Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1. Реакция растений на засоление и физиологическая природа солеустойчивости 6
1.2. Действие солей на культивируемые клетки растений 13
1.3. Получение мутантов соматических клеток растенийи их роль в изучении физиологических процессов 20
2. Экспериментальная часть 35
2.1. Материал и методы 35
2.1.1. Методика получения клеточной культуры 35
2.1.2. Клонирование суспензии клеток Ж. sylvestris 37
2.1.3. Обработка суспензии клеток Ж, sylvestris Н-нитрозо-Н-метилмочевиной (НММ) 38
2.1.4. Подготовка пробы для анализа содержания ионов 38
2.1.5. Подготовка пробы для анализа аминокислот 38
2.2. Результаты и обсуждение 39
2.2.1. Получение культуры клеток Ж, sylvestris 39
2.2.2. Характеристика роста культуры клеток в стандартных условиях 42
2.2.3. Действие некоторых стрессовых факторов на рост культуры Ж. sylvestris 47
2.2.3.1. Рост культуры в присутствии ЖаС1 47
2.2.3.2. Рост культуры N. sylvestris в присутствии этионина 52 стр.
2.2.3.3. Рост культуры клеток К. sylvestris в присутствии путресцина 56
2.2.4. Получение индуцированных мутагеном соле-устойчивых клеточных линий N. sylvestris 52
2.2.4.1. Действие нитрозометилмочевины на клетки N. sylvestris 52
2.2.4.2. Получение индуцированных НММ NaCl -резистентных клонов N. sylvestris 54
2.2.4.3. Получение индуцированных НММ этионин-резистентных клонов Ж. sylvestris 57
2.2.4.4. Выделение клонов с двойной устойчивостью 70
2.2.5. Физиологическая характеристика клонов 71
2.2.5.1. Критерии для характеристики клонов 71
2.2.5.2. Дикий штамм 76
2.2.5.3. Клон нуВд-1 80
2.2.5.4. Клон НгЕ&-2 83
2.2.5.5. Клон NrEs-3 87
2.2.5.6. Клон КЕ-1 90
2.2.5.7. Клон NrEr-2 92
2.2.5.8. Клон игЕг-3 95
2.2.5.9. Клон іу: -4- 99
2.2.5.10. Клон КаЕр-1 Ю2
Заключение 106
Выводы 115
Литература 117
Приложение
- Реакция растений на засоление и физиологическая природа солеустойчивости
- Получение мутантов соматических клеток растенийи их роль в изучении физиологических процессов
- Характеристика роста культуры клеток в стандартных условиях
- Получение индуцированных НММ этионин-резистентных клонов Ж. sylvestris
Введение к работе
Повышенное содержание солей в почве - широко распространенный фактор, неблагоприятный для возделывания сельскохозяйственных растений. Огромные территории нашей планеты (25 % поверхности суши) в той или иной степени засолены (Строгонов, 1973). У нас в стране засоление почв наносит серьезный урон сельскохозяйственному производству в ряде районов интенсивного земледелия. Содержащееся в почве избыточное количество солей угнетает рост и значительно снижает урожаи практически всех сельскохозяйственных культур.
Одним из наиболее перспективных путей освоения засоленных почв, наряду с проведением мелиоративных мероприятий, является возделывание на них солеустойчивых сортов полезных растений.
Получение форм с таким комплексным признаком, как солеустой-чивость, возможно общепринятыми методами (мутагенез и гибридизация), однако в последние годы большое значение приобретают новые приемы и методы, которые облегчают и ускоряют селекцию экономически важных культур.
Одним из таких приемов является селекция на клеточном уровне. Популяция культивируемых клеток генетически и физиологически гетерогенна и экспериментально полученное на ее основе растение может унаследовать возникшие генетические изменения.
