Содержание к диссертации
Введение
1 .Аналитический обзор 6
1.1 Пробиотики - эффективное функциональное питание 6
1.1.1 Бифидобактерии как основа пробиотиков 8
1.1.2. Бифидосодержащие пробиотические препараты 9
1.1.3 Технологические аспекты производства бифидосодержащих пробиотиков 13
1.2. Пребиотики, целесообразность их использования 22
1.2.1 Пребиотический потенциал сухой соевой сыворотки 22
1.3 Синбиотики - перспективная тенденция пробиотического питания 28
2. Постановка эксперимента 30
2.1 Цели, задачи исследования 30
2.2 Схема исследований 31
2.3. Объекты и методы исследований 31
3 Результаты экспериментов, их обсуждение 36
3.1. Определение селективности бифидобактерии в отношении растительных пребиотических олигосахаридов 36
3.2. Бифидогенные свойства растительных олигосахаридсодержащих продуктов 49
3.2.1 Инулинсодержащие продукты 49
3.2.2 Продукты на основе соевых олигосахаридов 50
3.2.3 Создание бифидогенного комплекса на основе
растительных олигосахаридсодержащих продуктов 63
3.3 Разработка технологии синбиотической пищевой добавки 66
3.4 Промышленная апробация разработанной технологии и оценка качества синбиотической пищевой добавки на основе бифидобактерий и соевых олигосахаридов
Выводы
Литература
- Бифидобактерии как основа пробиотиков
- Пребиотики, целесообразность их использования
- Схема исследований
- Бифидогенные свойства растительных олигосахаридсодержащих продуктов
Введение к работе
Широкое распространение дисбиотических состояний среди взрослых и детей, а также отсутствие перспективы кардинального улучшения в ближайшие годы условий биоэкологического существования для основной массы населения обуславливает реальные и потенциальные потребности отечественного рынка синбиотиков. Эти функциональные продукты способны корректировать микробиоценоз кишечника как за счет колонизации внешними пробиотическими микроорганизмами, так и активизацией собственной полезной микрофлоры, и тем самым обеспечивать формирование и поддержание иммунного статуса человека.
Бифидобактерии как основа пробиотиков
Бифидосодержащие пробиотики, моно-, ассоциированные и мультиш таммовые и комбинированные вырабатывают централизованно по техноло гии бактериальных концентратов, включающей следующие операции: под бор культур, приготовление питательной среды для накопления биомассы, обеспечивающей достаточно быстрый рост и высокий урожай клеток; приго щ, товление инокулята,; инокуляция среды отобранными культурами в установ ленных дозах, позволяющих получить препараты с нужным соотношением видов и штаммов; инкубация, отделение (или нет) биомассы от культураль-ной среды; смешивание биомассы с защитной средой; расфасовка; консервирование клеток; чаще всего лиофилизацией или глубоким замораживанием. /20/
В производстве пробиотических продуктов используют, как правило, 5 фенотипических видов, выделенных от людей: B.bifidum, В. longum, B.breve, B.infantis и В. adolescentis. /4,8,9/ Таблица 1.1 Они должны быть изолированы из организма тех видов животных и человека, для которых они будут предназначены. Они должны обладать полезным воздействием на организм хозяина, подтвержденным лабораторными исследованиями и клиническими наблюдениями При длительном использовании они не должны вызывать побочные эффекты
Они должны обладать колонизационным потенциалом, т.е. сохраняться в пищеварительном тракте до достижения максимального положительногшо дейстивя (быть устойчивыми к низким значениям рН, желчным кислотам, антимикробным субстанциям, продуцируемым индигенной микрофлорой; хорошо адгезироваться к эпителию соответствующих слизистых оболочек) Они должны обладать стабильными характеристиками, как в клиническом, так и в технологическом плане
Они должны обладать высокой скоростью роста и размножения в условиях, близким таковым в кишечном тракте; при их культивировании in vitro для накопления биомассы следует создавать условия, максимально приближающие таковым микроокружения просвета кишечника При введении в больших количествах они должны обладать минимальной способностью в транслокации из просвета пищеварительного тракта во внутреннюю среду макроорганизма
Они должны иметь четкую физиолого-биохимическую и генетическую маркировку как для исключения фальсификации, так и для периодического контроля исходных пробиотических штаммов и производственных культур в процессе их эксплуатации
Вид B.bifidum выявлен у здоровых людей всех возрастных групп, однако у детей, содержащихся на грудном вскармливании, он является преобладающим и выделен у 40-70% обследованных; с возрастом частота его выделения постепенно снижается (до 15-20% у взрослых).
