Содержание к диссертации
Введение
1. Аналитический обзор 10
1.1. Производство продукции «здорового питания» - перспективное на правление 21 века 10
1.1.1. Классификация, роль и значение на рынке добавок к пище 12
1.1.2. Пробиотики - как особая форма добавок к пище 16
1.1.3. Свойства бифидобактерий и лактобактерий и механизм их воздействия на здоровье человека 18
1.2. Аспекты разработки добавок к пище 22
1.2.1. Обоснование требований к подбору состава микрофлоры в пищевых добавках с пробиотическими свойствами 23
1.2.2. Идентификация пробиотических культур с использованием молеку-лярно-генетических характеристик 24
1.2.3. Конструирование питательных сред для развития пробиотических культур микроорганизмов 28
1.2.4. Основы периодического и непрерывного культивирования 33
1.3. Обоснование перспективности выбранного направления, формулиро
вание цели и задач работы 37
2. Организация эксперимента, изучаемые объекты и методы исследований 39
2.1. Организация эксперимента 39
2.2. Объекты исследований 41
2.3. Материалы и питательные среды 41
2.4. Методы исследований 43
2.4.1. Биохимические методы исследований 43
2.4.2. Микробиологические методы исследований 48
2.4.3. Генетические методы исследований 49
2.4.4. Математические методы 54
3. Характеристика микробиологического состава пробиотической добавки 55
3.1. Изучение комплекса свойств и подбор ацидофильных бактерий 55
3.2. Определение способности штаммов Streptococcus salivarius subsp. thermophilus к продуцированию биологически активных веществ 59
3.3. Исследование генетических характеристик стартовых культур микроорганизмов 65
3.4. Исследование взаимодействия бактерий, входящих в микробиальный состав добавки 71
4. Разработка технологии пищевой добавки 77
4.1. Исследование влияния состава синтетических питательных сред на накопление биомассы бифидобактерий 77
4.2. Исследование развития пробиотических культур в условиях полунепрерывного культивирования 80
4.3. Разработка технологии пробиотической добавки на основе органических питательных сред 85
4.3.1. Исследование влияния биологического фактора на развитие пробиотических культур в ходе технологического процесса 85
4.3.2. Изучение влияния рН среды на скорость роста ацидофильных бактерий 89
4.3.3. Исследование развития бифидобактерий на органической питательной среде различного состава 93
4.4. Аппроксимация результатов исследований 107
4.5. Сравнительный расчет себестоимости комплексной органической питательной среды 114
5. Изучение показателей качества в процессе хранения пробиотической добавки к пище 116
5.1. Исследование состава микрофлоры добавки в процессе хранения .116
5.2. Изучение антагонистического действия пищевой добавки в процессе хранения 118
5.3. Исследование перевариваемости пищевой добавки 120
Выводы 122
Библиографический список 124
Приложения 137
- Свойства бифидобактерий и лактобактерий и механизм их воздействия на здоровье человека
- Определение способности штаммов Streptococcus salivarius subsp. thermophilus к продуцированию биологически активных веществ
- Исследование развития пробиотических культур в условиях полунепрерывного культивирования
- Изучение антагонистического действия пищевой добавки в процессе хранения
Введение к работе
Актуальность работы. Сохранение здоровья населения и увеличение продолжительности жизни человека продолжает оставаться одной из самых актуальных проблем. Организм здорового человека обладает высоко эффективными биохимическими системами адаптации к условиям окружающей среды. Однако возможности организма, определенные генетическим кодом, не беспредельны, а его адаптационные возможности ограничены. Существенное изменение характера питания населения, несбалансированность и отход от традиционного питания, уменьшение количества потребляемой пищи, значительная доля в ней техногенно-трансформированных пищевых ингредиентов создает дефицит эссенциальных алиментарных факторов и, в конечном счете, приводит к истощению эндокринной системы организма и проявляется в болезнях цивилизации. О важности этой проблемы говорится в одобренной правительством РФ «Концепции государственной политики в области здорового питания населения России на период до 2005 года», где одним из приоритетных направлений деятельности выделено: «ликвидация дефицита микронутриентов (восстановление отечественного производства витаминов-субстанций; создание индустрии биологически активных добавок к пище и технологий обогащения пищевых продуктов)» [60].
