Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Пищевые красители, особенности получения, способы увеличения их эффективности и удлинения сроков хранения 12
1.1 Технологии получения, стабилизации пищевых красителей и требования к их качеству 12
1.2 Химический состав и особенности фунщионалъного действия пигментов из морских организмов (ylocentrotus intermedius иylocentrotus nudus), перспективы их применения в пищевых технологиях 21
1.3 Липосомы как экспериментальные модели для транспорта и удлинения сроков храпения биологически активных веществ 26
1.4 Эффективность и задачи липосом в пищевых технологиях 33
ГЛАВА 2 Объекты, направления и методы исследований 38
2.1 Объекты и направления экспериментальных исследований 38
2.2 Выбор стандартных и общепринятых методов исследований 40
2.3Статистическая обработка данных 53
2,4 Верификация закона распределения вероятности Пирсона 54
ГЛАВА 3 Обоснование использования сырьевых и технологических ресурсов - отходов переработки морских гидробионтов для получения пигментов 57
3.1 Анализ морских сырьевых ресурсов как продуцентов пигментов для пищевой промышленности 57
3.2 Характеристика безопасности отходов переработки морских ежей, используемых для получения пигментов 60
ГЛАВА 4 Определение химического состава и оценка безопасности пигментов морских ежей 66
4.1 Спектроскопическое исследование состава выделенных пигментов 66
4.2 Товарная экспертиза пигментов люрских ежей 69
4.3 Оценка безопасности пигментов из морских гидробионтов биологическим методом на модели тест системы Tetrahymena pyriformis 71
ГЛАВА 5 Разработка химического и биотехнологического способов стабилизации пигментов в процессе хранения и выбор технологии для обогащения и стабилизации пищевьгх сред (напитков) 19
5.1 Разработка химического способа стабилизации красителя из отходов переработки морских ежей 79
5.2 Выбор и характеристика липидной мембранной основы для получения липосом с целью инкапсулирования в них пищевых пигментов из отходов переработки морских ежей 87
5.3 Изучение размеров и стабильности фосфолипидных носителей липосом в сравнении с липосомалъными комплексами пигментов морских ежей 88
5.3.1 Определение гидрофобности и коэффициента депонирования пигментов морских ежей в липосомы 103
ГЛАВА 6 Использование пигментов морских ежей в качестве пищевьгх красителей для производства безалкогольных напитков 108
6.1 Разработка технологий безалкогольных напитков с использованием пигментов морских ежей 108
6.2 Органолептическая экспертиза качества безалкогольных напитков с использованием пигментов морских ежей 113
6.3 Показатели безопасности и качества безалкогольных напитков 117
Выводы 111
Список использованной литературы 122
Приложения 139
- Химический состав и особенности фунщионалъного действия пигментов из морских организмов (Strongylocentrotus intermedius и Strongylocentrotus nudus), перспективы их применения в пищевых технологиях
- Выбор стандартных и общепринятых методов исследований
- Характеристика безопасности отходов переработки морских ежей, используемых для получения пигментов
- Оценка безопасности пигментов из морских гидробионтов биологическим методом на модели тест системы Tetrahymena pyriformis
Введение к работе
Развитие прикладной биотехнологии в области поиска и создания натуральных пищевых красителей для обеспечения высоких органолептических и функциональных свойств продуктов является перспективным научным направлением.
Известно, что высококачественные пищевые продукты гармонично сочетают форму, вкус, аромат и окраску. Без любой из этих составляющих продукт перестает быть привлекательным для потребителя.
В середине XX века бурное развитие химической промышленности привело к появлению большого количества красителей различной химической природы, которые по своим характеристикам (интенсивность окраски, свето-, кислото- и термостойкость) и относительно невысокой себестоимости превосходили натуральные (Фетисов, 2001). В результате произошло вполне понятное снижение спроса на натуральные красители (Позняковский, 1999; Кудряшева, Шокина, 2000; Кацерикова, Туричев, 2002).
Однако, развитие исследований в области безопасности и токсикологии пищевых красителей и выявление среди них вредных и потенциально опасных для человеческого организма веществ позволило сделать вывод о необходимости ограничения их использования. К тому же синтетические красители являются типичными представителями посторонних добавок в продукты питания (Сарафанова, Васекина, 2001).
