Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
Молочная кислота: основные свойства, получение и применение 13
Продуценты молочной кислоты 16
Род Lactobacillus 17
Род Streptococcus 21
Применение смешанных культур - продуцентов молочной кислоты 23
Использование других культур продуцентов при получении 25 молочной кислоты
Пропионовая кислота: основные свойства, получение и применение 26 1.3.1 Род Propionibacterium 28
Бактериоцины: основные понятия и свойства 29
Основные понятия, классификация 29
Бактериоцины молочнокислых бактерий и их применение 32
Лантобиотик низин 42
Бактериоцины пропионовокислых бактерий и их применение 52
1.5 Молочная сыворотка - сырьевой ресурс микробиологического произ
водства молочной кислоты, пропионовой кислоты и бактериоцинов 54
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 59
2.1 Материалы и методы исследований 59
Объекты исследований 59
Условия культивирования 59
Анализ сырья, промежуточных полупродуктов и готовой продукции 60
2.2 Структура экспериментальных исследований 64
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 66
3.1 Исследование и разработка технологии получения пищевой Ц+)- 66
молочной кислоты на основе молочной сыворотки
Определение оптимального режима подготовки сыворотки 67
Выбор штамма продуцента 69
Культурально-морфологические и биохимические свойства культу- 72 ры-продуцента Enterococcus faecium
Количество и качество посевного материала 76
Изучение влияния показателя кислотности среды на накопление мо- 77 лочной кислоты
Влияние неорганических и органических добавок 79
Оптимизация состава питательной кислоты для биосинтеза молочной 80 кислоты методом аддитативно-решетчатого математического описания объекта
Влияние исходной концентрации лактозы 84
Исследование влияния температурных режимов 86
Исследование процесса биосинтеза молочной кислоты культурой En- 86 terococcus faecium на стендовой установке в полупроизводственных условиях
Разработка метода очистки молочной кислоты, полученной на основе 88 молочной сыворотки
Изучение состава молочной кислоты, полученной на молочной 91 сыворотке и осадка
Токсилогические исследования штамма-продуцента и готового про- 92 дукта
3.2 Сравнительные исследования штаммов-продуцентов бактериоцинов 92
3.2.1 Повышение низинообразующей активности с целью получения про- 93
изводственных штаммов-продуцентов низина
Оценка свойств лабораторных штаммов Lactococcus lactis 93
Проведение селекционной работы с отобранными штаммами- 95 продуцентами для повышения их низинообазующей способности
Проведение ДНК фингерпринта с помощью ПЦР 99
Исследование антибиотической способности отобранного штамма 103 продуцента низина
4 Обнаружение и первичная идентификация бактериоциноподобных 106 веществ II и III класса, обладающих защитными (биопротекторными) свойствами
Обнаружение бактериоциноподобных веществ 106
Первичная идентификация бактериоциноподобных веществ 109
Изучение роста и образования бактериоцинов в динамике 115
Исследование культивирования консорциума микроорганизмов 118
Изучение антибиотической активности, отобранных штаммов про- 119 дуцентов бактериоцинов
Разработка технологии получения биоконсерванта 124
Создание унифицированной технологической схемы производства 126 комплексных пищевых добавок: лактата натрия, Ь(+)-молочной кислоты и биоконсерванта на основе молочной сыворотки. Проверка в производственных условиях технологической схемы про- 128 изводства пищевых добавок
Экономическая эффективность пищевых добавок, полученных на 131 основе молочной сыворотки
Применение комплексных пищевых добавок для создания продуктов 135 функционального питания
Использование исследованных культур молочнокислых и пропионо- 141
вокислых бактерий в качестве пробиотиков в медицинской практике
ВЫВОДЫ 146
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 148
ПРИЛОЖЕНИЯ 184
Введение к работе
В связи с концепцией государственной политики в области здорового питания населения России первостепенное значение приобретает проблема расширения отечественного производства пищевых продуктов и обеспечения их качества и безопасности.
Сложившаяся в настоящее время структура питания населения, отсутствие сбалансированных продуктов приводит к возникновению различных форм иммунодефицита, снижению сопротивляемости организма инфекциям и другим неблагоприятным факторам окружающей среды, к увеличению частоты заболеваний, вызываемых дефицитом макро- и микронутриентов.
При разработке продуктов нового поколения широко используются различные пищевые добавки, в том числе направленного действия.
