Содержание к диссертации
Введение
І. Литературный обзор 14
1. Взаимоотношения растений и микроорганизмов. 14
1.1 Микробно - растительные взаимодействия 15
1.2. Растения - центры формирования симбиотических сообществ микроорганизмов 17
1.3. Специфические взаимовыгодные формы микробно -растительных взаимодействий. Симбиоз растений и грибов. Микориза 19
1.3.1 . Эндотрофная микориза 20
1.3.2.Эктотрофная микориза 23
1.3.3. Экто-эндотрофная микориза 24
1.3.4. Взаимоотношения партнёров в симбиозе везикулярно -арбускулярного типа 29
1. 4. Значение симбиоза для жизненно важных процессов в растительном организме 31
1.5. Участие симбионтных грибов в синтетической деятельности растений 33
1.5.1. Витамины и ферменты 34
1.5.2. Аминокислоты 35
1.5.3. Жиры 35
1.5.4. Пигменты 36
1.5.5. Жирные кислоты 37
1.5.6. Гормональные вещества 37
2.Фитогормоны 38
2.1. Гормоны растений 38
2.1.1. Поливалентность, или множественность, действия 39
2.1.2. Зависимость эффекта от концентрации 42
2.1.3. Комплектность действия фитогормонов 43
2.1.4. Компенсатортгость действия 43
2.2. Негормональные регуляторы роста 43
2.3. Взаимодействие гормонов 45
2.4. Рецепторы и механизм действия гормонов 46
3. Микроорганизмы продуценты фитогормонов - регуляторов роста растений и их практическое применение 49
3.1.Распространение ауксинов, гибберттлинов и цитокининов среди микроорганизмов 49
3.2.Практическое применение фитогормонов и штаммов их образующих в растениеводстве 55
4. Получение фитогормонов - регуляторов роста растений 60
4.1. Культивирование грибов на жидких питательных средах 61
5. Масштабирование процессов микробиологического синтеза 64
6. Обзор рынка препаратов - регуляторов роста растений 74
7. Безопасность пищевых продуктов при использовании регуляторов роста в сельскохозяйственном производстве 79
7.1. Влияние регуляторов роста на качество получаемой продукции 80
II. Экспериментальная часть 82
3.1. Материалы и методы исследования 82
3.1.1. Объекты исследования 82
3.1.2. Приготовление питательных сред 83
3.1.2.1. Плотная агаризованная питательная среда Гелыдер 83
3.1.2.2 Жидкая питательная среда Гельцер 83
3.1.2.3. Методика приготовления раствора микроэлементов 84
3.1.3. Методика выделения микромицетов из корней растений и получения чистых культур 84
3.1.4. Методика приготовления посевного материала 85
3.1.5. Методика проведения суспензионного культивирования в колбах на качалке и в ферментере вместимостью 5 дм и 250 дм 85
3.1.6. Методика получения жидкого препарата 91
3.1.7. Методика определения биологической активности 91
3.1.8. Методы исследования 92
3.1.8.1. Микроскопические методы исследования 92
3.1.8.2. Определение рН растворов 93
3.1.8.3. Методика определения объемного коэффициента массопередачи сульфитным методом 93
3.1.8.4. Методика определения аминного азота методом формолъного титрования 96
3.1.8.5. Методика определения редуцирующих веществ по методу Бертрана 97
3.1.8.6. Методика определения абсолютно сухих веществ 98
3.1.8.7. Методика определения воздушно сухой биомассы грибного мицелия 99
3.1.8.8. Методика определения сухой массы стеблей и корней растения 99
3.1.8.9. Методика отбора средней пробы растений 99
3.1.8.10. Методика определения хлорофилл ов А, В и каратиноидов в листьях 100
3.1.8.11. Методика количественного определения аскорбиновой кислоты в растениях 102
3.1.8.12. Статистическая обработка результатов 102
3.2. Результаты исследований и обсуждение 104
3.2.1 Скрининг микромицетов 104
3.2.2. Сравнение биологической активности в условиях глубинной культуры. Выбор штамма продуцента. Основные морфологические и филогенетические особенности отобранного штамма 112
3.2.3. Определение оптимального разведения бесклеточного фильтрата кудьтуральной жидкости микромицета 122
