Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Аналитический обзор литературы 8
1.1 Рыбные шкуры: строение, состав, свойства 8
1.2 Характеристика структуры биополимеров рыбных шкур, их практическое значение и способы выделения
1.3 Рациональное использование рыбных шкур в различных отраслях экономики
ГЛАВА 2. Объекты, материалы и методы исследований 43
2.1 Характеристика объектов исследования 44
2.2 Схема экспериментальных исследований 46
2.3 Общие методы исследования 48
2.4 Сложные и специальные методы исследования 54
2.5 Статистическая обработка результатов эксперимента и моделирование рецептур 66
ГЛАВА 3. Исследование свежих (нативных) шкур прудовых рыб и свойств ферментных препаратов для их обработки 70
3.1 Характеристика химического и фракционного составов исследуемого сырья 71
3.2 Микроструктура нативных шкур прудовых рыб 72
3.3 Физико-химические свойства ферментных препаратов 77
3.4 Подбор концентрации ферментных препаратов 80
ГЛАВА 4. Исследование условий получения коллагена, гиа луроновой кислоты и готовых кож из шкур прудовых рыб 84
4.1 Разработка технологий выделения из шкур рыб гиалуроновой кислоты и коллагена 84
4.2 Применение физико-химических и биотехнологических методов модификации соединительной ткани рыб с целью выделения коллагена 92
4.3 Разработка технологии получения готовых рыбных кож 104
ГЛАВА 5. Комплексная оценка свойств коллагена, гиалуроновой кислоты и готовых рыбных кож. разработка рекомендаций по их использованию в частных технологиях 119
5.1 Исследование свойств гиалуроновой кислоты из шкур прудовых рыб 119
5.2 Исследование свойств коллагена из шкур прудовых рыб 121
5.3 Исследование показателей готовой кожи из шкур прудовых рыб 127
5.4 Применение гиалуроновой кислоты и коллагена в частных технологиях 133
Выводы 139
Список использованных источников 141
- Рациональное использование рыбных шкур в различных отраслях экономики
- Общие методы исследования
- Микроструктура нативных шкур прудовых рыб
- Применение физико-химических и биотехнологических методов модификации соединительной ткани рыб с целью выделения коллагена
Введение к работе
Актуальность работ ы Развитие прудового рыбоводства и аквакультуры в настоящее время является перспективными направлениями развития рыбного хозяйства, что подтверждается документами: «Водная стратегии Российской Федерации на период до 2020 года», «Стратегия развития рыбохозяйственного комплекса Российской Федерации на период до 2020 года », федеральной целевой программой "Повышение эффективности использования и развитие ресурсного потенциала рыбохозяйственного комплекса в 2009 - 2013 годах" и ряда других. По прогнозам Министерства сельского хозяйства в Воронежской области, производство товарной рыбы к 2014 г. вырастет на 28,6 % по сравнению с данными 2011 г., и составит 3500 тыс. т. Увеличение объема вылова рыбы еще острее ставит вопрос о глубокой переработке вторичных продуктов разделки (шкуры, кости, плавники, чешуя и т.д.), которые чаще всего выбрасывают на свалку, а, в лучшем случае, перерабатывают на кормовую муку или продают в качестве органических удобрений с/х организациям. Однако, например, шкуры можно рассматривать как полноценное сырье для получения биополимеров белковой (коллагеновые препараты) и углеводной (гиалуроновая кислота) природы и готовых кож. Коллагеновые препараты и гиалуроновую кислоту (ГУК) до сих пор получали из животного сырья (спилок шкур КРС, гребни птицы), но в настоящее время, в целом, Россия им- портозависима; у птиц - бройлеров гребней практически нет, а выделение ГУК из пупочных канатиков и синовиальной жидкости дорого для широкомасштабного использования. В то же время шкуры прудовых рыб - местный биоресурс, могут служить новым перспективным источником получения данных биополимеров.
Исследования в области комплексного подхода к глубокой переработке гид- робионтов развиты в работах Антиповой Л.В., Андреева М.П., Боевой Н.П., Васильевой Л.М., Ершова А.М., Ибрагимовой О.Г., Касьянова Г.И., Киладзе А.Б., Одинцова А.Б., Разумовской Р.Г., Розанцева Э.Г., Сапожниковой А.И., Сафронова Т.М., Сколкова С.А., Снежко А.Г. и др.
Исследования по теме диссертационной работы выполнялись в соответствии с тематикой НИР кафедры пищевой биотехнологии и переработки животного и рыбного сырья ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» «Технология живых систем в экологически безопасном ресурсосберегающем производстве и переработке животного сырья» (2011 - 2015 гг. №> гос. регистрации 01201121009).