Выращивание таких клеток ведется в специально оборудованных камерах фитотрона, где строго контролируются и дозируются состав питательной среды, температура, влажность, освещенность. Миллион посаженных на питательную среду растений может располагаться в небольшой оранжерее или камере фитотрона. Размножение культивируемых клеток, а также выращивание in vitro растений идет непреры-
вно и независимо от времени года, что существенно сокращает время получения форм с желаемым признаком. Кроме того, культура клеток и тканей растений позволяет изучить физиологические основы повреждающего действия солей и на основе этого моделировать условия, обеспечивающие защиту организма от солевого стресса и, используя эти знания, вести направленную селекцию резистентных к солям клеточных линий. Метод изолированных клеток и тканей дает возможность сочетать спонтанный и индуцированный мутагенез с широким спектром селективных систем и обеспечить выделение генетических вариантов с последующей регенерацией целого растения.
В связи с этим задача данной работы заключается в получении солеустойчивых мутантов методом клеточной селекции и их характеристике. Для решения поставленной задачи необходимо иметь модельную биологическую систему, селективные системы, отработать условия получения спонтанных и индуцированных солеустойчивых клеточных линий, доказать их генетическую природу, установить возможные причины полученной резистентности.
Реакция растений на засоление и физиологическая природа солеустойчивости
Непригодность засоленных почв для сельскохозяйственного производства связана с избытком водорастворимых солей в верхнем кор-необитаемом слое почвы. Состав легкорастворимых солей в почвенном растворе и твердой фазе почвы разнообразен. Эти соли в болыпинст + 2+ ве случаев представляют собой комбинацию катионов Fa , Mg и
Са и анионов CI , SO % CCU .Засоление почвы каким-либо одним видом соли в природных условиях не встречается. Обычно преобладающим компонентом засоленных почв является сульфат и хлорид натрия (в различных сочетаниях), в определенных районах также карбонат натрия.
Многочисленными исследованиями показано, что отрицательное действие засоления обусловлено как высоким осмотическим давлением почвенного раствора, так и специфической токсичностью высоких концентраций засоляющих ионов (Строгонов, 1973; Maas, Hoffman, 1977). Возможность использования засоленных земель для выращивания культурных растений определяется концентрацией солей в корне-обитаемом почвенном горизонте.
При концентрации засоляющих ионов 0,1-0,2% от суммарного количества солей могут произрастать все культурные растения; такие почвы принято считать незасоленными (Ковда и др., I960). Сельскохозяйственное освоение почв, у которых содержание солей достигает 0,3-0,5%, требует подбора солеустойчивых культур и применения специальной агротехники, так как большинство возделываемых культур при такой степени засоления дает низкий урожай.
Максимальная степень засоления свойственна солончакам (кон 7 центрация солей достигает 2,0 %), Такие почвы в сельском хозяйстве не используются, растительность на них скудна и ограничивается дикими видами.
Однако концентрация ионов в почве не является константным показателем. Максимальное их количество в ризосфере обнаруживается в летний период, когда высокий уровень инсоляции резко усиливает испарение почвенной влаги, и вымытые почвенной влагой ионы ионы поднимаются в корнеобитаемые горизонты почвы. Осенью обильно выпадающие дожди вновь снижают их концентрацию.
С биологической точки зрения под солеустойчивостью вида или сорта следует понимать тот предел засоления, при котором растения еще способны завершать полностью онтогенетический цикл и сформировать всхожие семена (Строгонов, 1962). Однако величина солеустойчивости относительна и зависит от условий, при которых формируется урожай (температура, влажность, механический состав почвы, содержание органических веществ, подвижность ионов). Большая группа дикорастущих видов - галофиты - способна произрастать в условиях почвенного засоления, а многие из них для своего развития требуют повышенной солености среды. Избыток солей стимулирует их рост по сравнению с пресным фоном.