Вид В. longum также характерен и для детей и для взрослых и выделяется у 40-60% грудных детей и у 70-75% детей старшего возраста и взрос лых. К старости частота обнаружения этого вида снижается до 30%. Вид В. adolescentis свойственен только взрослым и детям старшего возраста и выделяется у них в 50-65% случаев. У пожилых лиц он становится преобладающим (до 85%)./10/ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского запатентован штамм Bifidobacterium breve, являющийся представителем нормальной микрофлоры человека и рекомендуемый для приготовления лечебно-диетических продуктов питания./24/
Виды B.infantis и B.breve и их биоварианты обнаруживаются только у детей грудного возраста, и то лишь в небольшом проценте случаев.
В Европе для производства бифидопрепаратов преимущественно используют B.bifidum, в Японии также используют B.longum. В последние годы в составе бифидопрепаратов достаточно широко начали применять штаммы B.infantis и В. adolescentis./20/
Для получения биомассы бифидобактерий используют различные питательные среды. К питательным средам предъявляют следующие общие требования:/25,26,27/
1. Они должны содержать источники азота и углерода, неорганические соединения, микроэлементы, а также факторы роста, витамины, в основном, группы В.
В качестве азотистого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном белки животного происхождения - молока, мяса, рыбы, мясокостной муки. С не меньшим успехом для этой цели используют дрожжи, а также белки растительного происхождения - соевые бобы, горох, ячмень, кукурузу и др.
Пребиотики, целесообразность их использования
Пребиотики - неперевариваемые ингредиенты пищи, которые способ ствуют улучшению здоровья за счет избирательной стимуляции роста и/или метаболической активности одной или нескольких групп бактерий, обитаю щих в толстой кишке /2, 4, 5/. Чтобы компонент пищи был классифицирован как пребиотик, он не должен подвергаться гидролизу пищеварительными ферментами человека, не должен абсорбироваться в верхних отделах пище v варительного тракта, однако должен являться селективным субстратом для роста и/или метаболической активации одного вида или определенной группы микроорганизмов, заселяющих толстый кишечник, приводя к нормализации их соотношения.
Ингредиенты питания, которые в большей степени отвечают этим требованиям, являются неперевариваемыми олигосахаридами. Известно, что бифидобактерии обладают ферментной системой /3-фруктозидаз, позволяю щей им расщеплять данные углеводы. В присутствии олигосахаридов бифи-добактерии и отдельные виды лактобацилл размножаются в кишечнике очень интенсивно, эти углеводы ускоряют, стабилизируют и усиливают пролиферацию этих бактерий в ЖКТ.
Свойства пребиотиков наиболее выражены во фруктоолигосахаридах (ФОС), инулине, галакто-олигосахаридах (ГОС), лактулозе, лактитоле /29/.
Наиболее изученными на сегодняшний день пребиотиками являются растворимые фруктоолигосахариды - ФОС, инулиноподобный фруктан и главным образом инулин./16,47-53/
Инулин - (СбНю05)п- полисахарид, полимер D-фруктозы, представляет собой кристаллический порошок, легко растворимый в горячей воде. Инулин содержится в клубнях и корнях георгинов, артишоков и одуванчиков. Его физиологическая ценность заключается в многообразном влиянии на обмен веществ.
Учеными доказано, что инулин действует как бифидогенный фактор: его потребление приводит к увеличению бифидобактерий, причем преобладанию B.adolescentis, B.longum, B.bifidum и уменьшению энтерококков./51/
Было показано, что инулин помимо стимуляции роста и активности бифидо- и лактобактерий, устранения дисбактериоза и роста патогенных микрорганизмов, повышает всасывание кальция в толстом кишечнике, т.е. снижает риск остеопороза, влияет на метаболизм липидов, уменьшая риск атеросклеротических изменений в сердечно-сосудистой системе и, возможно, предотвращает развитие сахарного диабета II типа. Имеются предварительные данные об антиканцерогенном эффекте инулина /47-53/.