Сотрудниками кафедры пищевой биотехнологии и переработки животного и рыбного сырья (исполнитель Хаустова Г.А., руководитель Антипова Л.В) был выполнен НИОКР «Новые объекты пресноводной аквакультуры для расширения сырьевой базы кожевенной промышленности» в рамках содействия финансированию малым формам предприятий в научно-технической сфере «У.М.Н.И.К» на 2010-2012 гг. (гос. контракт №> 7472р/10212 от 29.01.2010).
Диссертационное исследование соответствует п. 2 и п. 4 паспорта специальности 05.18.07 - «Биотехнология пищевых продуктов и биологически активных веществ».
Цель работы - расширение направлений использования шкур и ассортимента продуктов из прудовых рыб посредством методов биотехнологии.
В рамках поставленной цели были сформулированы и решались следующие основные задачи:
обоснование выбора сырья, характеристика химического состава рыбных шкур как источника биологических активных полимеров;
топографические и гистоморфологические характеристики рыбного шкуро- сырья;
анализ белковой и углеводной фракций шкур;
-обоснование параметров и режимов обработки шкур для получения коллагенов, ГУК, готовых кож;
исследование ферментной обработки, оптимизация комбинированной ферментной системы для получения готовых кож;
-идентификация и исследование свойств коллагенов, сорбционная емкость;
идентификация и исследование свойств гиалуроновой кислоты;
показатели качества готовых кож и технологии их выработки;
разработка практических рекомендаций по реализации частных технологий по использованию полученных биополимеров и технической документации на новые виды продукции;
оценка экономической эффективности новых технических решений, апробация результатов в производственных условиях.
Научная новизна.
Впервые использованы рыбные шкуры как источник получения гиалуроно- вой кислоты.
Уточнен фракционный и аминокислотный составы белков шкур, проведены морфологические исследования для идентификации белковых веществ.
Выбраны ферментные препараты, обоснованы условия, параметры и режимы ферментных технологий для получения коллагенов и готовых кож с заданными физико-химическими свойствами.
Обоснованы режимы новой комплексной технологии коллагенов, гиалуро- новой кислоты и готовых кож из шкур прудовых рыб, проведена комплексная оценка их свойств.
Подтверждено предпочтительное действие лимонной кислоты на степень растворения коллагена по сравнению с уксусной кислотой.
Показана возможность сорбции антибиотиков на белке-коллагене.
Практическая значимость. Определены параметры ферментативной очистки шкур от балластных примесей и параметры целенаправленной деструкции белков соединительной ткани с получением коллагена с высоким уровнем функционально-технологических свойств и готовых кож с высокими прочностными показателями.
Показано положительное влияние полученного коллагена на свойства фар- шевых систем с повышением их функционально-технологических свойств.
Разработанные технологии прошли промышленную апробацию на предприятии отрасли ВООИ «Синтез» и показали целесообразность и практическую значимость с эффектом снижения себестоимости выпускаемой продукции, повышением рентабельности производства за счет вовлечения невостребованного сырья в цикл производства продукции пищевого назначения. На новые виды продуктов разработаны проекты технической документации - ТУ 9261 - 001 - 02068108 - 2012- «Кожи рыбьи готовые», ТУ 9283-001-02068108-2012 - «Субстанция коллагеновая 2 % - я», ТУ 9285 - 001 -02068108 - 2012- «Кислота гиалуроновая из рыбных шкур».
Рациональное использование рыбных шкур в различных отраслях экономики
Коллаген относится к числу гидрофильных белков. Степень обводненности сухого коллагена в нативной шкуре - показатель, характеризующий свойства и поведение этого биополимера при различных технологических обработках.
Первая стадия поглощения воды характеризуется выделением тепла, сокращением объема системы коллаген + вода, потерей способности связанной воды растворять другие вещества и замерзать даже при температуре -20 С. Такая вода называется гидратационной. Она прочно связана с активными группами коллагена молекулярными силами аналогично связям, образующихся в гидратах, и не поддается отжатию из коллагена.
Взаимодействие воды с полярными группами коллагена уменьшает потенциальную энергию системы, молекулы воды принимают ориентированное (упорядоченное) положение в отличие от хаотического положения их в воде.
Гидратационная вода удерживается активными группами белка, главным образом водородными связями, взаимодействуя c-NH-группами и -СО- пептидных связей и -ОН-группами оксиаминокарбоновых кислот. Когда эти группы насыщаются, то вода начинает присоединяться к ионизированным -СООН" и -NH3+-группам боковых цепей, вызывает увеличение расстояния между главными цепями. Различные полярные группы присоединяют разное количество молекул воды: карбоксильные - три-четыре, гидроксильные - две-три, карбонильные — две, альдегидные - две, амино - одну-две, имино - две.