Изучение физиологических свойств галофитов показало, что приспособление к росту на солях достигается различными путями. "Истинные" галофиты накапливают огромное количество засоляющих ионов в клетке (до 7 % сухого веса), при этом сохраняя нормальное ее функционирование (Келлер, I940;Waisel, 1972; Soxifi, Wallace,1982). Накопленные ионы могут быть локализованы в тканях и частях клетки, не несущих большой метаболической нагрузки. В условиях сильного засоления хлористым натрием у некоторых видов ионы CI" локализуются между верхним эпидермисом и клеточными стенками палисадной, столбчатой паренхимы, а также вдоль оболочек в клетках столбчатой паренхимы. Значительное количество хлора накапливается также в межклетниках губчатой паренхимы, вакуолях,наружной оболочки хло-ропластов. Внутри хлоропластов ионы С Г" заключены чаще всего в липидные капли (Лапина, 1981). Здесь они выполняют осмотические функции без значительного воздействия на ферментативную активность. Это позволяет галофитам развивать высокую сосущую силу и обеспечивать себя водой, таким образом преодолевая относительно легко осмотическое давление почвенного раствора. G другой стороны, пониженная интенсивность транспирации свидетельствует об экономном расходовании водных запасов. К этой группе относятся различные солянки - сведа, солерос, петросимония. Метаболизм гало-фитов этой группы также отличается рядом приспособительных свойств к росту в условиях засоления. Предполагается связывание засоляющих ионов белками и органическими кислотами, что ведет к понижению количества свободных ионов в клетке и уменьшению их токсического действия (Генкель, 1954; Строгонов, 1962). Отмечена также меньшая скорость поглощения засоляющих ионов клетками корней га-лофитов (Абдыев, Касумов, 1981).
Вторая группа галофитов не накапливает поглощаемые корнями соли, а выделяет их через особые морфологические образования (гланды) из тканей листьев и стеблей. Некоторые растения-галофиты характеризуются высокой интенсивностью фотосинтеза, что создает высокую концентрацию клеточного сока и дает возможность ликвидировать одну из сторон стрессового воздействия засоления - осмотическую. Такой механизм свойственен кермику, тамариксу, франкении, лоху.
Получение мутантов соматических клеток растенийи их роль в изучении физиологических процессов
Популяция культивируемых In vitro клеток неоднородна по своему морфологическому, физиологическому и генетическому состоянию (Шамина, 1979; Фролова, 1981). Это служит основой для селекции на клеточном уровне.
Для отбора клеток, имеющих определенные изменения, применяются методы, используемые в селекции микроорганизмов и соматических клеток животных - клонирование в селективных условиях. При клонировании необходимо иметь популяцию, состоящую из одиночных клеток или мелких агрегатов, что&і получить потомство индивидуальной клетки.
Направленная селекция, например, на устойчивость к химическим факторам среды - засолению, рН, ионам металлов и антиметаболитам, требует использования селективных сред. Принцип составления таких селективных сред относительно прост и сводится к введению в питательную среду селективного агента в дозе, подавляющей рост большинства клеток и нетоксичной для утойчивых вариантов.