В связи с этим возникает вопрос о целесообразности применения искусственных красителей в производстве пищевых продуктов (Бакулина, 1999; Архипова, 2000, 2001; Поваляева, 2003).
Следует отметить, что используемые в пищевой промышленности природные пигменты, в основном растительного происхождения, обладшот и значительной физиологической, антиоксидантной, радиопротекторной, ге но протектор ной, антимикробной активностью и применяются как лечебно -
7 профилактические средства (Дубодел, 1995; Кацерикова 1998, 2001; Ляшенко,
199S; Алексеева, 2000; Шубина, 2000).
Анализ литературных данных показывает, что производство натуральных пищевых красителей ведется в основном на основе растительного сырья. Красители животного происхождения применяются значительно реже, наиболее широко применяется краситель красного цвета кармин.
Известно, что в качестве красителей животного происхождения предлагается использовать гемовые пигменты и каротиноиды из криля (Касьянов, 1999; Болотов, 2001).
В последний период 20 века в научной литературе появились публикации по выделению каротииоидных пигментов из отходов переработки краба по технологиям, разработанным дальневосточными учеными (Купина, 1998; Леваньков, 1999,2000).
Согласно литературным данным, гидробионты морских и пресноводных акваторий выгодно отличаются от многих наземных и водных организмов значительным разнообразием вторичных метаболитов, среди которых доминирующая часть представлена функциональными соединениями, имеющими биологическую активность (Еляков, 1986, 1988; Лебская, 1998; Oshima, 1998; Jack, 1998). Несмотря на это, пигменты из морских организмов в пищевой промышленности применяются довольно ограничено.
В 80-е годы 20 века в Тихоокеанском Институте Биоорганической Химии ДВО РАН велись активные работы по поиску новых биологически активных природных пигментов среди морских организмов, в частности среди морских ежей (Уткина, 1979).
Показано, что пигменты морских ежей обладают антибиотической, антикоагулянтной, противоопухолевой активностью и могут служить перспективным источником натуральных пищевых красителей, в которых нуждается не только пищевая, но и фармацевтическая промышленность. В химическом отношении эти пигменты представляют собой производные
8 юглон а и нафтазарина. Среди морских животных в большом количестве они найдены только у иглокожих (Уткина, 1979; Скурихин, 1991).
В странах Дальнего Востока морские ежи Strongylocentrotus intermedins и Strongylocentrotus nudus (тип иглокожие) являются промысловыми видами, их икра издавна считается деликатесом (Лебская, 1999). Панцири и внутренности животных, содержащие пигменты (до 95% от массы тела животного), как правило, оказываются отходами производства, и не используются традиционной пищевой промышленностью.
Мировой рынок красителей постоянно растет вместе с технологическими и социальными изменениями, которые приведут к росту производства комбинированных продуктов во всем мире. Рынок натуральных красителей будет расти в глобальных масштабах быстрее, чем синтетических красителей из-за постоянного давления со стороны потребителей в пользу «натуральности» (Даунхэм, 2001).
Предложение использовать в качестве пигментсодержащего сырья местной сырьевой базы отходов переработки морских гидробионтов может решить проблему безотходных технологий на пищевых производствах.
Одной из основных биотехнологических проблем применения натуральных пищевых красителей является повышение их стабильности. В этой связи нами были проведены биотехнологические исследования по целесообразности применения липосом в качестве стабилизаторов пищевых красителей из морских гидробионтов. Липосомы - фосфолипидные самоорганизующиеся системы, применяются в основном в медицине для повышения эффективности транспорта и действия лекарственных препаратов.
Данная диссертационная работа посвящена экспериментальному обоснованию и разработке новых форм пищевых красителей из отходов переработки морских гидробионтов Str. intermedins и Sir. nudus.
Цель и задачи исследования Учитывая вышеизложенное, целью настоящей работы явились разработка биотехнологии стабильных пищевых
9 пигментов из отходов переработки морских ежей Str. intermedins и Str. nudus и изучение их качества и безопасности при изготовлении пищевых продуктов.
Достижение поставленной цели осуществляли путем решения следующих задач: выбор адекватных объектов и методов исследований; оценка сырьевого потенциала морских гидробионтов Str. intermedins и Str. nudus, как продуцентов биологически активных пищевых пигментов хиноидной природы на период до 2015 года; - установление особенностей химического состава, влияния на живые системы морских гидробионтов Str. intermedins и Str. nudus; * - обоснование и разработка биотехнологии стабильных липосом с пигментами; - разработка технологии безалкогольных напитков с использованием пигментов морских ежей в качестве пищевых красителей, характеристика их качества и безопасности.