По данным экспертов Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) многие из «заболеваний цивилизации»: рак, болезни сердца и сосудов, мочекаменная и желчекаменная болезни, астма, остеохондроз, диабет и другие приводят к потере трудоспособности, инвалидности и смерти в самом работоспособном возрасте. Медики заметили, что эти заболевания имеют тенденцию к неуклонному росту их числа. К сожалению, население нашей страны не является исключением. Сердечно-сосудистыми заболеваниями в настоящее время страдают до 40% россиян, у более 80% они предопределяются функциональными расстройствами [126,128].
В сложившейся ситуации и государство, и общество понимают необходимость в увеличении спектра пищевых продуктов, обладающих функциональными свойствами, которые не только обеспечивают энергетические и структурные потребности, но и оказывают благотворное регулирующее действие на организм человека в целом или на его отдельные органы и их системы.
Особая роль в функциональном питании отводится продуктам и пищевым добавкам с пробиотическими свойствами. В последние годы получили распространение новые подходы к производству продуктов питания, связанные с восстановлением естественной экологии организма и основанные на использовании биологически активных веществ. Основы решения данной проблемы заложены в трудах Банниковой Л.А., Гавриловой Н.Б., Ганиной В.И., Гончаровой Г.С., Королевой Н.С, Рогова И.А., Семенихиной В.Ф., Хорольского В.В., Шамановой Г.П., Fuller R., Rasic Y.L., Sanders М.Е. Одним из аспектов такого подхода является нормализация микрофлоры желудочно-кишечного тракта путем потребления кисломолочных продуктов и пищевых добавок, полученных на основе про-биотических микроорганизмов.
В настоящее время в литературе имеются данные по получению кисломолочных пробиотических продуктов, эубиотиков, однако ограниченность сведений о создании пробиотических пищевых добавок, потребность в которых существует, затрудняет производство подобной продукции.
В этой связи разработка технологии пищевой добавки с пробиотическими свойствами является актуальной.
Работа выполнялась в рамках Федеральной научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники» в подпрограмме «Технологии живых систем».
Цель исследований. Цель настоящей работы - разработка технологии пищевой пробиотической добавки путем направленного подбора пробиотических культур микроорганизмов и обоснования рациональных параметров технологического процесса.
Тема диссертационной работы утверждена на заседании кафедры «Технология молока и молочных продуктов» МГУПБ. Научная новизна работы. Изучены физиолого-биохимические, генетические, технологические и пробиотические свойства шести новых штаммов термофильного молочнокислого стрептококка и четырех штаммов ацидофильных бактерий. Впервые проведена диагностика отечественных штаммов бифи-добактерий В. adolescentis В-1, В. longum ВГБ-21, В. bifidum ГСБ-15 и двух штаммов ацидофильных бактерий с применением полимеразной цепной реакции (ПНР), что позволило определить ДНК-фингерпринт. Использование ПЦР-диагностики для пробиотических штаммов позволит более жестко вести контроль за культурами, применяемыми на производстве. Научно обоснован принцип создания консорциума бифидобактерий и штаммов термофильного стрептококка, обладающих выраженной В-галактозидазной активностью. Получены новые данные о влиянии активной кислотности и состава питательных сред на накопление клеток пробиотических штаммов в условиях полунепрерывного глубинного культивирования. Обоснован состав новой комплексной органической питательной среды для получения биомассы пробиотических культур.
Установлено влияние технологических факторов на сроки хранения получаемой пищевой добавки. Исследованы пробиотические, органолептические, физико-химические и микробиологические показатели пищевой добавки.
