Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Состояние вопроса и задачи исследований
1.1 Биологическая роль железа в организме 6
1.2 Процесс хелатирования и солюбилизации минералов 16
1.3 Биохимические свойства пропионовокислых бактерий 25
1.4 Внеклеточные факторы адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды
1.5 Заключение по обзору литературы 37
Глава 2 Материалы и методы исследований
2.1 Постановка эксперимента и материалы исследований 39
2.2 Методы исследований 41
2.2.1. Физико-химические методы исследований 41
2.2.2 Микробиологические методы исследований 43
2.2.3. Реологические методы исследований 46
2.3. Статистическая обработка результатов 46
Глава 3 Исследование биотехнологического потенциала пропионовокислых бактерий
3.1 Влияние обработки молока Р-галактозидазой на активность пропионовокислых бактерий
3.2 Биотехнологические свойства пропионовокислых бактерий 53
3.3 Гемсодержащие метаболиты пропионовокислых бактерий 55
3.4 Антимутагенные свойства пропионовокислых бактерий 60
3.5 Изучение адгезивных свойств пропионовокислых бактерий 63
3.6 Биосинтез экзополисахаридов при культивировании пропионовокислых бактерий 70
Глава 4. Влияние сульфата железа на рост и синтез внеклеточных факторов адаптации пропионовокислых бактерий
4.1 Влияние сульфата железа на рост пропионовокислых бактерий... 75
4.2 Влияние сульфата железа на синтез внеклеточных факторов адаптации пропионовокислых бактерий 79
4.3 Влияние сульфата железа на адгезию и когезию пропионовокислых бактерий 84
Глава 5 Влияние казеиновых фосфопептидов на солюбилизацию железа в питательной среде
5.1 Уточнение технологических параметров выделения казеиновых фосфопептидов 90
5.2 Влияние казеиновых фосфопептидов на солюбилизацию двухвалентного железа 93
5.3 Влияние казеиновых фосфопептидов на биохимическую активность пропионовокислых бактерий 97
Глава 6 Разработка технологии биологически активной добавки, обогащенной железом 104
Выводы 109
Библиография 111
Приложения 125
- Процесс хелатирования и солюбилизации минералов
- Биотехнологические свойства пропионовокислых бактерий
- Влияние сульфата железа на синтез внеклеточных факторов адаптации пропионовокислых бактерий
- Влияние казеиновых фосфопептидов на солюбилизацию двухвалентного железа
Введение к работе
Концепция оптимального питания предполагает в качестве одного из важнейших условий сохранения здоровья человека адекватную обеспеченность его организма как макро-, так и микронутриентами, в том числе и эссенциаль-ными микроэлементами, в частности железом. Железодефицитные состояния по-прежнему остаются актуальной и, во многих отношениях, не решенной проблемой современной медицины. Недостаток железа в организме приводит ко многим негативным последствиям. Одним из них является развитие железоде-фицитной анемии.
Учитывая, что в повседневной жизни человек потребляет железо в составе растительных и животных продуктов и что наличие аминокислот и пептидов, а также белков животного происхождения способствуют лучшему усвоению организмом этого микроэлемента, представляется целесообразным обогащать рационы питания именно органическими формами железа. По нашему мнению, наиболее удобным объектом для биотехнологического получения железа в органической форме являются пропионовокислые бактерии, которые обладают' способностью синтезировать значительное количество гемсо-держащих ферментов и корриноидов, повышающих усвоение железа.
Известно, что железо в организме может всасываться только в виде Fe . Однако двухвалентное железо подвергается быстрому химическому окислению, переходя в нерастворимую, неусвояемую организмом трехвалентную форму. Для сохранения биодоступности железа привлекательной представляется роль хелатирующих «агентов», которые способствуют солюбилизации минералов, сохраняя их в растворимом состоянии. Одним из представителей такого рода хелаторов являются казеиновые фосфопептиды (CPPs). Следует отметить,
что до сих пор казеиновые фосфопептиды недостаточно изучены и как хелати-
рующие «агенты» для минералов, и как потенциальные нутрицевтики в питании человека. Кроме того, в литературе отсутствуют данные о влиянии CPPs на солюбилизацию железа. Поэтому исследование железосвязывающей способности CPPs представляет большой интерес.