Научная новизна и практическая значимость Дано комплексное научное обоснование применения отходов переработки морских ежей Str. intermedins и Str. nudus в качестве источников пищевых пигментов.
Разработана безотходная биотехнология получения стабильных пищевых красителей из отходов переработки морских ежей Str. intermedins и Str. nudus.
Проведена оценка безопасности пигментов морских ежей с использованием тест-культуры Tetrahymenapyriformis in vitro.
Разработана биотехнология конструирования мультиламеллярных липосом с пигментами хиноидной природы как способа их стабилизации в процессе хранения.
Научно обоснована технология безалкогольных напитков на основе липосом с пигментами морских ежей и дана характеристика их качества и безопасности.
В результате проведенных исследований разработана нормативная документация на «Экстракт концентрированный из морских гидробионтов» ТУ
10 9238 - 144 - 02067936 - 2005, получено положительное решение по заявке №
2004124260(026128), приоритет от 09.08.2004г. на изобретение «Инкапсулированный пищевой краситель и способ его получения».
Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедрах пищевой биотехнологии и товароведения и экспертизы продовольственных товаров Института пищевых технологий и товароведения ТГЭУ.
Основные положения диссертации выносимые на защиту
Продукты переработки морских ежей Str. intermedins и Str.nudus (панцири, иглы и внутренности) являются продуцентами натуральных пищевых пигментов и могут быть использованы в безотходных пищевых технологиях.
Пигменты Str.intermedins и Str.nudus являются безопасными и не разрушаются в процессе производства и хранения безалкогольных напитков.
Мультиламеллярные липо с омы из фосфолипидов сои способствуют повышению стабильности пигментов из отходов переработки морских гидробионтов при хранении.
Апробация работы Результаты настоящей работы были представлены и доложены на I и II Международном Симпозиуме «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2000, 2004); III Международной научно-практической конференции «Наука — Техника — Технология на рубеже третьего тысячелетия» (Находка, 2001); Форуме молодых ученых и студентов «Экономика и экономические знания на рубеже веков» (Екатеринбург, 2001); V Международной научно- технической конференции «Пища. Экология. Человек» (Москва, 2003); II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003).
Публикации Результаты работы отражены в 13 печатных работах, три из них находятся в печати.
Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов собственных исследований (главы 3-6), выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 150 страницах компьютерного текста и содержит 27 таблиц, 37 рисунков и приложения. Список использованной литературы включает 172 наименования российских и зарубежных авторов.
Химический состав и особенности фунщионалъного действия пигментов из морских организмов (ylocentrotus intermedius иylocentrotus nudus), перспективы их применения в пищевых технологиях
Современный тип иглокожих (Echinodermata) насчитывает более 6000 видов и делится на пять классов, один из которых морские ежи (Echinoidea). Многие виды для защитной окраски тела синтезируют хиноидные пигменты (Fox, 1974). Впервые свойства индивидуальных пигментов дал в своей монографии Томсон (Thomson, 1971).
Для названий этих соединений используют по сей день полутривиальную номенклатуру (Scheuer, 1973; Thomson, 1971) основанную на структурах нафтазарина и юглона.триоксиюглона (VII). В конце 60-х годов 20 века в Тихоокеанском Институте Биоорганической Химии ДВО РАН велись широкие исследования по изучению химии и биологической функции пигментов морских беспозвоночных, в частности морских ежей. Был осуществлен широкий скрининг среди иглокожих на наличие хиноидных пигментов (Уткина, 1977, 1979; Кольцова, 1977, 1978, 1983). Подобные структуры уже в те годы рассматривались как потенциальные антиоксиданты из-за присутствия в молекулах двух соседних фснольных гидроксилов.
Н.К. Уткиной (1979) были подробно исследованы пигменты морского ежа Strongylocentrotus intermedins, В составе пигментов этого животного обнаружены спинохромы А, В, С, Д, Е и эхинохром А, а также два б инафтохино н а.