Практическая ценность работы. Генетически охарактеризованы два штамма ацидофильных палочек и три штамма бифидобактерий. Получен консорциум, состоящий из штаммов термофильного стрептококка с повышенной В-галактозидазной активностью и бифидобактерий, а также из штаммов термофильного стрептококка и лактобактерий. Разработан состав комплексной органической питательной среды для наращивания пробиотических микроорганизмов. Определены параметры получения биомассы и разработана технология пищевой добавки с пробиотическими свойствами в стационарных условиях и в аппаратах полунепрерывного глубинного культивирования АК-203, АК-210. Во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов проведено депонирование Streptococcus salivarius subsp. thermophilus штаммов CT-9, СТ-95, СТ-161, обладающих повышенной В-галактозидазной активностью, а также Lacto 8 bacillus acidophilus штаммов AE-5 и АД-3 с присвоением коллекционных номеров ВКПМ В-7984, ВКПМ В-7985, ВКПМ В-7989, ВКПМ В-8153, ВКПМ В-8152 соответственно. Разработан проект нормативно-технической документации на производство пищевой добавки с пробиотическими свойствами. Разработана методика накопления биомассы пробиотических культур в ферментере, которая внедрена в учебный процесс для студентов, обучающихся по специальности 271100 и специализации «Техническая микробиология». На способ получения пробиотика, штамм Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ВКПМ 7984, штамм Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ВКПМ 7985, используемые для получения пробиотика, подана заявка на патент № 2002107874 и получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы (приоритет от 28.03.2002г.).
Апробация работы. Результаты научной работы доложены и обсуждены на Международной научно-технической конференции «Пищевой белок и экология» (Москва, 2000); 4-ой Международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек» (Москва, 2001); Международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002); Научно-практической конференции «Технологические аспекты комплексной переработки с/х сырья при производстве экологически безопасных пищевых продуктов общего и специального назначения» (Углич, 2002); 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2002); Научно-технической конференции «Технологии живых систем» (Москва, 2002).
В производственных условиях проведена апробация комплексной органической питательной среды для получения биомассы пробиотических культур и проверка разработанной технологии пищевой добавки.
По материалам диссертации опубликовано 14 работ и подана одна заявка на патент. Диссертационная работа изложена на 123 стр. машинописного текста, содержит 21 таблицу и 25 рисунков. Библиография представлена 157 источниками, в том числе 25 зарубежных авторов, количество приложений 15.
Свойства бифидобактерий и лактобактерий и механизм их воздействия на здоровье человека
Пробиотики, на основе компонентов микробных клеток и/или их метаболитов, реализуют свое положительное влияние на физиологические функции и биохимические реакции организма, непосредственно вмешиваясь в метаболическую активность клеток соответствующих органов и тканей, воздействуя при этом на гуморальную или нервную системы. Помимо восстановления микроэкологического статуса и связанного с ним повышения колонизационной резистентности организма бифидобактерии и лактобактерии предотвращают проникновение потенциально патогенных микроорганизмов через слизистые оболочки [11,91,109,125]. Известно, что бифидобактерии, составляющие до 90% от совокупности всей нормофлоры, представлены в кишечнике здорового человека преимущественно сразу несколькими видами, каждый из которых имеет свои биохимические и физиологические особенности.
По данным Гончаровой Г.И. с соавт., основанным на глубоком изучении видового пейзажа бифидофлоры, вид В. bifidum выявляется у здоровых людей всех возрастных групп; у детей на грудном вскармливании он является преобладающим и выделяется у 70% обследованных, до 40% - у детей 4-6 лет и до 15-20% - у взрослых.
Вид В. longum также характерен для детей и взрослых и выделяется у 40-60% детей первого года жизни и у 70-75% детей старшего возраста и взрослых людей среднего возраста; у пожилых людей он присутствует в 30% случаев.
Вид В. adolescentis свойственен взрослым людям и детям старшего возраста и обнаруживается у них в 60-65%о случаях. Этот вид становится преобладающим у пожилых людей (85%) [77].
Развитие научных направлений в последние годы позволило выявить новые механизмы действия лактобактерии в организме человека. Показано что, применение препаратов с культурами Lactobaccilus acidophilus косвенно повы 20 шает Т-клеточную и гуморальную активность иммунной системы, что подтверждается исследованиями в процессе иммуномониторинга. Иммуномодулятор-ные свойства этих культур сопровождаются еще интерфероногенными, что значительно расширяет спектр их воздействия на организм человека [9,16,75,149]. Нормально функционирующая резидентная микрофлора контролирует продукцию токсинов в кишечнике, предупреждая их избыточную выработку и попадание в кровоток. В результате метаболизма пробиотиков, обладающих детокси-цирующими и протеолитическими свойствами, в кишечнике в основном обеспечивается протеолиз эндотоксинов, аллергенов и антигенов. Естественно, при нарушении микробиоценоза эти субстанции попадают в кровь. На роль дисбак-териоза в развитии аллергических заболеваний указывали еще в 30-е годы 20-го столетия, когда было отмечено, что учащение случаев заболеваемости экземой связано с ростом искусственного вскармливания младенцев [45,140]. В настоящее время показана прямая взаимосвязь большинства хронических экзематозных поражений, псориаза и других заболеваний с недостатком или сниженной функциональной активностью пробиотиков в организме [17,25,26,151].