3.2.4. Определение биологической активности Phialocephala fort mii F-833 на зерновых сельскохозяйственных культурах в лабораторных условиях 123
3.2.5. Влияние состава питательной среды и условий культивирования на рост и биологическую активность культуры Fhialocephala fort mii F-833 125
3.2.5.1. Влияние источника углерода 125
3.2.5.2. Влияние источника азота 129
3.2.5.3. Подбор наиболее эффективного состава питательной среды методом математического планирования эксперимента 131
3.2.5.4. Подбор внесения посевной дозы 134
3.2.5.5. Влияние физико-химических условий культивирования на биологическую активность Phialocephala fortmii F-833 и подбор наиболее эффективных режимных параметров процесса роста 135
3.2.5.5.1. Влияние гемперагуры культивирования и длительности на биологическую активность культуры Phialocephala fortmii F-833 135
3.2.5.5.2. Влияние рН среды на биологическую активность микромицета Phialocephala fortinii F-833 144
3.2.5.5.3. Влияние ограниченной аэрации на биологическую активность 148
3.2.6. Определение критериев масштабирования 150
3.2.7. Инкубирование Phialocephala fort mii F-833 отъемно-доливным способом 154
3.2.7.1. В колбах на качалке 154
3.2.7.2. В ферментере объемом 5 дм" 157
3.2.8. Культивирование мицелиального гриба Phialocephah fortinii F-833 в ферментере вместимостью 250 дм" 163
3.2.9. Определение готовой формы препарата 167
3.2.9.1. Подбор состава наполнителя препарата 170
3.2.9.2. Оценка биологической активности в процессе хранения сухого препарата 176
3.2.10. Определение химического состава препарата - регулятора роста растений. 179
3.2.11. Испытания препарата на сельскохозяйственных культурах 185
IV. Технологическая часть 192
V. Технико-экономическая оценка 195
Выводы 196
Список литературы 195
- Эндотрофная микориза
- Обзор рынка препаратов - регуляторов роста растений
- Влияние гемперагуры культивирования и длительности на биологическую активность культуры Phialocephala fortmii F-833
- Испытания препарата на сельскохозяйственных культурах
Введение к работе
Актуальность темы. Внедрение экологически безопасных и экономически выгодных технологий пищевого растениеводства является приоритетным направлением в решении проблемы обеспеченности пищевыми ресурсами народонаселения нашей страны. Разработанная национальная программа Государственной политики РФ в области сельского хозяйства на 2015 г, меняется в сторону его экологизации и стимулирования биодинамических и органических систем земледелия.
Альтернативой существующим («химическим») технологиям растениеводства призваны служить новые препараты - регуляторы роста растений (РРР) на биологической основе, позволяющих эффективно реализовать потенциальные возможности сорта или гибрида растений, заложенные в геноме. Они используют естественные механизмы взаимовыгодных симбиотиче-ских отношений растения и микромира, в котором оно существует. В настоящее время на Российском рынке РРР доля таких препаратов невелика: в Государственном каталоге пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ (2011 г.), зарегистрированы только четыре отечественных препарата. Эти препараты разработаны на основе продуктов метаболизма микроорганизмов, они производятся по заказу потребителей и отсутствуют в свободной продаже. Поэтому разработка новой, интенсивной и научно-обоснованной биотехнологии производства регуляторов роста в количествах, способных обеспечить их широкое внедрение в практику пищевого растениеводства, актуальна и способна открыть широкие перспективы для получения экологически чистых продуктов питания.
Цель исследования.
-
Выделить и охарактеризовать новые микромицеты - симбионты растений, обладающих высокой ростостимулирующей активностью.
-
Разработать технологию культивирования активного микромицета -симбионта и получения на его основе препарата - РРР, пригодного для широкого практического применения в сельском хозяйстве.