Хиноидные пигменты панциря и игл морского ежа Strongylocentrotus nudus состоят в основном из спинохромов А, В ,С, Е и эхинохрома А, а также ряда минорных пигментов, являющихся производными нафтазарина (Кольцова, 1977).Работы по изучению биологической активности пигментов морских ежей впервые были проведены Н.К.Уткиной (1979). Ею было установлено, что большинство выделенных компонентов - пол игидроксилиро ванные производные нафтазарина - обладают высокой антиоксидантной активностью.
В настоящее время остро стоит проблема замены синтетических антиоксидантов в пищевой промышленности и медицине природными соединениями, натуральными компонентами пищевого назначения. Исследование влияния пищевых синтетических антиоксидантов на здоровье человека привело ныне к острейшему кризису в их производстве. Былиустановлены тяжелые отдаленные последствия хронического потребленияповышенных доз ионола и бутилгидроксианизола, наиболее известных и частоприменяемых пищевых антиокислителей.
В 1977 г. дальневосточными учеными был предложен патент "Способ стабилизации жиров и масел к окислению", где главную роль играл эхинохром А, который в несколько раз превышал антиокислительную активность широко используемого ионола, в модельных реакциях автоокисления минеральных, растительных масел и животных жиров (Максимов, 1977).
Изучение кинетики ингибирования этими веществами процессов окисления различных субстратов показало, что наиболее активен среди них эхинохром А (2,3,6-тригидрокси-7-этилнафтазарин).Работы Л.В. Богуславской (1985) с соавторами показали, что сопутствующие эхинохрому спинохромы, так же проявляют антиоксидантную активность в модельных реакциях окисления кумола. Их константы скорости реакции взаимодействия с пероксильным радикалом сравнимы или выше, чем для ионола. Наиболее эффективным оказался эхинохром в ряду (по убыванию): эхинохром А спинохром Е спинохром С спинохром Д спинохром А.
Установлен факт расходования полигидроксинафтохинонов (ПГНХ) в побочных реакциях, определены значения констант скорости с учетом этих реакций (по скорости расходования ингибитора), а также установлена зависимость между строением ПГНХ и величиной константы скорости на модели инициированного азодиизобутиронитрилом (АИБН) окисления этилбензола (Богуславская, 1988).Наиболее перспективными антиоксидантами являются эхинохром А и спинохром С, которые наряду с высокой эффективностью в реакции взаимодействия со свободными радикалами характеризуются наиболее низкой активностью в побочных реакциях.
Однако, эхинохром не только перехватывает свободные радикалы, но и прочно связывает ионы переменновалентных металлов, таких, как железо, медь, обычно служащих инициаторами свободно-радикальных окислительныхреакций в биологических системах. К тому же он активно ингибируетферменты арахидонового каскада, участвующие в развитии окислительногостресса.
Эти работы были проведены А.В. Лебедевым (1988, 1999) с соавторами. Изучалось антиоксидантное действие ПГНХ при окислении липосом из фосфатидилхолина (ФХ). Инициаторами окисления служили система Fe + -аскорбат и железо (ТІ) в составе гема — гематин.р-гидроксилы молекул ПГНХ играют ключевую роль в обеспечении эффекта ингибирования окисления липидов под действием как Fe , так и гематина. Они ответственны за связывание прооксиданта (Fe2+) в малоактивный комплекс и за перехват свободных радикалов. Спинохром С и эхинохром превосходят по антиоксидантной активности ионол в железо-аскорбатнои модели окисления, но уступают ему при катализе гемовым железом.В процессе окисления ряда сложных липидных субстратов природного происхождения эхинохром во много раз оказался эффективнее ионола. Этот факт объяснился возможностью эффекта синергизма ПГНХ с компонентами природных липидов (а-токоферолом, фосфолипидами) (Богуславская, 1990).Л,В. Богуславская с соавторами изучала совместное влияние ПГНХ и ФЛ на автоокисление метилолеата (МО). Выявлено, что в основе синергетических эффектов, вероятно, лежит возникновение комплексов ПГНХ с ФЛ и появление структурированных (мицеллиарных) образований.