Кроме того, обеспечение безопасности пищевых продуктов обусловливается необходимостью защиты пищевых продуктов и продовольственного сырья относительно неблагоприятного воздействия на них при производстве и хранении как потенциально опасных микроорганизмов и выделяемых ими токсичных веществ, так и приемов технологии (стерилизация, пастеризация и другие).
Потери при хранении пищевых продуктов и продовольственного сырья от микробиологической порчи составляют до 30% товарного веса.
В настоящее время наиболее распространен способ защиты пищевых продуктов термической обработкой, с использованием химических консервантов и синтетических органических кислот, что отрицательно отражается на качестве пищевых продуктов (ухудшаются их вкусовые и другие потребительские свойства, в продукты вносятся не органичные им химические вещества).
Использование для защиты пищевых продуктов добавок защитно-профилактического действия позволяет получать пищевые продукты высокого качества, термическая обработка, которых сведена к минимальной, которые не подвергаются быстрой порче и не представляют опасности для здоровья человека. Предотвращая порчу продуктов питания, они уменьшают опасность образования
токсинов. Такая профилактика тем более важна, что образовавшееся ядовитое вещество не может быть удалено из пищевых продуктов[1].
Перспективным направлением для этих целей служит использование биотехнологии микробиологического синтеза с помощью кислотообразующих бактерий с получением органических кислот и продуктов метаболизма, а также самих культур, внимание к которым значительно усилилось последнее время, как за рубежом, так и в России.
Все возрастающий интерес проявляется к использованию пробиотиков для создания новых пищевых биологически активных добавок, функциональных продуктов питания, используемых для лечения и профилактики кишечных инфекций.
Однако при всем многообразии применяемых биологических средств защиты продуктов питания они имеют оганиченное действие против тех или иных патогенных микроорганизмов, не охватывая всю область неблагоприятного воздействия. Поэтому использование комплексных препаратов для биологической защиты продуктов питания имеет особое значение.
Это направление основывается на изучении антибиотических веществ, продуцируемых определенной группой микроорганизмов.
Пробиотики - препараты и продукты питания, в состав которых входят вещества микробного и немикробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции и биохимические реакции организма хозяина через оптимизацию его микроэкологического статуса. Это определение предполагает, что любые микроорганизмы, их структурные компоненты, метаболиты, а так же вещества другого происхождения, позитивно влияющие на функционирование микрофлоры организма, способствующие лучшей адаптации последнего к окружающей среде в конкретной экологической нише, могут рассматриваться как пробиотики [2-6].
Многие бактерии, в том числе молочнокислые и пропионовокислые, синтезируют антибиотические вещества белково-пептидной природы, убивающие родственные виды или штаммы или тормозящие их рост, или имеющие более широкий
7 спектр антибактериального действия. Эти вещества с весьма специфическим действием получили название бактериоцинов.
Наиболее перспективными для исследования являются бактериоцины молочнокислых и пропионовокислых бактерий, т.к. осуществляют естественное предохранение пищевых продуктов, в том числе полученных путем ферментации и могут быть использованы как природные консерванты пищевых продуктов.
Поэтому разработка пищевых добавок функционального действия, обладающих защитно-профилактическими и консервирующими свойствами, является чрезвычайно актуальной.
Средством решения проблемы является подбор более активных штаммов-продуцентов кислотообразующих бактерий, разработка технологии производства пищевых и биологически активных добавок к пище, обладающих защитно-профилактическими и функциональными свойствами.
Основной целью данной работы является подбор активных штаммов продуцентов кислотообразующих бактерий, исследование их использования для получения комплексных пищевых добавок на основе L(+)- молочной кислоты и комплекса бактериоцинов - внеклеточных и внутриклеточных метаболитов молочнокислых и пропионовокислых бактерий с использованием вторичного ресурса пищевой промышленности - молочной сыворотки.
Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:
-разработка способа подготовки молочной сыворотки;
-отбор микроорганизмов продуцентов, способных эффективно осуществлять конверсию углеводов молочной сыворотки в молочную кислоту более предпочтительной оптической формы;
-изучение и разработка оптимальных условий для роста и кислотообразова-ния выбранных микроорганизмов;
-выбор микроорганизмов продуцентов, обладающих антагонистической способностью к патогенной микрофлоре, вызывающей порчу пищевых продуктов;
-отбор и селекция высокоактивных штаммов - продуцентов оптически чистой L(+)- молочной кислоты и бактериоцинов с целью расширения спектра антимикробной активности биоконсерванта;
-селекция высокоактивных штаммов Lactococcus lactis- продуцентов низина;
-отбор высокоактивных штаммов Propionibacterium freudenreichii subsp. sher-manii - продуцентов пропионовой кислоты и бактериоцинов, действие которых направлено против дрожжей и плесеней, для расширения спектра действия комплексного биоконсерванта;
оптимизация параметров управления процессом биосинтеза бактериоцинов;
разработка пищевых и биологически активных добавок; -наработка опытных образцов препаратов и оценка их качества; -разработка и рекомендации для промышленного внедрения на основании
полученных экспериментальных данных унифицированной технологической схемы получения пищевых добавок на основе Ь(+)-молочной и пропионовой кислот и комплекса бактериоцинов молочнокислых и пропионовокислых бактерий с использованием в качестве сырья молочной сыворотки.
На основании проведенных исследований физиолого-биохимических свойств культур продуцентов, для производства оптически чистой Ц+)-молочной кислоты впервые подобрана и исследована культура Enterococcus faecium с использованием в качестве сырья молочной сыворотки.
Выявлены основные закономерности биосинтеза культур-продуцентов, получен новый экспериментальный материал по изучению влияния технологических параметров на динамику накопления органических кислот и вторичных метаболитов.
Исследована возможность совместного культивирования консорциума молочнокислых и пропионовокислых бактерий для расширения антимикробного спектра действия биоконсерванта.
Разработана методика выделения и первичной идентифицикации бактериоцинов, продуцируемых данными культурами, изучены спектры поглощения бактериоцинов и антибиотическая активность отобранных штаммов-продуцентов.
Изучены закономерности биосинтеза бактериоцинов, включая низин, при использовании отобранных штаммов-продуцентов Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, Propionibacterium freudenreichii subs, shearmanii и Lactococcus lactis subsp. lactis.
По результатам проведенной работы получено 5 патентов РФ.
На основании результатов проведенных исследований разработана технология производства пищевых и биологически активных добавок с использованием кислотообразующих бактерий, характеризующаяся высоким техническим уровнем. Определены оптимальные режимы и новые приемы технологии, обеспечившие высокие продуктивность, выход и качество целевой продукции.
Разработана унифицированная технологическая схема получения комплексных пищевых добавок: лактата натрия, L(+)- молочной кислоты и биоконсерванта, на основе оптически чистой L(+)- молочной и пропионовой кислот, а также комплекса бактериоцинов, продуцируемых молочнокислыми и пропионовокислыми бактериями, позволяющая:
заменить традиционно используемые ценные сахаросодержащие субстраты (сахар, рафинадная патока, меласса) для получения пищевых добавок с использованием молочной кислоты, более дешевым и доступным сырьем - молочной сывороткой;
увеличить выход молочной кислоты по сравнению с традиционной технологией на сахаросодержащих средах с 92,0 до 95,0 %;
получить пищевую молочную кислоту в L (+) -форме с оптической чистотой 99,8% и обеспечением высокого качества при значительном снижении себестоимости целевого продукта;
- получить пищевые добавки - биоконсерванты, обладающие защитно-
профилактическим и пробиотическим действием;
- расширить спектр действия биоконсервантов за счет использования в ком
плексе с низином других бактериоцинов, благодаря синергетическому действию
специально подобранных культур микроорганизмов;
- получить биологически активные добавки к пище на основе L (+)-молочной кислоты, обладающие лечебным и профилактическим действием.
Значимость проведенной работы определяется разработкой новых пищевых добавок, содержащих ферментные комплексы и метаболиты молочнокислых и про-пионовокислых бактерий, направленно синтезирующих пищевые кислоты в L-форме, бактериоцины, легкоусвояемые белки и углеводы для создания гигиенически благополучных продуктов питания для детерминированных групп населения, защитно-профилактических препаратов для сохранения пищевой продукции и продовольственного сырья.
При этом создается экологически чистое производство с ресурсосберегающей технологией за счет использования нетрадиционных видов сырья, отходов и вторичных ресурсов переработки сельхозсырья. Выработка пищевых добавок, обладающих антимикробными, консервирующими свойствами позволит заменить химические и синтетические консерванты с неблагополучными последствиями их применения, существенно уменьшить импорт и позволит расширить ассортимент продуктов функционального питания.