Селекция высших растений на клеточном уровне имеет ряд трудностей: 1) клеточная популяция в разной степени агрегирована (Липский, 1981). Эта трудность снимается, если используются изолированные протопласты, поэтому они широко применяются в клеточной селекции (Maliga, 1978, 1980). Однако не всегда удается получить способные к делению протопласты, поэтому необходимо использование специальных методов получения одноклеточной суспензии - фракционирование (Каранова и др., 1975), мацерация (Долгих, Шамина, 1978; By Дык Куанг, Шамина, 1983) клеточной суспензии, контроль состава куль-туральной среды (природа углеводов, сочетание фитогормонов, гид-ролизата і казеина и др.} (Nevins et al, 1967; Waller, Nevins, 1973). 2) по сравнению с микроорганизмами и животными клетками, для клеток высших растений специфична более низкая эффективность образования колоний (0,3-1,0%) (Каранова, Шамина, 1977). Существуют разные методы ее повышения (питающий слой, "культура-нянька"), но они нереальны при использовании селективных систем, так как применимы только в том случае, если ткань-нянька также устойчива к стрессовому воздействию. В связи с этим обычно клетки высевают с большой плотностью (чаще всего более 10 клеток/мл), что дает при снижении относительной эффективности образования колоний увеличение абсолютного числа резистентных колоний. Измененные клетки в популяции возникают довольно редко, частота их появления в зависимости от признака находится в пределах 10 -10 (Maliga, 1976). К тому же выделение таких редких изменений затрудняет низкая эффективность клонирования. Поэтому для увеличения исходной гетерогенности, а также для увеличения спектра изменений используют мутагены. Это могут быть химические вещества (ЭМС, НЭМ, НММ, НГ и т.д.), а также различные излучения (рентгеновские лучи, гамма-лучи, ультрафиолетовые лучи ).Анализ работ по индуцированному мутагенезу в культуре клеток растений показал разную эффективность использования мутагенных факторов (табл. I). Последействие мутагенов двояко - летальное и мутагенное. Летальность может быть, с одной стороны, результатом летальных мутаций, а с другой - результатом прямого токсического действия мутагена на клеточные компоненты. Из таблицы видно, что при одном летальном исходе в одной селективной системе разные мутагены дают разную величину индукции, причем., чем выше выживаемость, тем выше эффективность мутагенного действия. Появление нового фенотипа в культивируемой клетке может быть результатом физиологической адаптации, эпигенетических (регулято-рных) изменений или мутационных изменений, связанных с постоянным наследственным изменением в первичной структуре ДНК. Важно выделить генетические варианты, так как физиологические изменения не наследуются при регенерации и половом размножении. В ряде обзоров обсуждаются основные критерии и приемы для определения природы вновь возникающих изменений в соматических клетках (Maliga, 1976, 1978, 980; Bourgin, 1978). Наиболее убедительным тестом является получение фертильных растений-регенерантов из измененных клеточных линий и их генетический анализ. Фенотипичеекие изменения, связанные с мутациями, передаются половым путем в потомстве регенерированных растений. Мутации в ядерных ДНК должны приводить к менделевскому расщеплению после скрещивания, в то время как мутации в хлоропластах или митохондриальных ДНК должны иметь наследование по материнскому типу. Однако не всегда существует возможность регенерации целого растения, так как в результате длительного культивирования клеточные линии могут утратить морфогенетические потенции. В этом случае на уровне соматических клеток используются следующие критерии: I) наследуемость (или стабильность) наблюдаемых изменений в ряду клеточных поколений при культивировании в селективных условиях; 2) сохранение признака в отсутствии селективного давления; 3) низкая частота встречаемости измененных клеток; 4) индукция изменений при обработке мутагеном; 5) обнаружение продукта измененного гена; б) обнаружение изменений в структуре ДНК.
Каждый из этих критериев в отдельности служить доказательством генетической природы изменений не может, но их совокупность делает очень вероятным предположение о мутационной природе изменений.
В последнее время работы по выделению мутантов получили широкое распространение. Это связано с практическими и теоретическими задачами. С одной стороны, наличие широкого спектра мутантов у растений позволяет в полной мере использовать засоленные и кислые почвы, получая при этом высокий и полноценный урожай, успешно бороться с засухой и затоплением, холодом и патогенами. С другой стороны, мутантные клеточные линии - это модельная система для изучения многих вопросов физиологии, биохимии и генетики растений.
Одной из таких систем является селекция на клеточном уровне по такому комплексному признаку, как солеустойчивость. К настоящему времени получен ряд резистентных к FaCl клеточных линий (табл. 2).
Характеристика роста культуры клеток в стандартных условиях
Работа проводилась по методике Тимощенко с соавторами (1980). Количественное содержание свободных аминокислот и амидов определялось на анализаторе аминокислот марки AAA-88I (ЧССР) инженером № АН СССР Гордеевой Е.Е.