В тех случаях, когда образующиеся комплексы обладают более выраженной способностью ингибировать процесс окисления МО, чем индивидуальные ПГНХ, добавки ФЛ действуют как синергисты.Таким образом, наблюдаемые синергетические эффекты зависят как от типа ФЛ, так и от уровня ненасыщенности содержащихся в них жирных кислот. Самый высокий эффект синергизма был установлен для смеси фосфатид ил этанол амина (ФЭ) и спинохрома С. Несколько меньший эффект
Выбор стандартных и общепринятых методов исследований
Эфирный экстракт отмывали водой от следов кислоты, сушили над прокаленным сульфатом натрия и концентрировали в вакууме при 40С. Выход пигментов оценивалит2 где пі] — масса, полученной суммарной фракции пигментов; т2 — масса исходного сырья.2. Выделение, очистка и физико-химические характеристики соевыхфосфолипидов
Фосфолипиды выделяли из отходов переработки соевого масла, произведенного ЗАО УМЖК «Приморская соя», это довольно доступное и дешевое сырье. Однако, оно нуждается в тщательной очистке, так как при создании липосом требуются основательно очищенные субстраты. На практике растительными фосфолипидными концентратами являются смеси, полученные из сырых масел путем гидратации горячей водой или горячими растворами электролитов, они содержат около 20% балластных веществ и до 55% фосфолипидов.
Известно несколько способов очистки фосфолипидных носителей липосом из природного сырья (Зильберс, 1981; Омельченко, 1990; Каленик, 1997). Основным их недостатком является многократное использование больших объемов этанола и горячей воды, это может привести к окислению фосфолипидов. По данным П.А. Лукьянова (1989), присутствие даже небольших количеств этанола в фосфолипидном носителе сильно изменяет, а именно расширяют, модельную мембрану. Кроме того, этанол сравнительно недешев и использование его в больших количествах значительно повышает стоимость целевого продукта. По этому мы решили воспользоваться схемой, представленной на рис. 2 (Каленик, 1997). При этом способе удается получить препарат, содержащий около 90 % целевого продукта и имеющий системы растворителей: в 1-ом направлении - хлороформ-метанол-28%аммиак (65:25:4, по объему) и во 2-ом направлении — бутанол-уксуснаякислота-вода (65:20:20, по объему) (Rouser, 1965; КеЙтс, 1975).
Специфическими индикаторами для обнаружения индивидуальных классов фосфолипидов служили: молибденовый реактив Дитмара и Лестера, модифицированный V.E. Vaskovsky (1975), проявляет фосфолипиды в виде синих пятен на желтом фоне; малахитовый зеленый в прописи V.E. Vaskovsky (1975) проявляет фосфолипиды в виде зеленых пятен; раствор нингидрина в ацетоне обнаруживает фосфолипиды со свободной аминогруппой в виде розовых пятен; реактив Драгендорфа идентифицирует холинсодержащие фосфолипиды, окрашивая их в оранжевый цвет.
Фракцию основного фосфолипида сои фосфатидилхолина для дальнейших исследований накапливали с помощью препаративной одномерной ТСХ в системе растворителей хлороформ-метанол-25% аммиак (65:25:4, по объему).
Массовую долю каждого фосфолипида определялиспектрофотометрическим методом на спектрофотометре «Specol» (Германия). Области силикагеля, соответствующие индивидуальному фосфолипиду, обкалывали специальной иглой, вырезали и переносили в пробирки из специального стекла «Пирекс» с последующим нагреванием в 57% растворе хлорной кислоты. После охлаждения добавляли реактив — индикатор фосфора и нагревали на кипящей водяной бане. Хроматографический силикагель осаждали центрифугированием при 30000 об7мин. в течение 15 мин. Супернатант колориметрировали при 815 нм на спектрофотометре «Specol» (ГДР).4. Определение относительной плотности ("Лурье, 2001) пикнометрическим методом. Тщательно вымытый и высушенный пикнометр взвешивали с точностью + 0,0001 г, заполняли его дистиллированной водой температурой 20 С немного выше отметки, закрывали пробкой и помещали на 30 мин в водяной термостат, температура воды в котором 20С. Через мин, не вынимая пикнометр из термостата, открыв пробку, устанавливалиуровень воды по верхнему краю мениска. Избыток воды убиралифильтровальной буагой с ровно обрезанными краями, свернутой в тонкуютрубочку. Горлышко пикнометра внутри также вытирали фильтрованнойбумагой, после чего пикнометр закрывали пробкой, вынимали из воды,вытирали досуха снаружи фильтровальной бумагой и взвешивали.