3. Провести испытания препарата в лабораторных и мелкоделяночных условиях.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Проведение скрининга высокоактивных неспорообразующих штаммов микромицетов - симбионтов растений по биологической активности (БА), исследование их морфологических особенностей и физиологических потребностей;
-
Идентификация штамма-продуцента на основе анализа последовательности 18S rRNA;
-
Выявление основных закономерностей кинетики роста микромицета, оптимизация технологических параметров выращивания по методу глубинного культивирования;
-
Масштабный переход процесса культивирования от колб до аппарата большего типоразмера - ферментера;
-
Изучение химического состава препарата;
-
Разработка препаративной формы препарата с целью получения коммерческого продукта с длительным сроком хранения;
-
Проведение лабораторных, мелкоделяночных испытаний препарата и разработка рекомендаций по способам применения.
Работа выполнялась при финансовой поддержке фонда DOE IPP PNNL (№ 325771-A-G2).
Научная новизна работы. Получен новый штамм микромицета, комплекс метаболитов которого оказывает выраженное стимулирующее действие на рост и развитие растений. Определена видовая принадлежность микромицета, который отнесен к Phialocephala fortinii F-833.
На основании выявленных зависимостей биологической активности штамма от условий культивирования определен состав питательной среды и условия культивирования, обеспечивающие высокую активность комплекса его метаболитов. Разработан состав препаративной формы, подобран наполнитель, определены условия сублимационного высушивания.
Впервые выявлены наиболее эффективные условия выращивания штамма Phialocephala fortinii F-833 в лабораторном ферментере вместимостью 5 дм и в промышленных условиях в аппарате вместимостью 250 дм3.
Показано, что разработанный РРР обладает широким спектром действия - способствует ускорению процессов прорастания семян широкого ряда культур, значительно повышает параметры роста, развития, продуктивность, адаптивный потенциал. Полученная продукция отличается повышенным качеством.
Практическая значимость и реализация результатов работы. Создана лабораторная коллекция микроорганизмов, продукты метаболизма которых оказывают рострегулирующее действие на растения. Разработан паспорт на штамм Phialocephala fortinii F-833. Получен патент на изобретение №2237088 «Штамм продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами». Штамм Phialocephala fortinii F-833 принят на национальное патентное депонирование в ГосНИИгенетика и включен в состав ВКПМ. Исследована патогенность штамма, получено заключение о возможности его использования при производстве биостимулятора роста растений.
Впервые разработана технология культивирования штамма Phialocephala fortinii F-833, как продуцента РРР в лабораторном ферментере и в промышленном аппарате. Проведено 20 ферментации в аппарате вместимостью 5 дм и две ферментации в аппарате вместимостью 250 дм3. Разработаны ТУ оп 9291-008-04777441-2008 на препарат «Мицефит» регулятор роста растений, промышленный регламент на производство препарата «Мицефит» ПР-9291008-04777441-2008. Определены режимы сублимационного высушивания и состав препаративной формы, позволяющие сохранить качество препарата при хранении в широком диапазоне температур без потери активности. Разработана инструкция по способам применения препарата.
На разработанный препарат получено свидетельство на товарный знак № 260587 «Мицефит».
Наработаны опытные партии и проведены испытания препарата в лабораторных, мелкоделяночных, полевых условиях на производственных базах организаций, допущенных к проведению регистрационных испытаний Минсельхозом и ответственных за подготовку экспертных заключений для получения разрешения применения препарата в сельском хозяйстве.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на Международных форумах, конгрессах и конференциях: «Биотехнология и современность» (С.-Пб.: 2006 г.); «Грибы и водоросли в биоценозах» (М.: 2006 г.); «Аэрокосмический Конгресс IAC» (М., 2006 г.); «Пилотируемые полеты в космос» (М., 2005 г.).
Препарат «Мицефит» представлялся на международных выставках: «Вэйстэк-2007» (М., 2007 г.), «Мир биотехнологии» (М., 2005-2007 гг.).
Научные положения, выносимые на защиту:
научно-обоснованная технология получения препарата РРР на основе культуры микромицета, выделенного из ризосферы корней растений, для повышения безопасности пищевого растениеводства;
выявленные в результате исследований основные параметры культивирования микромицета, обеспечивающие высокую эффективность биотехнологического производства нового препарата РРР.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертационное исследование соответствует пп. 6, 13 и 14 паспорта специальности 05.18.07 - «Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ».