Имеются убедительные свидетельства воздействия пробиотиков на микроэкологию кишечника. Современные знания позволяют сделать вывод, что полезные эффекты пробиотики могут оказывать через прямое антагонистическое действие против специфических групп микроорганизмов (образование антибактериальных веществ, конкуренция за питательные вещества и места адгезии), изменение микробного метаболизма (увеличение или уменьшение ферментативной активности), стимуляцию иммунной системы, противораковые и анти-холестеринемические эффекты [39,59,60,86].
Представители Lactobacillus acidophilus, например, обладают выраженными ингибирующими свойствами против кишечных патогенов, и это специфическое действие обусловлено продукцией таких антибиотиков, как ацидофилин, лактолин и ацидолин. Образуемый ацидолин вместе с молочной кислотой обеспечивает высокую антимикробную активность против энтеропатогенных видов E.coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens и ряда других спорообразователей. Помимо образования специфических антибио 21 тиков ингибирование патогенов лактобациллами может быть обусловлено продуктами их метаболизма. Они образуют значительное количество уксусной, муравьиной, молочной кислот и пероксида водорода, ингибирующие свойства которых хорошо известны [47,92,155]. В процессе метаболизма многие лактоба-циллы закисляют рН ростовой среды до 4,5 и ниже, в то же время сами они то-лерантны к высокой кислотности среды. Вместе с тем, лактобациллы в результате образования метаболитов уменьшают окислительно-восстановительный потенциал, что способствует более полному ингибирующему действию на об-лигатно - и факультативно-анаэробные бактерии [31,69,71,88].
Различия в метаболических активностях микроорганизмов позволяют пробиотикам истощать необходимые питательные вещества из ростовой среды. Созданная конкуренция за питательные вещества образует дефицит отдельных из них, таким образом, ингибируя рост других бактерий. Показано, что пищевая конкуренция является фактором, ограничивающим рост Clostridium difficile в кишечнике. В этом отношении очень эффективны Lactobacillus acidophilus и бифидобактерии.
Еще одним механизмом предотвращения колонизации кишечника патогенами является способность пробиотических микроорганизмов прикрепляться к энтероцитам, создавая тем самым конкуренцию за место адгезии на кишечной стенке [146].
Таким образом, пробиотики имеют потенциал не только в балансирующем действии на кишечную флору, но и влияют на патогенез заболеваний, которые встречаются в тканях, удаленных от пищеварительного тракта [7].
Исследования с чистыми культурами бифидобактерии, лактобацилл, молочнокислых бактерий и эшерихий показали, что они способны ассимилировать холестерин. Так, было установлено, что ацидофильная палочка и бифидобактерии в присутствии желчи и в анаэробных условиях активно удаляли холестерин из лабораторных сред [114].
Активность, проявляемая пробиотическими микроорганизмами, также может оказать существенное влияние на уровень холестерина в крови, что является способностью деконъюгации желчных кислот. Деконъюгированные желч 22 ные кислоты обеспечивают меньшее всасывание липидов из кишечного тракта, чем конъюгированные. Это может привести к уменьшению всасывания холестерина из кишечника и таким образом влиять на уровень холестерина в крови [115,149].
Таким образом, анализ представленных выше данных однозначно свидетельствует, что пробиотики оказывают многообразное действие как на микрофлору желудочно-кишечного тракта, так и на обменные функции живого организма, а пробиотический эффект различных бактерий определяется суммой специфических активностей, которыми эти микроорганизмы обладают.
Использование пробиотических микроорганизмов в пищевой и фармацевтической промышленности постоянно расширяется в виде производства продуктов, препаратов, предназначенных для восстановления нарушенного баланса кишечной микрофлоры и связанной с этим дисфункцией ЖКТ человека. В настоящий момент времени некоторые вышеперечисленные препараты, содержащие живые микроорганизмы, выпускаются в виде сухих порошков, таблетиро-ванных и жидких форм. У каждой формы есть свои преимущества и недостатки [39,40,42,113,121,122].
