, имели симптоматику (61% и 64%, соответственно).
У наших пациентов M.genitalium была диагностирована преимущественно в виде моно-инфекции (82,4%) или реже в сочетании (17,6%) с другими вирусами, бактериями или простейшими.
Таким образом, данные полученные в настоящей работе свидетельствуют в пользу достаточно высокой распространённости НГУ, ассоциированного с М genitalium, среди мужчин.
При изучении клинико-лабораторных признаков, а так же особенности течения уретрита у мужчин, ассоциированного с М. genitalium, установлено, что микоплазменное инфицирование в 93,9% случаев приводит к развитию воспалительного процесса. У мужчин воспалительный процесс мочеиспускательного канала, вызванный М genitalium, сопровождается выраженной клинической картиной уретрита: уретральные выделения - 89,1% случаев (преимущественно слизисто-гнойного характера); дизурия -34,7%; гиперемия уретры - 58,7%; зуд/жжение в области наружного отверстия мочеиспускательного канала - 82,6%.
Клиническое значение M.genitalium свидетельствует о необходимости включения в алгоритм обследования пациентов с уретритом методов диагностики, направленных на выявление указанного возбудителя. Учитывая, что M.genitalium относится к труднокультивируемым микроорганизмам, то в настоящее время единственно возможными технологиями для идентификации M.genitalium являются методы МАНК (например, ПЦР «в реальном времени» или НАСБА «в реальном времени»).
В настоящей работе впервые в практике лабораторного исследования на М. genitalium предложена достаточно строгая микробиологическая оценка идентификации возбудителя и эффективности лечения - исследовали оба типа нуклеиновых кислот патогена и два типа клинического материала. Обнаружение какого-либо из маркеров М. genitalium (ДНК или рРНК) в уретральном мазке или моче мы рассматривали в пользу продолжающейся инфекции.
Целесообразность такого подхода основана на следующем. Оба метода ПЦР «в реальном времени» и НАСБА «в реальном времени» обладают самой высокой аналитической чувствительностью и высокой специфичностью при диагностике ряда инфекций, а для выявления М. genitalium - это единственные из методов на данный момент времени. В то же время НАСБА «в реальном времени» имеет существенное от ПЦР «в реальном времени» отличие - в качестве мишени используется одноцепочечные молекулы рРНК. В этом случае, исходное количество мишеней для НАСБА «в реальном времени» в сотни и тысячи раз больше, чем для ПЦР «в реальном времени», что позволяет рассчитывать на более высокую аналитическую чувствительность. В рамках разработки и лабораторных испытаний нами было установлено, что с помощью НАСБА «в реальном времени» можно было обнаружить М. genitalium как минимум в 10 раз меньшей концентрации, чем методом ПЦР «в реальном времени». В настоящем исследовании именно методом НАСБА «в реальном времени» удалось подтвердить наличие возбудителя у одного из пациентов с рецидивом инфекции, у которого плотность обсемененности М. genitalium была столь низка, что не выявлялась методом ПЦР «в реальном времени».
Вторым важным обстоятельством является то, что РЬЖ, как хорошо известно, в отличие от ДНК являются менее стабильными молекулами и значительно быстрее разрушаются при клеточной гибели, в том числе под действием антибактериальных препаратов. Это дает основание рассматривать положительные результаты НАСБА «в реальном времени», как более точный маркер наличия инфекции, по крайней мере, при лечении. В работе S.A. Моггё с коллегами (1998) было показано, что при лечении пациентов с С. trachomatis доксициклином ДНК возбудителя обнаруживалась на две недели позже после элиминации РНК. Результаты настоящего исследования несколько противоречат данным литературы (S.A. Моггё et al, 1998) - у определенной части пациентов, находящиеся на 3-й и 8 днях лечения рРНК все еще определялась тогда, когда результаты на ДНК были отрицательными. Однако в нашем случае общая скорость элиминации нуклеиновых кислот возбудителя была высока, и уже на ранних сроках после лечения возбудитель не определялся, что может отражать высокий антибактериальный эффект джозамицина. Таким образом, показано, что метод НАСБА «в реальном времени» достоверно значимо предпочтителен для идентификации микоплазмы у пациентов с уретритом, ассоциированного с М. genitalium (р 0;05).