На фоне желчегонного эффекта, которым обладает инулин, происходит гидролиз желчных кислот, улучшается функция печени, поджелудочной железы, кишечника, нормализуется обмен холестерина. Инулин и его производные выводят из организма соли тяжелых металлов, яды и радиоактивные вещества в несколько раз эффективнее, чем пектин и другие биологически активные соединения /47,50/ как функциональный ингредиент практически не используется, на практике применяют инулинсодержащие продукты, чаще всего полученные из топинамбура. Сухие вещества топинамбура содержат 45-52 % инулина, который в зависимости от применяемой технологии в большей или меньшей степени остается в продуктах переработки (таблица 1.2)/52-58/
Химический состав клубней топинамбура и продуктов его переработки Показатель Клубни Пюре Сок Концентрат топинамбура топинамбу- топинамбура топинамбура ра /58/ /59/ /60/ Сухие вещест- ва (СВ), % 20,5-23,0 18,3 13,0 96 Белок, % от СВ 6,32-11,74 7,49 5,18 7,0 Редуцирующие сахара, % от СВ 0,35-2,87 2,03 1,61 1,33 Инулин, % от СВ 32-38 31,60 18,36 90 Пектиновые вещества, % от СВ 5,1-6,9 4,6 1,84 Зола, % от СВ 1-5 4,1 0,2 3,0 Известны технологии топинамбурового пюре, пасты, муки, концентрата, сиропов, экстрактов, которые добавляют в хлеб, печенье, кексы, булочки, макароны, лапшу. Топинамбуровые наполнители успешно используют при изготовлении функциональных кондитерских изделий, готовых завтраков, комбинированных соков, безалкогольных напитков, пива, вина, при производстве молочных продуктов. /61 -64/
Употребление топинамбура в сыром виде и в виде продуктов его переработки больными сахарным диабетом вызывает значительное снижение со держания сахара в крови, позволяет резко сократить инъекции инсулина и способствует уменьшению массы тела больных. Диета с применением топи намбура тем более пригодна для диабетиков, т.к. содержит достаточное количество витамина Вив основном удовлетворяет потребность в белке и минеральных веществах.
В медицинской литературе имеются сведения о противотуберкулезной, противоопухолевой, антиаритмической, гипохолестеринемической, иммуно-модулирующей, фибринолитической, антикоагуляционной активности ину-линсодержащих продуктов переработки топинамбура, что, по-видимому, обусловлено также высоким содержанием в клубнях витаминов, аминокислот и биофильных компонентов. В связи с этим рекомендовано использование топинамбура и продуктов его переработки при лечении подагры, мочекаменной болезни, атеросклероза, профилактики раковых заболеваний и инфаркта/53,56/
Менее изучены на сегодняшний день свойства соевых олигосахаридов: раффинозы и стахиозы, также классифицируемых как пребиотики. Фермен тируя соевые олигосахариды, бифидобактерии потребляют остатки моноса харов: глюкозы, галактозы и фруктозы и увеличивают биомассу. В 90-х годах на основе биотехнологии в Японии был получен промыш ленный соевый олигосахарид (SOE). SOE (торговое название) представляют собой смесь сахарозы (44%), стахиозы (23%), раффинозы (7%) и моносаха ридов. Исследования на модельных животных показали, что главные углево ды SOE не деградируются и не утилизируются в желудке и тонком кишечни # ке, но подвергаются ферментации микроорганизмами толстого кишечника.
Схема исследований
Объектами исследований служили рафинированные растительные олигосахариды (инулин, раффиноза и стахиоза), сухая соевая сыворотка по ТУ 9199-072-02067862-2002 и концентрат топинамбура по ТУ 93 79-003-11866470-95, вновь созданные синтетические, питательные и защитные среды с их использованием, вновь созданная синбиотическая пищевая добавка на основе бифидобактерий и композиции растительных олигосаха-ридсодержащих продуктов. В работе, наряду с классическими, использовались и современные методы исследования: ОФ ВЭЖХ, электрометрические методы.