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 20 работ, в т.ч. 2 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК, 2 статьи в сборниках научных трудов, 16 статей в материалах международных научно-практических конференций, форумов, съездов, конгрессов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 210 источников, из них 77 иностранных, и приложе-
Эндотрофная микориза
В злаках, затем в осоках, а потом и в других растениях нашли грибы, которые являются родственниками хорошо известной спорыньи, названные эндофитами. Они живут в надземных частях растений и, образуя токсичные алкалоиды, защищают хозяев от пожирания травоядными животными - от насекомых и слизней до жвачных. Эндофиты усиливают рост вегетативных органов зараженных растений, но подавляют продукцию семян, тем самым, изменяя соотношение вегетативного и семенного способов размножения. О роли эндофитных грибов свидетельствует следующие примеры. В тканях тисса обнаружено соединение таксол, излечивающее некоторые формы рака. Лабораторные исследования показали, что таксол продуцирует не только тисе, но и эндофитный гриб, живущий в его тканях. В литературе имеются данные, что эндофитные грибы защищают инфицированные растения от фитопатогенов, в частности от грибов рода Fuzarium, способствуют выработке у них устойчивости к токсинам и др. (Stenstrom С. 1997; Lan QL, 2004; Honoid А., 1998).
В работах Bever J.D. было приведено доказательство, что характер и скорость роста эндофитных грибов являются очень хозяин -специфичными. В этих работах показано также, что развитие эндофитных грибов зависит от времени года, некоторые грибы интенсивно развиваются поздней весной, а другие в конце лета. Развитие эндофитных грибов зависит также от минерального состава почвы (Bever J.D. 2001).
Чтобы увидеть всю картину возможных взаимодействий гриба и растения, фактически нужно представить метаболические системы обоих организмов. Представители этих классов вступают во взаимодействие и развиваются при очень сложных связях грибов с корнями растений. Интеграция растения и гриба бывает настолько велика, что можно фактически говорить о новой функциональной единице. Следует отметить, что микоризообразование не приводит к каким-либо существенным внешним изменениям корней и обнаруживается только при соответствующих исследованиях.
При эндотрофной микоризе мицелий гриба распространяется главным образом внутри тканей корня растений (в коровой паренхиме) и относительно мало выходит наружу. После проникновения в корень (обычно это корневой волосок) гифа растет в двух направлениях — к кончику и основанию волоска. Корни при этом имеют нормальные корневые волоски. Мицелий гриба располагается в межлеточном пространстве или внутри клеток. При этом образуются внутриклеточные разветвления в виде гаусторий — арбускулы (от лат. arbuscuhmi — древообразная структура). Помимо арбускул гифы грибов образуют в других клетках кортекса корня пузырьковидные вздутия — везикулы, отсюда и соответствующее название микоризы - арбускулярно-везикулярная (ВАМ) (Bago В., 1998). Считается, что именно через эти структуры происходит химическое взаимодействие гриба и растения. Эндотрофная микориза встречается у многих травянистых растений. Она образуется главным образом микроскопическими грибами с неклеточным мицелием из отдела Zygomycota порядок Glumales). (Morton J.B., 1994;DialloA.T., 1999; Castellano М.А., 1994).
В последние годы, на основе секвестрования рДНК гиф и спор палеомикологических образцов получены данные, свидетельствующие о том, что возникновение порядка Glomales относится к еще более раннему периоду (600 млн. лет назад) (Redeker et al., 2002., Redeker, 2002), чем считалось прежде (Pirozynski К.А., Dalpe, 1989; Berbee M.L., Taylor. 1995).