Определение способности штаммов Streptococcus salivarius subsp. thermophilus к продуцированию биологически активных веществ
Поэтому очень важно включение в биологически активные добавки микроорганизмов с высоким потенциалом 13-галактозидазной активности, что позволит повысить их биологическую ценность. И в связи с этим при оценке технологических свойств микрофлоры, используемой в составе добавки, наряду с принятыми показателями особую важность имеет характеристика используемого микроорганизма по В-галактозидазной активности. По данным некоторых ученых, в частности к.т.н. Данилова М.Б., в ряде экспериментов было установлено, что наибольшей В-галактозидазной активностью обладают болгарская палочка и термофильный стрептококк, в меньшей степени -бифидобактерии, а мезофильная палочка и пропионовокислые бактерий вообще не обладают В-галактозидазной активностью [24,137]. Поэтому мы сочли актуальным провести оценку В-галактозидазной активности исследуемых штаммов термофильного стрептококка. Установлено также, что (3-галактозидаза термофильного стрептококка более термоустойчива по сравнению, например, с этим ферментом дрожжей (Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis), что определяет перспективность широкого промышленного использования термофильного стрептококка для ферментативных целей [102,141]. По мнению N.A. Greenberg и R.R. Mahoney [137], [3-галактозидаза термофильного стрептококка более активно осуществляет гидролиз лактозы молока. Она проявляет высокую активность и стабильность при рН молока (6,6), причём концентрация катионов молока оказывает стимулирующее воздействие на активность этого фермента [139].
В наших исследованиях под термином «В-галактозидазная активность» подразумевали способность штамма термофильного стрептококка к сбраживанию лактозы в молоке через 5 часов культивирования при температуре 37С и дозе инокуляции 3%. Косвенным признаком (3-галактозидазной активности молочнокислых бактерий является их кислотообразующая активность в молоке. В этой связи была проведена серия опытов по изучению лактозос-браживающей активности штаммов термофильного стрептококка путём вычисления образовавшейся в процессе сквашивания молочной кислоты.
Отмечено, что у всех штаммов термофильного стрептококка (3-галактозидазная активность была выше, чем у взятых для сравнения штаммов ацидофильной палочки, бифидобактерии и лактококков. Для получения про-биотика было решено применять штаммы с индексом лактозосбраживающей активности не ниже 0,85.
Полученные результаты показали, что штамм термофильного стрептококка СТ-95 в процессе культивирования в молоке утилизировал наибольшее количество лактозы, способность к утилизации лактозы у остальных микроорганизмов была менее выраженной.
На основании результатов исследований комплекса культурально-морфологических, генетических, физиолого-биохимических признаков и технологических свойств, а также по определению значений индекса лактозосбраживающей активности для дальнейшей работы нами был отобраны штаммы Streptococcus salivarius subsp. thermophilus CT-161, СТ-95 и СТ-9. Штаммы термофильного стрептококка СТ-9, СТ-95, СТ-161 как технологически ценные культуры и высокие продуценты фермента (3-галактозидазы были депонированы нами во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов, что подтверждено справками о депонировании (приложение 4,5,6).
Штамм СТ-9 представляет собой грамположительные, факультативно-анаэробные, неспорообразующие, неподвижные, каталазоотрицательные кокки. Клетки располагаются парами (диплококки) и в виде цепочек разной длины. При выращивании в жидком гидролизованном молоке давал рост по всей высоте объёма, а на стерильном обезжиренном молоке - образовывал равномерный по всему столбику молока сгусток. На поверхности плотных питательных сред (гидролизованное молоко с агаром и сахарозой) образовывал мелкие колонии округлой формы с зернистой структурой, глубинные колонии имели чечевицеобразную форму.
Содержание ГЦ в ДНК составляло 38,7мол.% (табл.6), что подтверждает его таксономическую принадлежность к роду Streptococcus. Штамм не имеет плазмидной ДНК, что свидетельствует о его способности стабильно сохранять характерные для него признаки и свойства.