Химический состав и биохимические показатели определяли, руководствуясь следующими методами: содержание сухих веществ - по ГОСТ 3626-73 /74/; титруемую и активную кислотность - по ГОСТ 3624-92 /74,60/; индекс растворимости - по ГОСТ 8764-73 /74/; нормируемые по СанПиН 2.3.2.1078-01 /76/ показатели безопасности оценивали по стандартным методикам /77-85/. Микробиологические эксперименты включали в себя следующие исследования: количество бифидобактерий определяли согласно «Инструк ции по микробиологическому контролю на предприятиях молочной про мышленности» / и ГОСТ 51331-99 /87/. В стандартных методах /86,88/ ис пользовали посев в питательную БС-среду, разлитую в пробирки высоким столбиком. Культивирование при 37 + 2 С проводили в течение 3-х суток. нормируемые по СанПиН 2.3.2.1078-01 микробиологические показатели определяли по стандартным и рекомендуемым методикам /88-95/; выживаемость бифидобактерий в синтетических средах оценивали по стандарту мутности /97/ физиолого-биохимические свойства бифидобактерий: устойчивость к желчи, фенолу, NaCl, кислото- и антибиотикоустойчивость определяли по /26/.
Медико-биологические испытания проводили, как описано в /98,99/ Качество разработанной синбиотической добавки оценивали согласно МУК 2.32.721-98 «Определение безопасности и эффективности БАД к пище» /3/по следующим показателям: количество бифидобактерий, их типичность, растворимость, органолептические показатели и показатели безопасности.
Антагонистическую активность пищевой добавки определяли методом развивающихся смешанных популяций в сравнении с ростом тест-культур в монокультуре /26,100,101/. В работе использовали штаммы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов Е.соїі В-125, Staphilococcus aureus 209 В, полученные из коллекции ГУ МНИИЭМ им Г.Н.Габричевского. Коллекционные культуры патогенных и условно-патогенных микроорганизмов хранили при температуре 4+2 С на скошенном мясо-пептонном агаре под глицерином, для экспериментов из них го товили 1 -2 генерации. Свежеприготовленные тест-культуры 2 генерации смывали со скошенного мясо-пептонного агара физиологическим раствором и разводили до густоты 10 единиц по стандарту мутности ГИСК. В пробирки с 9 см жидкой питательной среды вносили по 1 см суспензии каждого тест-организма и 1 см восстановленной синбиотической добавки (опыт). Посевы инкубировали при температуре 37+2 С в течение 24-48 часов. В качестве контроля тест-организмы инкубировали в монокультуре в этих же условиях. По окончании инкубации из опытных и контрольных пробирок готовили ряды десятикратных разведений в физиологическом растворе, из которых делали посевы в чашки Петри на соответствующие питательные среды для каждого тест-микроорганизма /94,95/. Посевы инкубировали при 37 + 2С в течение 24-48 часов, после чего учитывали число КОЕ тест-микроорганизмов в опыте и контроле.
Контроль посторонней микрофлоры в синбиотической добавке осуществляли микроскопированием мазков ее раствора, окрашенных по Граму ( в 1 флакон добавки вносили 1 мл физиологического раствора)/100/ Бактерии, окрашенные в красный цвет, считали Грам-отрицательными и относили к посторонней микрофлоре /9, 96, 97/.
Повторность анализов в экспериментах - четырехкратная. Обработку экспериментальных данных проводили с использованием методов математической статистики /102,103,104,105/. Данные, представленные для обсуждения, являются статистически обработанными результатами экспериментов и имеют среднее квадратическое отклонение не более 5 %.
При переводе отдельных результатов в программу "STATISTICA" получены мультипликативные модели поверхностей и уравнения, характерно описывающие процессы /106,107/ При математической обработке некоторых результатов был применен регрессионный анализ, реализованный с помощью стандартных пакетов программ Microsoft Exel, "STATISTICA" и Mathcad 2000 Professional /106,107,108/.
Бифидогенные свойства растительных олигосахаридсодержащих продуктов
Используемые вещества а) Сухая соевая сыворотка (ТУ 9199-072-02067862-2002), предназначенная для активизации бифидобактерий в технологии пищевых продуктов, пребио тического обогащения пищевых продуктов, а также для приготовления мик робиологических сред для бифидобактерий в микробиологии; б) Ампициллин - антибиотик широкого спектра действия, активен в отноше нии различных групп грамположительных и грамотрицательных микроорга низмов. Ампициллин разрушается пенициллазой, поэтому не действует на устойчивые к бензилпенициллину пенициллиназообразующие стафилококки.
К побочным явлениям относятся аллергические реакции, дисбактериоз, дис пептические расстройства. При приеме внутрь средняя доза для детей со ставляет 100 мг/кг, при тяжелом течении инфекции может быть увеличена до 200 мг/кг.