Введение в культуру новых объектов требует подбора оптимальных условий для дедифференцировки эксплантатов и роста недифференцированной ткани.
Из стерильных растений вычленяли кусочки ткани размером 2x2 мм из стеблей, черешков, тканей листа, участков мезофильной паренхимы и помещали поверхностью среза на агаризованную среду III (приложение I).
Через 3 дня все кусочки ткани увеличились в объёме в 2-3 раза, особенно листовые варианты. Поверхность среза несколько потемнела, но явные некрозы не отмечались. Уже на 10 день почти на всех эксплантатах было отмечено каллусообразование. Довольно часто кроме каллусогенеза наблюдалось образование зачатков корней. Способность к дедифференцировке и пролиферации у молодых растений Б, sylvestrls была очень высока, через 3 недели первичный каллус образовался практически во всех пробирках и гибели эксплантатов не наблюдалось. В течение всего нулевого пассажа не было установлено различий в поведении тканей разного происхождения. Первичные каллусы были очень плотными.
Для получения интенсивно растущей недифференцированной ткани первичный каллус, образованный на эксплантатах, пересаживался на два варианта среды. В качестве стимуляторов роста использовали синтетические аналоги ауксина - НУК и 2,4Д. Каждый первичный каллус был разделен на две части и помещен в пробирку на поверхность среды ІУ и У (приложение I). Анализ роста проводился на 7 и 14 день пассажа (показан в табл. 5). Из таблицы видно, что характер роста зависел от состава среды больше, чем от происхождения каллусной ткани. На среде ІУ наблюдался более интенсивный рост каллусной ткани во всех вариантах и больший органогенез. На поверхности ткани образовалась много мелких стеблевых почек.
На среде У рост происходил сравнительно слабо, а органогенез был ингибирован. Так как ни один вариант не удовлетворял требованию получения интенсивно растущей недифференцированной каллусной ткани, была проведена серия пересадок на среды с разными ауксинами и витаминами ( рис. 2 ).
Так как на среде ІУ интенсивность каллусогенеза была выше, каллусная ткань, полученная на среде У, где органогенез был инпересаживалась на среду ІУ. Мы предполагали, что таким образом можно стимулировать пролиферацию при подавлении вторичной дифференцировки. В результате был выбран вариант с интенсивным ростом без органогенеза - штамм мезофильного происхождения, культивируемый на среде У.
Длительное культивирование и отбор при пересадке наиболее рыхлых кусочков позволили получить культуру ткани, которая была успешно переведена в суспензию. Суспензионная культура обладает преимуществом по сравнению с культивированием на агаризованной среде. Рост в жидкой питательной среде обычно интенсивнее, а цикл выращивания короче. Это дает возможность получить большую биомассу за более короткий период времени. Кроме того, суспензия является хорошим источником одиночных клеток для получения индивидуальных клонов. Суспензированная культура обеспечивает более легкий контакт компонентов питательной среды с каждой клеткой, что является важным условием для выяснения многих вопросов, связанных с транспортом и метаболизмом веществ в клетке, а также при генетических экспериментах.
Для получения суспензии каллусная ткань F. sylvestris мезо-фильного происхождения из УП пассажа была суспендирована в жидкой питательной среде в конических плоскодонных колбах на 500 мл из расчета 5 г ткани на 100 мл среды.
Получение индуцированных НММ этионин-резистентных клонов Ж. sylvestris
Дальнейшее увеличение содержания путресцина в среде было невозможно, так как приводило к образованию комплексов с компонентами питательной среды и выпадению осадка.