При развитии в молоке нормального состава образовывал вязкий сгусток, имеющий слизистую консистенцию и обладающий чистым кисломолочным вкусом без посторонних привкусов и запахов. Штамм продуцирует фермент В-галактозидазу: индекс лактозосбраживающей активности - 0,94 (табл.5). Отличительной особенностью штамма СТ-9 может являться природная способность к продуцированию высокого количества экзополисаха-ридов, косвенным признаком чего можно считать вязкий сгусток, образуемый данным штаммом на молоке.
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus штамм СТ-95 представляет собой грамположительные, факультативно-анаэробные, неспорообразующие, неподвижные, каталазоотрицательные кокки. Клетки располагались парами (диплококки). При выращивании в жидком гидролизованном молоке давал рост по всей высоте объёма, а на стерильном обезжиренном молоке - образо 64 вывал равномерный по всему столбику молока молочный сгусток с отделением на поверхности сыворотки. На поверхности плотных питательных сред (гидролизованное молоко с агаром и сахарозой) образовывал мелкие колонии округлой формы с зернистой структурой, глубинные колонии имели чечеви-цеобразную форму.
Содержание ГЦ в ДНК составляло 39,9 мол.% (табл.6), что подтверждает его таксономическую принадлежность к роду Streptococcus. Штамм не имеет плазмидной ДНК, что свидетельствует о его способности стабильно сохранять характерные для него признаки и свойства.
При развитии в молоке нормального состава образовывал сгусток средней плотности с отделением сыворотки, обладающий чистым вкусом без посторонних привкусов и запахов. Отличительной особенностью штамма СТ-95 является природная способность к продуцированию достаточно высокого количества фермента В-галактозидазы: индивидуальный индекс лакто-зосбраживающей активности - 1,0 (табл.5).
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus штамм CT-161 представляет собой грамположительные, факультативно-анаэробные, неспорообразующие, неподвижные, каталазоотрицательные кокки. Клетки располагаются в виде цепочек разной длины. При выращивании в жидком гидролизованном молоке давал рост по всей высоте объёма, а на стерильном обезжиренном молоке - образовывал равномерный по всему столбику молока молочный сгусток. На поверхности плотных питательных сред (гидролизованное молоко с агаром и сахарозой) образовывал мелкие колонии округлой формы с зернистой структурой, глубинные колонии имели чечевицеобразную форму.
Исследование развития пробиотических культур в условиях полунепрерывного культивирования
О влиянии штаммов термофильного стрептококка с повышенной В-галактозидазной активностью на развитие исследуемых штаммов бифидобактерий подробно говорилось выше, в главе 3.2. В результате исследований было отобрано 2 штамма Streptococcus salivarius subsp. thermophilus: штамм CT-9 (В-7984) и штамм СТ-95 (В-7985). На основе отобранных штаммов были созданы консорциумы штаммов термофильного стрептококка и бифидобактерий. При составлении консорциумов штаммы термофильного стрептококка и три вида бифидобактерий вносили в соотношении 1:5, 1:4 и 1:3 при общей массовой доле вносимых культур от 3% до 5%. Эти соотношения были выбраны исходя из предварительно проведенных выработок пищевой добавки. Учитывая, что биохимическая активность изучаемых микроорганизмов в значительной степени зависит от температуры (для бифидобактерий - 37±1С, термофильного стрептококка - 37-42С) исследования проводили при температуре (37±1) С до образования сгустка в молоке. Состав питательной среды, от которого также зависит биохимическая активность микроорганизмов, принимался постоянным - одна партия стерильного обезжиренного молока (табл.14).
Ацидофильные бактерии являются сильными кислотообразователями, что отрицательно сказывается на органолептических показателях и на сроках хранения пищевой добавки, полученной на их основе. В этой связи представлялось целесообразным предпринять попытку совместного культивирования термофильного молочнокислого стрептококка (слабого кислотообразователя) и ацидофильных бактерий. В главе 3.4. подробно описаны исследования сочетаемости ацидофильных бактерий с другими видами микроорганизмов, в том числе и с термофильным молочнокислым стрептококком.
При составлении консорциумов вышеназванных культур, руководствуясь результатами исследований Ганиной В.И. [19], штаммы ацидофильных бактерий и термофильного стрептококка вносили в соотношении 3:1, 3:2 при общей массовой доле вносимых культур от 3% до 5%. Культивирование микроорганизмов вели при температуре (37±1)С до образования сгустка в молоке. В качестве питательной среды использовали одну партию стерильного обезжиренного молока.