Четырем группам крыс в течение 10 дней перорально с помощью зонда вводили раствор ампициллина в воде в дозе 50 мг на крысу (250 мг/кг). Контролем служили интактные животные, которым вводили дистиллированную воду. После отмены антибиотика трем группам крыс в течение 21 дня ежедневно водили соевую сыворотку в виде водного раствора 101 в количестве: 1 группе - 400 мг, 2 группе - 200 мг, 3 группе - 100 мг. Четвертую группу использовали в качестве контроля препаратов. Бактериологические исследования осуществляли согласно методическим рекомендациям /1,4/.
Нативные фекалии крыс взвешивали в стерильных пробирках и готовили разведение на физиологическом растворе (10"!). После тщательного эмульгирования делали серию разведений (до 10 11), которые высевали на следующие плотные среды: На среду Левина - из разведений 10" и 10" (для обнаружения энтеробактерий); на желчно-солевой агар (ЖСА) Чистовича -из разведения 10" и 10" (для стафилококков); на среду ЭДДС (энтерококко-вую дифференциально-диагностическую среду) - из разведений 10"3 и 10 5 (для энтерококков); на среду Сабуро со стрептомицином - из разведения 10 1 (для кандиды и других грибов). Для роящихся форм протея посвевы осуществляли в конденсационную воду свежескошенного агара по Щукевичу из разведения 10"1. Для посева на бифидобактерии и лактобактерии использовали пробирки с печеночной средой Блаурокка, регенерируемой непосредственно перед посевом.
Посевы инкубировали 24-48 часов при температуре 37 С. Среду Сабуро выдерживали 48-72 часа при температуре 30 С.
После инкубации на среде Левина подсчитывали общее число выросших кишечных палочек. Количество лактозонегативных (бесцветных) форм, а также колонии со слабо выраженными ферментативными свойствами (розовые). На кровяном агаре учитывали количество колоний кишечной палочки, не обладающих гемолитическими свойствами, наличие и количество ге-молизрующих кокков.
Количественный учет патогенных стафилококков проводился на ЖСА подсчетом колоний с зоной помутнения среды вокруг них в виде радужного венчика, что связано с продукцией этими микроорганизмами фермента леци-тиназы.
На ЭДДС производили подсчет и идентификацию выросших энтерококков. Предварительный учет гемолитической активности осуществляли через 18 часов, т.к. многие штаммы при росте вызывают побурение среды за счет выделения кислых продуктов метаболизма. К концу суток колонии S.faecalis приобретали вишнево-красный цвет, колонии вида S.faecum оставались бесцветными или белыми. Патогенные стрептококки S.faecalis sub. Zymogenes продуцировали протеолитические ферменты и лизировали эритроциты, что вызывало появление просветления среды вокруг колоний.
На среде Сабуро кандида вырастала в виде плотных выпуклых непрозрачных колоний. К патогенным грибам относили культуры почкующихся клеток при наличии нитей псевдо-мицелия.
Для определения анаэробных бифидо- и лактобактерий посевы на среде Блаурокка выращивали в течение 48 часов. Из посевов, в которых виден рост в виде помутнения всей среды, в виде отдельных колоний или тяжей, готовили препараты из живых культур и изучали с фазовым контрастом. Бифидо-бактерии представляли собой характерные палочки, образующие V, М - образные структуры, с утолщенными концами. Лактобациллы имели филамен-тозную форму.
Исследование указанных представителей кишечной микрофлоры не исчерпывает весь биоценоз кишечника, но тем не менее позволяет выявить нормальное или нарушенное состояние кишечной микрофлоры.
3. Результаты исследований
Широкое применение антибиотиков ведет к разнообразным микроэкологическим нарушениям, нередко сопровождающимся развитием патологических состояний с различными клиническими проявлениями.
В таблице 1 представлены данные по оценке микробиоценоза толстого кишечника крыс после курса ампициллина в сопоставлении с интактными животными. По способности вызывать дисбаланс в составе и функциях тол 103 стой кишки ампициллин относится к препаратам, оказывающим умеренное действие. 121
На 10-й день перорального введения антибиотика нами было отмечено уменьшение общего количества индигенной аутофлоры (бифидобактерий, лактобактерий, лактозопозитивных эшерихий). Значительно увеличилось количество условно-патогенных бактерий, в особенности лактозонегативных и слабоферментирующих эшерихий и гемолитических стафилококков.