Таким образом, разработка и создание биологически активной добавки, содержащей железо в органической хелатированной форме, является актуальным и эффективным способом кардинального улучшения здоровья населения нашей страны.
Процесс хелатирования и солюбилизации минералов
Сбалансированное питание или сбалансированные добавки к пище способны полностью обеспечить человека необходимыми минералами. Но, к сожалению, приём просто минералов не обеспечивает их полную усвояемость организмом. Благодаря активности элементов, почти все минералы способны образовывать соединения, не пригодные для использования нашим организмом. К примеру, любители крепкого чая или кофе сразу после приёма пищи не знают, что это снижает усвояемость микроэлементов на 50%. Это объясняется тем, что элементы этих напитков, вступают в реакцию со свободными ионами минералов и превращаются в непригодные для использования организмом соединения. С другой стороны, алкоголь, наоборот чрезмерно ускоряет процесс всасывания, что может привести к нежелательным последствиям, таким как повышенное давление. Такие различия в процессе усвоения, отражают биодоступность минералов - различие между количеством принятых и количеством утилизированных минералов [91].
Тонкий кишечник, где происходит основной процесс усвоения минералов, не способен усваивать отдельные ионы минералов. По этой причине природа наградила нас особым процессом подготовки и создания соединений, способных проходить сквозь стенку тонкого кишечника, доставляя тот или иной элемент в кровоток, «реку жизни». Происходит это путём соединения доступных аминокислот с ионом минерала, такой вид связи называется хелатной.
Следует отметить, что человеческий организм хорошо «знаком» с хелатированием. Примером классического хелата служит, например, гемоглобин, где атом железа окружен белковой оболочкой, или хлорофилл, где в белковой оболочке находится магний [89].
Слово хелат, произошло от геческого «Chele», что буквально означает клешня. Хелатирование - это процесс, при помощи которого минеральные вещества превращаются в хорошо усвояемую форму. В фармакологии хелатированием микроэлементов называют образование комплексных соединений минералов с определенными группами протеинов или аминокислот, так называемыми транспортными молекулами - хелатами, которые переносят ионы через кишечную стенку и защищают минерал от взаимодействия с другими элементами в желудке. Структура хелатных соединений минералов представляет собой заключённый в оболочку из органической аминокислоты минерал, что существенно увеличивает степень биодоступности и усвоения микро- и макроэлементов организмом (рисунок 2) [131].
Процесс усвоения хелатных минералов может осуществляется как в зоне транспортировки аминокислот, так и в зоне усвоения ионизированных минералов, так или иначе, прежде чем быть усвоенным, минерал должен объединиться с транспортирующим веществом, которым чаще всего оказывается аминокислота. Также данная форма соединений способна проникать через стенку матки беременных мам и питать развивающийся плод, что является важным преимуществом перед другими препаратами. Благодаря нормальному уровню кислотности хелатов, они не влияют на уровень желудочной кислотности, чего не происходит во время потребления неорганических солей минералов, которые още-лачивают кислотную среду желудка после приёма внутрь, что может вызвать дискомфорт, вздутие живота и затруднение усвоения полезных веществ в области кишечника. Не происходит и отложения нерастворимых осадков на стенки кишечника [134]. Без необходимого количества аминокислот в нашей пище, хелаты не могут быть сформированы, а значит, и минералы не могут быть приняты. Для того чтобы процесс хелатирования проходил успешно, требуется адекватное соотношение количества ионизированных (свободных) минералов и аминокислот, которые мы должны получать с пищей. Минералы, которые не хелатированы, не усваиваются и не используются организмом, вызывая в нем эффект отравления [118].
Употреблять нехелатированные минералы означает подвергать организм еще большей нагрузке, так как он пытается выделить дополнительные аминокислоты, необходимые для процесса хелатирования. Другими словами, организм будет пытаться самостоятельно хелатировать минералы, но этим перегрузит систему и растратит те аминокислоты, которые должны использоваться в других процессах [119].