Результаты проведенных экспериментов, представленные в таблице 14, 15 свидетельствуют о том, что соотношение вносимых культур влияет на ор-ганолептические свойства и титруемую кислотность пищевой добавки. При увеличении в консорциуме доли бифидобактерий повышались кислотность и отделение сыворотки в получаемом продукте (образец 4, 1), а ацидофильных бактерий - титруемая кислотность (образец 1,3). Эта тенденция проявлялась независимо от свойств штамма термофильного стрептококка, вводимого в состав консорциума. Следует отметить, что введение в консорциум разных штаммов термофильного молочнокислого стрептококка практически не приводило к изменению количества клеток пробиотических культур в добавке. Так, в пищевой добавке, полученной на основе бифидобактерий и термо-фильного стрептококка, количество клеток составляло 6,85-6,95 Lg КОЕ/см , а на основе ацидофильных бактерий и термофильного стрептококка - 9,1-9,4 Lg КОЕ/см3.
Установлено, что при составлении консорциумов целесообразно соблюдать соотношение между Str. thermophilus и бифидобактериями 1:4, а между ацидофильными бактериями и Str. thermophilus 3:2, поскольку при этом достигали заданные характеристики по органолептическим показателям и титруемой кислотности. При получении консорциумов можно использовать штаммы трех видов бифидобактерий, оба штамма ацидофильных бактерий в сочетании с отобранными ранее штаммами термофильного стрептококка. Однако, в данном случае количество клеток пробиотических культур в добавке, получаемой с использованием штаммов термофильного стрептококка, быстро снижалось в процессе хранения, что отрицательно сказывалось на сроках годности пищевой добавки. Всё это обуславливало проведение дальнейших исследований.
Как известно, в периодической культуре питательные вещества постепенно исчерпываются, что лимитирует рост бактерий. Однако замедление роста бактерий в молочных средах нельзя объяснить только истощением культуральнои среды, так как скорость их размножения снижается, когда в среде еще содержится необходимые для роста питательные вещества. Микробиологи полагают, что основным лимитирующим фактором их роста является избыток молочной кислоты, накапливающейся в среде в ходе метаболических процессов.
Особенно данный фактор негативно может влиять на накопление клеток ацидофильных бактерий, являющихся сильными кислотообразователями. Поэтому была проведена серия экспериментов по изучению влияния активной кислотности среды на скорость роста ацидофильных бактерий.
С целью выявления наибольшего прироста клеток в зависимости от активной кислотности среды наращивание биомассы проводили при рН 5,5; 6,0; 6,5. Нейтрализацию среды проводили 25% раствором аммиака. Контрольной являлась среда, в которую в процессе развития микроорганизмов раствор аммиака не вносили. Накопление биомассы проводили до достижения культурами экспоненциальной фазы развития, дальнейшее культивирование считали нецелесообразным, так как именно в этот период резко возрастает не только количество клеток микроорганизмов, но и продуктов их метаболизма.
Результаты изменения количества жизнеспособных клеток ацидофильной палочки при культивировании на обезжиренном молоке с повышенной массовой долей сухих веществ при различных значениях рН среды представлены на рис.9 (приложение 7). Полученные данные позволяют говорить о влиянии рН среды на скорость роста ацидофильной палочки. При нейтрализации раствором аммиака происходит активизация развития микроорганизмов.
Изучение антагонистического действия пищевой добавки в процессе хранения
Наложив на несколько полученных графиков экспоненциальные линии тренда, из указанных формул регрессии получили, что коэффициент при переменной в степени экспоненты положителен, в то время как в нашем случае эта величина должна быть отрицательной. Следовательно, экспоненциальная линия тренда не совсем корректна для данных уравнений. Однако, при наложении на эти же экспериментальные графики линейной линии тренда, обна-ружили, что коэффициент детерминированности (г ) в этом случае больше, чем в экспоненциальной линии тренда. Это позволяет говорить о том, что линейное уравнение, полученное с помощью регрессионного анализа, описывает фактические данные лучше, чем экспоненциальное уравнение, полученное также с помощью регрессионного анализа.