Взвешивание пустого пикнометра повторяли три раза и для вычислениябрали среднее арифметическое значение.
После этого воду выливали, пикнометр высушивали в сушильном шкафу при температуре не выше 80 С и охлаждали до комнатной температуры. Затем пикнометр наполняли красителем и взвешивали. Темперирование (доведение температуры исследуемой жидкости до 20С), установление уровня красителя, вытирание пикнометра проводили-так же, как указано выше.
Относительная плотность концентрированного красителярассчитывалась по формуле: D = (nil - mo) / (m - m0),где mi — масса пикнометра с испытуемым образцом, г; то — масса пустого пикнометра, г; m - масса пикнометра с водой, г.5. Определение концентрации красящих веществ (Лурье, 2001)
Отмеривали 1 см красителя и взвешивали на аналитических весах с точностью до +_0,0002 г, переносили в мерную колбу вместимостью 100 см , доводили до метки дистиллированной водой, перемешивали, отмеривали 10 см3, переносили в другую мерную колбу вместимостью 100 см3, вносили 5 см3 концентрированной соляной кислоты, доводили дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивали. Оптическую плотность стандартного раствора сульфата кобальта и раствора красителя определяли на КФК-3 с зеленым светофильтром в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм.Концентрация красящих веществ (г/дм ) рассчитывалась по формуле: K = 22Did/(mD0),
Характеристика безопасности отходов переработки морских ежей, используемых для получения пигментов
В условиях загрязнения окружающей среды качество и безопасность продукции всегда имеют первостепенное значение, в том числе, полученной с помощью биотехнологии.Эколого-гигиеническая безопасность пищевых ресурсов представляет важную современную проблему. В условиях техногенного и антропогенного загрязнений морские гидробионты способны сорбировать и аккумулировать многие токсичные неорганические и органические вещества. Биогеохимическая обстановка регионов, сложившаяся до начала 20 века, формировалась, в основном, за счет естественных процессов. В последующие годы, в результате роста хозяйственной деятельности человека, при несоблюдении природоохранных мероприятий на естественные процессы стали оказывать значительное влияние техногенные факторы (Кудряшева, 2000).
В Приморье в 20 веке, в связи с активной добычей руд цветныхметаллов, а также с другими видами хозяйственной деятельности существовали предпосылки повышенного содержания контаминантов в морской среде и гидробионтах. На побережье региона имелся ряд промышленных предприятий, с отходами которых контаминанты могут поступать в прибрежные воды и способствовать появлению зон с повышенным содержанием их в морской среде и организмах (Головин, 1995). Следует учесть, что в конце 20 века и начале 21 века ряд пищевых и перерабатывающих предприятий на побережье Приморского края прекратил свою производственную деятельность. Однако, не смотря на вышеуказанные факты, нами была проведена санитарно-гигиеническая оценка уровня безопасности пигментсодержащего морского сырья, выловленного в бухте Суходол Уссурийского залива.
Для оценки безопасности отходов переработки иглокожих были проведены исследования на соответствие гигиеническим требованиям СанПиН 2.3.2.1078 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы», В ходе исследований определяли содержание тяжелых металлов, радионуклидов, оценивали уровень контаминирующих микробиологических показателей во внутренностях, панцирях и иглах морских ежей Str.intermedius и Str.nudus.
На рис. 5 показаны уровни содержания тяжелых металлов во внутренних органах, панцирях и иглах морских ежей. Рисунок 5 - Уровни содержания тяжелых металлов во внутренних органах иполостной жидкости, панцирях и иглах морских ежей:1,5,9,13 - панцирь Str.intermedins; 2,6,10,14 - панцирь Str.nndns; 3,7,11,15 - внутренностиStr.intermedins; 4,8,12,16 - внутренности Str.nudns
Как следует из рис.5 наибольший уровень содержания у свинца (от 0,23 до 0,26 мг/кг, что составляет 2,7% от стандарта СанПиН 2.3.2.1078), а наименьший у ртути (от 0,001 до 0,003 мг/кг, что составляет 1,5% от стандарта СанПиН 2.3.2.1078).Таким образом, полученные результаты анализов исследуемых биообъектов на содержание контаминирующих токсичных элементов (Pb, As, Cd, Hg) во много раз меньше уровня стандарта, указанного в СанПиН 2.3.2.1078.