Арбускулярные микоризные грибы в начале 21 века по комплексу морфологических и молекулярных признаков выделили в отдел Glomeromycota (Schuessler., 2001). В настоящее время ведутся интенсивные таксономические исследования этой группы. Эндотрофная микориза может образовываться также грибами с клеточным мицелием из отдела Ascomycota или анаморфными (несовершенными) грибами (Шлегель Г.Г., 1987; Черапанова Н.П., 2005; Гарибова Л.В., 2005; Кутафьева Н.П., 2003; Нетрусов А.И., 2005, Марфенина О.Е., 2005). Эндотрофная микориза орхидных (сем. Orchidaceous) образована базидиальным грибом в его анаморфной стадии — Rhizoctonia, о чем свидетельствуют типичные пряжки на мицелии, характерные для базидиальных грибов. Микориза орхидных облигатна для большинства видов этого семейства. Успешное прорастание семян орхидных растений in vivo возможно только в присутствии микоризообразующего гриба. Микоризация же корней генеративно зрелых фотосинтезирующих растений - явление не обязательное, однако, большинство орхидей сохраняют связь с микобионтом и продолжают переваривать в клетках кортикальной паренхимы грибные гифы (Withner. 1959; Залукаева, 1990). Для корней эпифитных орхидей отмечено присутствие гриба -микоризообразователя только в субстратных корнях или той части воздушных корней, которая имеет контакт с субстратом ("Залукаева, 1990; Katiyar et al., 1986). Изучение дифференцированно окрашенных по методу Стоуна срезов воздушных корней орхидей P.amabilis и D.phalaenopsis, формирующих на поверхности толстый чехол - оболочку из ассоциированных микроорганизмов, - показало, что в клетках коровой паренхимы, под слоем веламена присутствуют клубки гиф микобионта или их полупереваренные остатки - пелотоны (Лобакова Е.С., 2004). Таким образом, чехол - оболочка на поверхности воздушных корней орхидей, образованный сложным по структуре сообществом ассоциативных микроорганизмов, является питательным субстратом для гриба -микоризообразователя и способствует колонизации им клеток коровой паренхимы эпифитных корней.
Микоризные грибы имеют много особенностей. Они являются многоядерными, а в цитоплазме многих ВАМ, таких как Glomus caledonium, Acaulosporalaevis, Gigaspora margarita и некоторых других, а также образуемых ими спорах присутствуют бактерии. генетически близкородственные бактериям рода Burkholderia (Нетрусов А.И.., 2005). Таким образом, в данном случае можно говорить о тройственном бактерио-грибо-раетительном взаимодействии.
При исследовании фоссилий и использовании молекулярно-биологических методов установлена большая древность арбускулярных микоризных грибов: они существовали 350 — 450 млн. лет назад.(Яету W., 1994., Taylor T.N. 1995). Часть эндомикоризных грибов не образует везикул, и речь идет только об арбускулярной микоризе (AM). К такой функции неспособны, например, грибы, образующие эндомикоризу с растениями порядка Erikales (эрика, азалия и др.). У орхидных везикулы и арбу с культ не образуются.
Обзор рынка препаратов - регуляторов роста растений
Проблемы рационального природопользования и обеспечения населения безопасными для здоровья продуктами питания являются особенно актуальными в современном обществе. В ряде зарубежных стран постоянно расширяется производство продукции растениеводства на основе экологизированных технологий, получивших название экологичное сельскохозяйственное производство (альтернативное производство, органическое земледелие и т.п.).
Развитие биоорганического (экологического) сельского хозяйства стало одним из способов уменьшения негативного воздействия сельского хозяйства на природу и человека. Биоорганическое земледелие открывает новые перспективы для многих стран мира, в том числе и для России, где это направление сельского хозяйства только начинает формироваться. Альтернативой применения минеральных удобрений, а также химических протравителей семян и фунгицидов является более широкое использовать современныех препаратов биологической природы: микробиологические препараты (биофунгициды, регуляторы роста растений и иммунорегуляторы), активаторы полезной микрофлоры, биоудобрения и гуминовые препараты. Основополагающим условием успешного применения биопрепаратов в современном земледелии является их разумное использование и сочетание со всеми имеющимися в настоящее время средствами и агротехническими приемами.
Согласно последним данным официальных международных организаций статистики (w w w//FIBL. org; w w w//Faostat. fao. org; www//epp.eurostat.ec.europa.eu) органическое сельское хозяйство практикуется почти в 160 странах мира. В мире насчитывается около 37,2 млн.га органических сельскохозяйственных угодий. Лидерами по общей площади органических сельскохозяйственных угодий являются Австралия и Океания (12,2 млн. га), Европа (9,3 млн. га) и Латинская Америка, включая страны Карибского бассейна (8,6 млн. га). С наибольшей составляющей земель используемых под органическое земледелие являются страны: Австралия (12,0 млн. га), Аргентина (4,4 млн.га), США (1,95 млн.га), Китай (1,85 млн.га), Бразилия (1,77 млн. га). В России этот показатель составляет всего лишь 78 449 га.