Большое количество так называемых хелатов, рекламируемые производителями, как настоящие хелаты, в сущности, являются всего лишь смесью неорганических солей минералов с аминокислотами. Такие смеси слишком слабы, чтобы не потерять своей эффективности в условиях кислотной среды желудка, где фактор кислотности (рН) составляет порядка 2-4. Растворяясь, они теряют свои свойства, а в основной среде тонкого кишечника (рН 7,0-7,2) активные ионы минерала объединяются со всем, что им попадётся на пути. Чем выше число (рН), тем больше свободных гидроксидных групп. Они соединяются с активными ионами металлов и превращаются в их нерастворимые соли, часть которых откладывается на стенках кишечника, а другая, выводится из организма натуральным путём. Чрезмерное образование таких «осадков» ведёт к различным недугам и серьёзным заболеваниям. Происходит закупорка каналов, через которые происходит всасывание, что приводит к замедлению питательного процесса организма ценными микроэлементами, отложения вызывают запоры и расстройства желудочно-кишечного тракта [55].
При приеме вместе с дешевыми биодобавками «чистых» нехелатных металлов, их окислов и солей в кишечнике происходит спонтанное хелатирование минералов белками пищи. Часть из них связывается с белками слишком сильно, поэтому организм не способен использовать минерал в нужном месте и последний начинает бесконтрольно «бродить» по организму, иногда (если он находится в виде ионов) хаотично вступая в химические реакции. Часть связывается слишком слабо и не попадает в нужное место. В нужное место, в нужном виде минерал может попасть только в так называемом правильно хе-латированном виде [84].
Биотехнологические свойства пропионовокислых бактерий
На следующем этапе исследований были изучены биотехнологические свойства активизированных культур пропионовокислых бактерий. Технологические свойства штаммов являются неотъемлемой частью основных характеристик, включающих в себя активность сквашивания молока, ор-ганолептические и физико-химические показатели образованных сгустков. Кроме перечисленных свойств одной из важнейших характеристик является также способность культур к выживанию в неблагоприятных условиях желудочно-кишечного тракта человека [30].
Согласно литературным данным [22,23], пропионовокислые бактерии способны синтезировать значительное количество тетрапиррольных соединений (гемовых ферментов, корриноидов) и аминокислот, повышающих усвоение железа организмом. Тетрапиррольные соединения несут важные жиз-ненные функции поэтому их называют «пигментами жизни»; это хлорофил-лы, гемоглобин, цитохромы и кобаламины. Ионы металлов в этих соединениях находятся в комплексе с органическими лигандами [23].
Способность ПКБ синтезировать значительное количество гемсодер-жащих ферментов (каталазу, пероксидазу) выделяет их из числа других анаэробных микроорганизмов. Кроме того, пропионовокислые бактерии служат довольно хорошим источником супероксиддисмутазы (СОД). Отмечено, что одновременное присутствие СОД и каталазы внутри бактериального матрик-са позволяет клетке удалять супероксидные и пероксидные радикалы, образованные в окислительных реакциях [11,64].
Известно, что активность каталазы, пероксидазы и СОД весьма различна не только в разных организмах одного и того же вида или разновидности, но и у одного и того же организма в различных его органах в зависимости от стадии развития, от физиологического состояния и от многих других причин [33]. В этой связи на данном этапе исследований была изучена активность данных ферментов у разных штаммов пропионовокислых бактерий. Данные по активности ферментов, продуцируемых изучаемыми культурами, приведены в таблице 4.
Анализ данных, представленных в таблице 4, свидетельствует, что у всех штаммов довольно высокая каталазная активность. Причем у P. freudenreichii subsp.shermanii AC - 2503 она почти на 18-20% выше, чем у других видов. Это указывает на высокие защитные функции клетки от Н2О2 у данного представителя пропионовокислых бактерий. Что касается пероксидазы и СОД, то максимальная активность этих ферментов также проявилась у Р. freudenreichii subsp.shermanii AC - 2503 (1,42 нмоль/(мин-мг белка) и 1,37 ед/мг белка). У остальных представителей ПКБ активность данных ферментов хоть и имела высокое значение, но отличалась между собой незначительно.
Каталаза относится к числу нестабильных ферментов. Молекула ката-лазы имеет каталитически активную четвертичную структуру и в растворе даже при незначительных изменениях внешних условий может легко разлагаться на субъединицы с полной потерей своей активности [52]. В связи с этим проводили измерения активности ферментов во времени. Активности ферментов измеряли в течение месяца через каждые 4 суток. Результаты исследований представлены на рисунке 6.