Следовательно, отобранные нами отходы переработки иглокожих являются благополучным по содержанию тяжелых металлов.Другим важным показателем при определении безопасности является уровень загрязнения сырья и пищевых продуктов радиоактивными элементами Cs-137 и Sr-90. СанПиНом 2.3.2.1078 рекомендовано определять содержание Cs-137 и Sr-90 с помощью метода измерения активности радионуклидов на сцинтиляционном гамма - спектрометре, что и было осуществлено нами. Результаты определения Cs-137 и Sr-90 представлены нарис.6.Рисунок 6 - Уровни содержания радионуклидов в исследуемых объектах: 1,5- панцирь Sir.intermedins; 2, 6 - панцирь Sir.nudus; 3, 7 - внутренности Str.intermedius;4, 8 - внутренности Str.nudus Из рис. 6 следует, что уровень содержания цезия-137 составил 17%, стронция - 90 0,65% от стандартов содержания радионуклидов, рекомендуемых СанПиН 2.3.2.-1078.
Таким образом, нами установлено, что содержание тяжелых металлов и радионуклидов в исследуемых объектах находится на очень низком уровне по сравнению с СанПиН 2.3.2.-1078, по-видимому, это связано с тем, что в районе вылова (бухта Суходол, Уссурийский залив) не ведется интенсивной хозяйственной деятельности человека, отсутствуют предприятия пищевой и перерабатывающей промышленности.
На следующем этапе диссертационного исследования оценивали уровень микробиологической безопасности по количеству:- мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ);- бактерий группы кишечной палочки (БГКП); - патогенных микроорганизмов, в том числе Salmonella и L. monocytogenes\- St.aureus;- сульфитреду пирующих клостридий.
Результаты исследований микробиологических показателей отходов переработки морских ежей помещены в таблицу 5.Таблица 5 — Микробиологические показатели безопасности исследуемых объектов (отходов переработки морских ежей)Анализ результатов микробиологической безопасности отходов переработки морских ежей представленный в таблице 5, показал, что в исследуемых образцах количество КМАФАнМ находится ниже допустимых стандартов СанПиН 2.3.2.1078. Полное отсутствие БГКП, патогенных микроорганизмов, St.aureus, сульфитредуцирующих клостридии указывает на безопасность используемого сырья.
По-видимому, полученные нами результаты можно объяснить отсутствием интенсивной хозяйственной деятельности человека в среде обитания морских ежей (бухта Суходол Уссурийского залива).Результаты проведенных нами исследований показывают, что отобранные объекты полностью удовлетворяют общим гигиеническим требованиям и безопасности и могут быть использованы в качестве сырья для производства натуральных красителей с целью использования в пищевой и перерабатывающей промышленности.
Таким образом, проведенные нами исследования показывают, что отходы переработки морских ежей ylocentrotus intermedins иylocentrotus nudus прибрежной зоны Японского моря являются перспективными источниками натуральных пищевых красителей красного цвета. Идентификацию функциональных групп в исследуемых пигментах осуществляли методом инфракрасной спектроскопии.Известно, что морские животные синтезируют соединения, отличающиеся большим разнообразием функциональных групп. Поэтому важным этапом структурного изучения таких веществ является функциональный анализ. Для того, чтобы установить какие именно структурные фрагменты имеются в изучаемом объекте, обычно используют ИК-спектроскопию. При расшифровке ИК-спектров пользовались справочными данными, изложенными в работах Р.Сильверстайна (1977), Г.Б.Елякова, В.А.Стоника (1986).Волновые числа характеристических полос поглощения в ИК-спектрах изучаемых пигментов из отходов переработки морских ежей StrJntermedius и Str.nudus представлены в таблице 6 с учетом рекомендаций Р.Сильверстайна (1977).
Оценка безопасности пигментов из морских гидробионтов биологическим методом на модели тест системы Tetrahymena pyriformis
Известно, что простейшие инфузории Tetrahymena pyriformis имеют адекватный человеку и высшим животным тип обменных процессов и ферментных систем (Игнатьев, І980). К настоящему времени известно значительное число научно - исследовательских работ с использованием в качестве тест — организмов биологических моделей - простейших, существуют также внедренные в практику пищевой и фармацевтической промышленности методики, применяемые для оценки степени токсичности и биологической ценности кормовых продуктов. Существуют методики оценки токсичности различных объектов на инфузориях Tetrahymena pyriformis, Paramecium caudatum и других видов простейших (Игнатьев, 1978, 1980; Виноходов, 1995).Выбор в качестве тест - объекта инфузорий терахимена был обусловлен тем, что, будучи одновременно клеткой и организмом, тетрахимена позволяет оценивать разнообразные воздействия, как на клеточном, так и наболее высоком уровне.