Таким образом, неизвестные величины были найдены с помощью линейного уравнения или наложением линейной линии тренда на имеющиеся графики.
Экспериментально накладывали на фактические (экспериментальные) данные степенные или полиномиальные линии тренда, например, второй и третей степеней. Получили, что при увеличении степени уравнения, описывающего линию тренда, коэффициент детерминированности также увеличивается. Так как экспериментальные данные М измерены с точностью до сотых (до второго знака после запятой, т.е. до 10 2) ограничились уравнением первой степени, т.е. линейным уравнением. В этой связи перешли от экспоненциального уравнения M(t)= С] - С2е 3 к линейному, для чего е 3 разложили в ряд Тейлора или ряд Накладывая линейную линию тренда, из уравнения находили разность А = С\ - Сг и произведение С2С3. Поскольку величина Сі известна, то находили и Сг, и Сз. Графические результаты полученного уравнения представлены на рис.21-24.
Анализ математической обработки полученных результатов и графиков показал, что: 1)во всех случаях коэффициент детерминированности (R ) больше 0,9, что говорит о хорошем приближении уравнения, полученного с помощью регрессионного анализа, к уравнению, описывающему фактические данные, т.е. о достоверности полученных экспериментальных данных; 2) из всех рассматриваемых питательных сред комплексная среда явля ется наилучшей, так как именно в данном случае величина А = С\ - Сг, соот ветствующая начальному значению (т.е. при t = 0), имеет наибольшее значе ние, а эффективное время Тэфф = наименьшее значение по сравнению с теми же величинами для других питательных сред; 3)из всех рассматриваемых питательных сред комплексная среда является наилучшей, так как именно в данном случае тангенс угла наклона прямой линейного уравнения у = кх + Ъ, каким является и наше уравнение линии тренда, наибольший. Поскольку тангенсом угла наклона является коэффициент к при переменной, то, чем больше к, тем больше тангенс угла наклона прямой, а следовательно, и тем больше угол наклона. При этом произведение С2Сз - коэффициент при переменной t - имеет наибольшее значение по сравнению с теми же самыми произведениями, соответствующими другим питательным средам. Таким образом, установили, что для каждого рассматриваемого вида микроорганизмов наилучшей питательной средой является вновь полученная комплексная органическая питательная среда. В производственных условиях ГУП ПЭЗ РАСХН проводили апробацию разработанной среды для наращивания пробиотических культур. Результаты подтвердили данные, полученные в лабораторных условиях, и свидетельствовали о целесообразности использования комплексной органической питательной среды для наращивания биомассы пробиотических культур и консорциумов с их участием (приложение 14). 4.5. Сравнительный расчет себестоимости комплексной органической питательной среды. Новая комплексная органическая питательная среда, полученная на основе обезжиренного молока с повышенной массовой долей сухих веществ, содержит в своем составе сироп лактулозы - «Лактусан», аскорбиновую кислоту и цитрат натрия. Данные таблиц 16 и 17 показывают, что вновь предложенная комплексная органическая питательная среда по своей себестоимости в 4-7 раз ниже, чем синтетические питательные среды., в сравнении со средой Блаурокка разница составляет 28 раз. Результаты расчетов свидетельствуют об экономической эффективности комплексной органической питательной среды. Учитывая, что конечной целью исследований является внедрение разработанной технологии в производство, предусматривающее получение добавки с заданными свойствами, необходимым является установление ее качественных показателей в процессе хранения при низких положительных температурах [54].
Были изучены свойства, как свежеприготовленной добавки, так и в процессе хранения. В процессе хранения добавку контролировали согласно МУК 2.32.721-98 «Определение безопасности и эффективности БАД к пище» [63] по таким показателям как количество клеток микроорганизмов и их типичность, активная и титруемая кислотность питательной среды, органолеп-тические показатели и показатели безопасности: бактерии группы кишечных палочек, Staph, aureus (коагулазоположительные стафилококки), патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, дрожжи, плесневые грибы. Результаты представлены в таблицах 18-20.
Для установления срока годности вырабатываемой добавки были проведены исследования основных показателей. Хранение осуществляли при температуре плюс (4±2)С. Выявлено, что в течение 30 суток все виды про-биотической добавки сохраняли основные свои показатели и отвечали требованиям МУК и разработанной нормативной документации.