Данные рисунка 6 показали, что активность каталазы у исследуемых штаммов не изменяется на протяжении первых четырех суток, а затем плавно начинает расти. На 8-е сутки наблюдается увеличение активности почти в 1,12 и 1,18 раза по сравнению с первыми сутками у P. cyclohexanicum Kusano АС-2260 и P. freudenreichii subsp.shermanii AC - 2503, и на 12-е сутки у Р. freundenreichii subsp freudenreichii АС-2500 (в 1,2 раз). Весьма незначительное увеличение активности (в 1,003 раза) произошло у P. cyclohexanicum Kusano АС-2259 также на 8-е сутки. Возможно, именно с этого момента в клетках накапливается Н2С 2, в связи, с чем пропионовокислые бактерии начинают активно вырабатывать каталазу.
На следующем этапе исследований изучали способность разных штаммов пропионовокислых бактерий синтезировать витамин Ві2(корринои-ды) при оптимальной температуре культивирования 30 С. Результаты исследований представлены на рисунке 7.
Таким образом, в ходе проведенных исследований было установлено, что исследуемые группы пропионовокислых бактерий обладают способностью синтезировать значительное количество корриноидов, а также гемсо-держащих ферментов с достаточно высокой активностью. При сравнении значений активности пероксидазы, каталазы и СОД было установлено, что изучаемые культуры существенно различаются лишь по активности каталазы, которая к тому же подвергалась естественным временным изменениям.
Влияние сульфата железа на синтез внеклеточных факторов адаптации пропионовокислых бактерий
При исследовании биотехнологического потенциала нами было установлено, что пропионовокислые бактерии синтезируют значительное количество гемсодержащих ферментов. Поскольку синтез и активность гемовых ферментов зависят от содержания в среде ионов железа, дальнейшие исследования направлены на изучение влияния FeS04 на биосинтез каталазы, пе-роксидазы и СОД. Результаты исследований приведены в таблице 10.
Анализ данных таблицы 3 показал, что с увеличением дозы железа у всех изученных штаммов происходит увеличение активности таких ферментов как каталаза и СОД. Увеличение концентрации сульфата железа в среде до 0,45-0,55 мг/мл приводит к возрастанию активности каталазы (в среднем) в 1,5 раза, а СОД в 1,7-1,85 раза. Что касается пероксидазы, то её активность во всех опытных образцах практически не изменялась. Вероятно, это объясняется накоплением только эндофермента.
Следует отметить, что увеличение активности каталазы и СОД значительно повышает способность пропионовокислых бактерий защищаться от окислительного стресса, поскольку именно эти ферменты способны выводить из клеток супероксидные радикалы. СОД, каталаза и пероксидаза, составляют первую линию защиты от окислительного стресса, регулируя уровень активных форм кислорода (АФК) [11]. Степень устойчивости и надежности живых систем, их старение в сильной степени зависят от активности антиоксидантных ферментов [82].
Из литературных данных известно, что защита от токсичной концентрации металла у микроорганизмов проявляется в образовании различных веществ, связывающих металл в форме малотоксичных соединений. В связи с этим дальнейшие исследования были посвящены изучению влияния сульфата железа на синтез внеклеточных факторов адаптации бактерий. Результаты исследований представлены в таблице 11.
Данные, приведенные в таблице 11, свидетельствуют, что добавление сульфата железа в питательную среду для культивирования ПКБ стимулирует синтез внеклеточных метаболитов. Так, было отмечено, что с увеличением дозы сульфата железа наблюдается более высокая антимутагенная активность пропионовых бактерий, что указывает на индукцию антимутагенеза. Индукция мутаций является результатом противодействия сил атаки на ДНК и репарации образованных повреждений. Возможность индукции антимутагенеза показывает, что антимутагенная активность пропионовокислых бактерий не ограничивается их сорбционными свойствами. Механизм индукции может быть связан с активацией антиоксидантных ферментов. Следует отметить, что антимутагенная защита ПКБ не только «стоит на страже» сохране ния собственного генотипа, но может быть использована для стабилизации генотипов и микробных ферментации других организмов.
Повышенный биосинтез экзополисахаридов (ЭПС) при добавлении железа (таблица 11) - это проявление неферментативной защиты бактерий, когда ЭПС препятствуют проникновению излишнего железа в клетку за счет её обволакивания (образование биопленки).