Высказывается мнение, что в основе этого механизма лежит способность веществ проникать внутрь организма и оказывать повреждающее действие на биологические мембраны (Шаблий, 1990).
В качестве положительных сторон использования инфузорий как биологического тест - объекта следует отметить простоту их культивирования, доступность методов работы с ними в любой санитарно-бактериологической лаборатории, возможность количественного учета эффекта воздействия изучаемых веществ (Этлин, 1984, 1987).
В работе использовали микроскоп «Ломо Микмед - 1», объектив 40, окуляр к7х, объект микрометр № 503719, цена деления 0,01 мм.Нами выявлены закономерности в росте культуры Tetrahymena pyriformis при добавлении красителя, и производился подсчет по длине и по ширине, выявляя закономерности. Эта процедура проделывалась трижды. Данные представлены в приложении 1 (таблицы 1, 2, 3) с учетом цены деления окуляра микроскопа. На основании полученных результатов строятся гистограммы (рис. 9-11):
На основании построенных гистограмм можно сделать вывод, что рост исследуемой культуры инфузории Tetrahymena pyriformis по виду гистограмм предположительно подчиняется нормальному закону распределения вероятности К. Пирсона, описанному в главе 2Необходимо проверить гипотезу о том, что результат измерения длины, ширины и отношения длины и ширины культуры также подчиняется нормальному закону распределения вероятности. При интерполяции данных, выяснилось, что /=7,5, это означает, что найденные значения )? должны быть меньше, чем Хо- тогда распределения действительно можно считать нормальным. Используя результаты вспомогательных вычислений (приложение 1), находится среднее арифметическое значение каждого результата измерения, стандартное отклонение результатов измерения. При использовании критерия К. Пирсона в каждом интервале должно быть неменьше пяти независимых значений результата измерения.Просуммировав данные из восьмой графы каждой таблицы (приложение 1) можно увидеть, что х xl- следовательно, соответствующая гипотеза принимается, и, можно сделать вывод, что распределение длины, ширины, а так же их отношение подчиняется нормальному закону распределения вероятности К. Пирсона. Проанализировав далее результаты по длине и ширине культуры, строили графики, из которых можно наглядно продемонстрировать достоверность исследуемых значений. На рис. 12-14. представлены графики зависимостей длины и ширины культуры.
Рисунок 14- График зависимости длины от ширины инфузории Tetrahymena pyriformis (Подсчет 3) Зависимости изображенные на рис. 12-14 являются логарифмическими функциями, описываются следующими уравнениями:Проанализировав графики, можно сделать вывод, что зависимость между длиной и шириной инфузорий представляет собой логарифмическую функцию, и что достоверность полученных результатов достаточна высока (р 0,05).Таким образом, рост инфузории Tetrahymena pyriformis подчиняется нормальному закону распределения вероятности Пирсона.
Из приготовленного концентрата красителя на основе экстракта пигментов морского ежа делали водные растворы с концентрациями (мг/см ) 5,0; 2,0; 0,8; 0,3; 0,03; 0,08; 0,01. В качестве контроля использовали пробирку с чистой культурой. Затем в пробирки с растворами по очереди добавляли несколько капель с чистой культурой Tetrahymena pyriformis.
По прошествию не менее 5 дней визуально (рис. 15) производили подсчет числа микроорганизмов Tetrahymena pyriformis в пробирках с растворами пигментов и сравнивали с контрольными пробирками. Вид Период в 5 дней достаточен для адаптации микроорганизмов и стабилизации их показателей роста и размножения. Результаты определения зависимости числа инфузорий от концентрации пигментов из отходов переработки морских ежей в водных растворах за весь период наблюдений помещены в таблицу 9.Таблица 9 - Зависимость числа инфузорий Tetrahymena pyriformis от концентрации пигментов морских ежей в водных растворах