Мировой рынок органических продуктов питания постоянно растет, странами с наибольшим объемом являются: США (17,835 млн. ), Германия (5800 млн.), Франция (3041 млн.), Великобритания (2065 млн.). Более того, исследования показали, что потребители во всех странах мира готовы платить большую цену за продукцию органического земледелия: биоовощи и биофрукты.
Мировой рынок биотехнологий для сельского хозяйства и пищевой промышленности оценивается в 45 млрд. долларов и, по некоторым данным, он растет на 20-30% в год. Важнейшее место в нем принадлежит микробиологическим препаратам (Грачева И.М., Иванова Л.А., 2006).
По объему производства средства защиты растений и регуляторы роста составляют 4% рынка биотехнологических препаратов, в том числе рынок биологических стимуляторов роста растений оценивается в $1,22 млн. Однако, по мнению большинства экспертов, биологические регуляторы роста растений уже вытесняют с рынка химические средства, а в дальнейшем эта тенденция усилится. Рост российского рынка стимуляторов роста растений в последнее время составляет в среднем на 18% в год. Это прямо свидетельствует о том, что активной конкуренции на рынке нет, продукция заполняет свободные ниши (по данным abercade consulting).
В основных направлениях агропродовольственной политики РФ предлагается стимулировать развитие биологических, биодинамических и органических систем земледелия, низкозатратного устойчивого сельского хозяйства, а также разработанных отечественными учеными адаптивных систем сельского хозяйства, пропагандировать экологизацию сельского хозяйства.
Поэтому целесообразно более конкретно остановится на месте разработанного нами препарата среди имеющихся на российском рынке.
В Государственном каталоге пестицидов и агрохимикатов представлены 54 торговых названия препаратов, разрешенных для применения гражданами и юридическими лицами в сельском, лесном, коммунальном и личных подсобных хозяйствах в 2011 г. Однако список действующих веществ этих препаратов значительно короче, на основе данных представлных в таблице 2 их 36.
Целями применения регуляторов роста являются ускорение прорастания семян, росі а и развития, стимуляция корнеобразования, улучшение приживаемости, повышение урожайности, устойчивости к заболеваниям и неблагоприятным факторам окружающей среды, ускорение биологической спелости и улучшение лежкости плодов и др. (Безуглова О.С, 2003, Драговоз И.В., 2002, (Янчевская Т.Г., 2001).
Часть препаратов зарегистрированы как микробиологические удобрения и применяются как стимуляторы роста (Азовит, Байкал ЭМ-1, Восток ЭМ-1, Экстрасол). В списке действующих веществ препаратов, разрешенных к применению на территории РФ представлены препараты на основе фитогормонов (Гетероауксин, Гиббор-М, Завязь, Гибберросс, Цветень, Бутон, Гибберсиб и др.), на основе аминокислот (Рибав-экстра, Агат-25) и других веществ, а также препараты биологического происхождения, представляющие собой многокомпонентный комплекс ростовых веществ - продуктов метаболизма грибов и бактерий (Агропон, СИМОРГОНТ, Эмистим, Бинорам). Доля биологических препаратов среди множества перечисленных выше регуляторов роста весьма мала и составляет не более 7%. Действующим веществом биологических препаратов, по данным производителей, является сбалансированный комплекс фитогормонов ауксиновой и цитокининовой природы, аминокислот, углеводов, жирных кислот с преобладанием полиненасыщенных, аминосахаров, олигосахаридов и биогенных микроэлементов.
Влияние гемперагуры культивирования и длительности на биологическую активность культуры Phialocephala fortmii F-833
Влияние температуры культивирования на рост и биологическую активность микромицета изучали при инкубировании гриба в колбах на качалке в течение четырех недель на оптимизированной среде по данным п. 3.2.5.3. Исследовали влияние четырех температур: (22±1) ! С, (26±1) С, (30±1) С, (34±1) " С. На каждую неделю роста снимали по одной колбе и проводили оценку биологической активности каждого варианта, в качестве тест-объекта использовали семена пшеницы.