Отсутствие токсического эффекта высоких концентраций экзогенного путресцина может быть связано с его недостаточной проникающей способностью или активной метаболизацией его, так как путресцин - очень лабильное соединение, легко образующее комплексы с высокомолекулярными соединениями; он может использоваться как источник азота CBagni et al, 1978), а также активно участвовать в синтезе алкалоидов (i ik, Hartmann, 1979)»
Для установления возможных причин отмеченного действия путресцина на клетки Ж, sylvestris была изучена динамика роста и содержания свободного эндогенного диамина в ткани в течение двух последовательных циклов выращивания в присутствии различных концентраций путресцина (рис. 9 и 10).
Как уже отмечалось, рост клеток в контроле характеризуется типичной S-образной кривой с коротким лаг-периодом и достаточно продолжительным периодом активного роста. Концентрация путресцина 0,06 и 0,18 мг/л повышает интенсивность роста, начиная с первой недели культивирования, и к концу третьей недели рост достигает уровня, который характерен для контроля в конце 4-й недели. В течение всего цикла выращивания доза диамина 0,18 мг/л была наиболее эффективна, и к концу пассажа интенсивность роста на среде с 0,18 мг/л составила 143 % от контроля, а на среде с 0,06 мг/л - 136 %, В присутствии 0,60 мг/л путресцина наблюдается слабо выраженное торможение роста ткани в течение первых трех недель, которое в конце цикла выращивания сменяется небольшой стимуляцией, сохраняющейся при дальнейшем культивировании клеток. Хорошо заметное замедление клеточного роста происходит лишь при содержании 1,80 мг/л диамина в среде, но отставание в росте к концу первого цикла также нивилируется, приближаясь к уровню контроля. Во всех вариантах опыта с внесением в среду путресцина не наблюдается перехода к стадии стационарного роста, а для вариантов с 0,60 и 1,80 мг/л отмечается тенденция к изменению ростовой кривой, связанная по-видимому с адаптацией культуры к повышенной дозе путресцина. Во втором цикле различия в интенсивности роста между вариантами сохраняются.
Как видно из рис 10, исходная ткань (контроль) характеризуется высоким содержанием амина. В течение первых 14 суток выращивания ткани концентрация этого соединения быстро падает, и к концу второй недели путресцин практически не обнаруживается. Однако в последующие две недели содержание его увеличивается, и к концу пассажа достигает исходного уровня.
Такая зависимость может быть обусловлена состоянием процессов роста и метаболизма в клеточной популяции по мере ее культивирования.
В первую неделю происходит подготовка клеток к делению, что сопровождается накоплением энергетических и пластических веществ, необходимых для митотических процессов. По этой причине в.клетке активизируются процессы деградации резервных источников азота, какими являются амины и амиды. Исчезновение путресцина в период активной пролиферации (2-я неделя) возможно связано, кроме активации его распада, с участием свободного диамина в инициации синтеза и последующей стабилизации структуры интенсивно образующихся в этот период биополимеров (Шевякова, 1982).
При концентрации путресцина в среде, которая вызывает 36-процентную стимуляцию роста (0,06 мг/л), динамика содержания амина аналогична описанной в контроле (рис. 10). Однако возрастание содержания эндогенного путресцина начинается раньше, и уже к концу третьей недели выращивания достигает уровня контрольной ткани, а затем следует новая волна его метаболизации. Возможно, стимулирующий эффект этой дозы путресцина обеспечивается способностью ткани метаболизировать экзогенный диамин, используя его прежде всего как доступный источник азота в процессах клеточного роста (Bagmi et al, 1978)«
Внесение в среду культивирования 0,18 мг/л путресцина меняет динамику содержания эндогенного диамина по сравнению с контролем и дозой 0,06 мг/л - количество его уменьшается в течение всего цикла выращивания ткани. Снижение количества эндогенного путресцина в ткани, несмотря на более высокую дозу введенного диамина, свидетельствует о том, что стимулирующий эффект путресцина может быть связан не только с его метаболизацией, но и с использованием самого диамина или его производных, полиаминов, как стабилизаторов и индукторов в процессах синтеза белка и нуклеиновых кислот, на что указывалось выше.