Согласно литературным данным, ЭПС или экзополимерный матрикс являются одним из ключевых структурных компонентов биопленок. Одна из важнейших функций экзополимерного матрикса - обеспечение защиты бактерий от различных стрессовых ситуаций, возникающих в окружающей среде, таких как УФ-облучение, изменение рН среды, осмотический шок, высыхание и как нами установлено от излишней концентрации металлов. Сложная архитектура биопленок обеспечивает возможность метаболической кооперации клеток внутри пространственно хорошо организованных систем, создает условия для установления симбиотических или антагонистических взаимодействий между бактериями [63,106].
Из литературы также известно, что в экспоненциальной и стационарной фазах роста защита клеток от действия токсичных металлов обусловлена осаждением их синтезированными ЭПС (образование нерастворимых соединений "металл -ЭПС") [97,107].
Увеличение продуктивности клеток по витамину В]2 (таблица 11) объясняется тем, что, согласно литературным данным, факторы, снижающие скорость роста бактерий и нарушающие сопряжения процессов анаболизма и катаболизма и сопряженность энергетических и конструктивных процессов, приводят к тому, что часть метаболитов (АТФ, НАД, ФАД и др.) могут включаться в молекулу витамина [39].
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что добавление сульфата железа в питательную среду стимулирует синтез внеклеточных метаболитов. Отмечено, что ионы железа являются регулирующим фактором, влияющим на характер синтеза внеклеточных метаболитов.
Влияние казеиновых фосфопептидов на солюбилизацию двухвалентного железа
На следующем этапе исследований в питательную среду вносили различные дозы водного раствора CPPS и сульфата железа. За процессом связы-вания железа следили по количеству образованного хелатированного Fe (% железа, оставшегося в двухвалентной форме от первоначальной дозы). Контролем служили бактериальные концентраты без добавления казеиновых фосфопептидов. Результаты исследований представлены на рисунках 17-20.
Как показывают данные, представленные на рисунках, наличие в среде казеиновых фосфопептидов способствует солюбилизации железа и сохранению его в виде Fe2+ ионов.
Максимальное количество растворимых комплексов железа (90-95%) по всем изученным штаммам пропионовокислых бактерий образуется при внесении 20% водного раствора казеиновых фосфопептидов и 0,45 мг/мл сульфата железа.
Следует отметить, что в контроле хелатирование железа осуществлялось белками, синтезируемыми пропионовокислыми бактериями в процессе культивирования. Количество солюбилизированного железа в зависимости от штамма составляло 20-30%. Это объясняется различной способностью пропионовокислых бактерий синтезировать аминокислоты, которые будут образовывать с железом хелатные комплексы.
Существует мнение, что искусственные хелатные формы минералов при хранении разрушаются и теряют свою эффективность, поэтому они уступают природным органическим солям этих элементов. В связи с этим исследовали сохранность железа, хелатированного казеиновыми фосфопепти-дами, в двухвалентной форме в процессе длительного хранения. Результаты исследований представлены в таблице 13.
В литературе имеются единичные сведения, освещающие функциональные свойства казеиновых фосфопептидов. Что касается способности CPPS воздействовать на полезную микрофлору кишечника и усиливать бактериальную ферментацию, то работ, посвященных этой проблеме, нами не обнаружено.
Поэтому в следующей серии опытов нами было изучено влияние казеиновых фосфопептидов на биохимическую активность пропионовокислых бактерий. Во всех изучаемых образцах определяли количество жизнеспособных клеток и среднюю удельную скорость роста культур - ц. Результаты исследований представлены в таблице 14 и на рисунках 21-24.
Известно, что при хранении жидких бактериальных концентратов даже при низкой температуре (4-6)С происходит уменьшение количества жизнеспособных клеток, так как происходит изменение рН и в связи с этим окислительные процессы протекают особенно быстро. При обогащении железом эти окислительные процессы вероятно замедляются, так как было установлено, что соединения железа обладают антиоксидантными свойствами. Железо участвует в разрушении свободных радикалов через ферментную систему пропионовокислых бактерий. Эффективное удаление свободных радикалов обеспечивает сохранение целостности мембран клеток, замедляет процесс вымирания клеток.
К концу 4-го месяца хранения количество ПКБ составило 1010кое/см3, что на порядок ниже, чем в начале хранения. Дальнейшее хранение жидких концентратов приводит к значительному снижению содержания жизнеспособных культур.