На рис. 12а и 126 представлен внешний вид колб в зависимости от температуры и времени роста. Рост микромицета происходил в виде шарообразных игольчатых структур, самые крупные образования были отмечены на 1-ую неделю при температуре роста (22±1) С, их диаметр составлял 2-5 мм и был более чем в 2 раза больше этого показателя, чем при температуре (26±1) С (1-3 мм). В дальнейшей фазе развития различия по форме не наблюдалось.
В вариантах при температурах инкубирования (30±1) С и (26±1) С наблюдалось потемнение среды из-за присутствия мелких фрагментов гиф.
Рост гриба отсутствовал при температуре инкубирования (34±1) С в течение четырех недель.
По окончании процесса инкубирования в каждом из вариантов определяли накопление ВСМ мицелия, концентрацию редуцирующих веществ, аминного азота, рН по методикам, описанным в п.3.1.8.7, п. 3.1.8.5., п. 3.1.8.4., п. 3.1.8.2., а также биологическую активность. Результаты исследований представлены в таблице № 13.
Как видно из данных (см. табл. 13 и рис.13) значения рН среды в процессе роста практически не меняется с 6,4 до 6,2 к четвертой неделе при температуре роста (22±1 )С и до 5,9 при (26±1 )С и (30±1 )ПС.
Отмечено снижение концентрации редуцирующих веществ к концу процесса культивирования при температурах (22±1 )С, (26±1 ) С, (30±1/!С при температуре (26±1)С концентрация упала практически до нулевого значения и составила 0,075%.
Содержание аминного азота к концу7 процесса культивирования увеличивается во всех рассмотренных вариантах. При температурах роста (22±1)С и (26±1)С концентрация аминного азота к концу инкубирования возросла на 40 % и составила 39,2 мг/% по сравнению с исходным показателем среды в 28 мг/%; при (30±1 ) С концентрация увеличилась на 50 % и составила 42,0 мг/%; при (34±l)f)C на 60 %, что составляет 44,8 мг/%.
При температуре инкубирования (34±1)С рост микромицета отсутствовал, по вместе с тем, в конце культивирования отмечено увеличение содержание редуцирующих веществ и аминного азота. Это связано с неблагоприятной температурой роста и разрушением клеток мицелия посевного материала, что в итоге и повлияло на биохимические показатели.
Средняя скорость потребления глюкозы максимальна на 1 и 2 нед. роста при температурах (22±1)1 С и (26±1) С и составляет соответственно 0,19 и 0,22 г/нед,, к 3 нед. роста наблюдается снижение этого показателя до 0,07 и 0,15 г/нед. Скорость потребления глюкозы напрямую связана со скоростью накопления ВСМ мицелия. При температурах (22±1) С и (26±1) С на 1 и 2 нед. роста в среднем значения скорости накопления ВСМ составляют 0,095 и 0,097 г/нед., к 3 и 4 нед. наблюдается снижение этого показателя до 0,028 и 0,05 г/нед. соответственно.
При температуре культивирования (30±1)С рост и развитие микромицета отстает на 1 нед. в сравнении с вариантами при температурах роста (22±1) С и (26±1) С. На рис. 14 четко прослеживается резкое снижение скорости потребление РВ с 0,17 до 0,02 г/нед., и скорости накопления ВСМ с 0,06 до 0,01 г/нед. к четвертой неделе роста.
На рис. 15 по данным табл. 14 представлены результаты биологической активности в зависимости от времени культивирования и температуры.
Показано, что БА увеличивается к 3-ей неделе роста и падает к 4-ой в изученном диапазоне температур. Максимальные значения БА получены при температуре инкубирования (26±1) С. Увеличение длины стеблей растений пшеницы на 20% превышает контроль и корней на 29% соответственно.
Испытания препарата на сельскохозяйственных культурах
В рамках совместной программы (DOE IPP PNNL №325771-A-G2), в США проведены испытания препарата на кормовых злаках: мятлик луговой (лат. Роа pratemis, сорт: Kentucky Bluegrass); житняк (лат. Agropyron, сорт Secar Bluebranch Wheatgrass).
В полевых опытах использовали методики морфо-физиологической оценки реакции растений на применение препарата, которые включают подсчет побегов кущения, развитие партикул, накопление биомассы (корни, стебли) и др.
Растения выращивались без орошения. В каждом эксперименте были необработанные и обработанные растения водными растворами препарата (1, 10 и 100 ррт). Размер участков 25 м2, по четыре повторности. Влияние опрыскивания препаратом растений на интенсивность ростовых процессов представлено на рис. 31 и табл. 36. На графике представлен вклад каждой категории оцененных биометрических показателей в общую сумму в различные периоды вегетации по сравнению с контролем. Опрыскивание растений по всходам проводили рабочими растворами из расчета 100 мл/м". Методики отбора средней пробы растений и определения сухой массы описаны в п. 3.1.8.9. и п. 3.1.8.8.
Обработка препаратом «Мицефит» повлияла на рост растений обоих видов трав. Обработка препаратом привела к повышению всех рассмотренных показателей, активация роста была благоприятной для образования подземных побегов, листьев и накопления большей сухой биомассы. Наиболее заметные ростовые реакции растений мятлика и житняка наблюдались при разведении препарата 10.
Через 10,5 месяцев после обработки растений мятлика и житняка провели оценку показателей в фазу цветения. Обработка препаратом оказала влияние и на побегообразующую способность. Коэффициент продуктивной кустистости (доли генеративных побегов от их общего числа) у обработанных растений житняка составил 0.64 в сравнении с контролем 0,56. У растений мятлика при обработке отмечено возрастание общего числа побегов, но число генеративных побегов существенно не увеличилось, значениев коэффициента продуктивной кустистости в контроле 0,40 и в опыте 0,38. В связи с увеличением кустистости растений целесообразно проводить корреляцию густоты их состояния в посевах (норм высева) с целью оптимизации фотосинтетической деятельности.
Испытания препарата па овощных культурах
В опытах в штате Вашингтон были заложены эксперименты по применению препарата Мицефит на овощных культурах (морковь, кукуруза). Исследовали три способа обработки препаратом «Мицефит» (водные растворы препарата в концентрации 10 ррт): замачивание сехмян, опрыскивание и совместная обработка. Полученные результаты сравнивали с традиционным способом возделывания культур с применением удобрения и контролем (без обработки).
У растений моркови обработка семян препаратом Мицефит привела к увеличению полевой всхожести и резкому увеличению начального роста (см. табл. 37, 38). Опрыскивание листьев растений привело к дальнейшему увеличению темпов роста.
У растений кукурузы, совместная обработка препаратом семян и опрыскивания растений оказалась особенно эффективной для стимуляции роста растения (таблица 39). Всходы обработанных семян появились на 3 дня ранее, чем в других вариантах.
Максимальное увеличение биометрических показателей для всех изученных растений наблюдалось в варианте совместной обработки семян и опрыскивания растений препаратом.
Испытания препарата в Московской области
По литературным данным известно, что обработка растений регуляторами роста способствует не только увеличению урожайности, но и положительно влияет на качество полученной продукции.
Мелкоделяночные испытания препарата в открытом грунте проводили на растениях редиса и салата листового. Растения выращивались без орошения. В каждом эксперименте были необработанные и обработанные растения водными растворами препарата. Размер участков 3 мА, по три повторности. Семена растений обрабатывали путем замачивания в рабочем растворе 10"5 в течение 30 минут. В фазе третьего листа было произведено опрыскивание растений водным раствором препарата. Расход рабочего раствора па опрыскивание -100 см на 1 м".
Обработка препаратом растений редиса привела к увеличению биометрических показателей: массы корнеплода на 73,8 %, высоты растения на 19,6 %, массы листьев на 133,5%, количество листьев на 29,2 % по сравнению с контролем. У растений салата листового количество листьев увеличилось на 23,3%, высота растений на 67.1 %, длина корня на 20,3 %, вес надземной части на 65,5% по сравнению с контрольным вариантом.