Вторая стадия поглощения воды коллагеном характеризуется значительным увеличением его объема. Вследствие молекулярно-кинетического движения молекулы воды равномерно распределяются между молекулами набухающего коллагена. Кислоты, некоторые нейтральные электролиты, щелочи значительно увеличивают набухание, так происходит раздвижение пучков, нарушается связь между структурными элементами коллагена [19,165,167].
По данным проф. Антиповой Л.В. и др. (2009 г.) [145] степень обводненности коллагена дермы карпа составляет 206 - 224 грамм на 100 грамм сухого коллагена рыбных шкур, для толстолобика и щуки соответственно 230 грамм и 295 -299 грамма.
По показателю степени обводненности коллаген рыбных шкур приблизительно соответствует данному показателю у наземных теплокровных животных. Прослеживается обратная зависимость обводненности коллагена от содержания липидов в шкурах. Вода, связанная с молекулой коллагена, ускоряет протекание всех химических процессов, протекающих с коллагеном при различных видах обработки: распад и образование новых связей, присоединение химических реагентов к активным участкам полипептидных цепей. Вода играет важную роль пластификатора и стабилизатора надмолекулярной структуры коллагена дермы.
Температура сваривания коллагена - термодеформационный показатель, который позволяет количественно характеризовать степень структурированности белка коллагена (для дермы рыб составляет примерно 56 - 58 С, это меньше, чем у млекопитающих (60 - 67 С)). Температура сваривания шкур рыб коррелирует с содержанием в составе коллагена оксипролина.
По показателю «температуры сваривания» (по степени структурированности коллагена) рыбное сырье можно поделить на две группы [123]: - высокая температура сваривания - 56 - 58 С - шкуры карпа, толстолобика; - средняя температура сваривания - 52-55 С - шкуры щуки. В аминокислотном составе коллагена (табл. 1.6) всегда присутствует окси-пролин, который является «меточкой» соединительной ткани, и отсутствует триптофана, называемый «меточкой» мышечной ткани. По количественному содержанию оксипролина рассчитывается содержание коллагена в любом образце. Это используют в биохимии при распознавании коллагена в различных органах и тканях, в пищевой промышленности - для обнаружения недопустимых продуктов в мясе, при производстве желатина - для контроля его чистоты его, при производстве кожи и меха - для установления наличия отходов. Структурные особенности и свойства коллагена, который считается одним из самых филогенетически древних фибриллярных белков и выполняет в организме механическую, питательную, защитную и репаративную функции, позволяют использовать его не только в медицине, но и в косметике [161].
Коллаген является нетоксичным, не канцерогенным, практически не антигенным препаратом, обладает хорошими гидратантными и регенерирующими действиями, имеет высокую биосовместимость, способность к комплексообразо-ванию и структурообразованию с биологически активными и лекарственными веществами, а также рядом других свойств.
Коллагеновые материалы применяют в медицине, пищевой промышленности, косметологии и других отраслях как дисперсии, пленки, формующие и бактерио-статические покрытия, функциональные добавки, это основано на использовании уникальных физико-химических и биохимических свойств коллагенов животных тканей и связано с переводом нативного коллагена в диспергированную форму растворением, при этом максимально сохраняя природную организацию макромолекул, необходимую для последующего восстановления развитой фибриллярной структуры. Учеными ВГУИТ, например, были получены коллагенсодержащие пленкообразующие композиции, выделяемые из жилок и сухожилий КРС, которые можно применять в технологии мясных и рыбных продуктов [40,42].
Гетерогенная белковая фракция с небелковыми веществами и особенностями морфологического строения рыбных шкур обусловливает необходимость проведения предварительных специфических операций очистки от балластных примесей и разрыхления их структуры, в основном за счет разрыва поперечных межфибриллярных связей путем химического (кислотное набухание, пероксидно-щелочно-солевая обработка) и/или ограниченного ферментативного гидролиза.
Наиболее значима практически обработка соединительной ткани, приводящая к дезагрегации надмолекулярных структур с образованием продуктов диспергирования коллагена двух типов: а) продукты денатурации, растворы которых состоят из частиц, утративших спиральную трехцепочечную структуру волокнистого коллагена (например, желатин); б) надмолекулярные агрегаты, состоящие из молекул коллагена, сохранивших структуру трехцепочечных спиралей. Их выделение осуществляют в одну стадию (напрямую из волокон и их агрегатов, которые подвергают измельчению) или за несколько стадий диспергирования. Для случая многостадийной обработки волокнистый (нативный) коллаген или раствор его молекул подвергают предварительному механическому, химическому или ферментативному воздействию.
К таким методам относят и термическую обработку в условиях сухого или влажного нагрева при высокой либо умеренной температуре, взаимодействие с химическими реагентами кислотного и щелочного характера (как правило, гидро-ксидом кальция), комбинированную щелочно-солевую обработку или водно-солевую экстракцию; физические методы (например, ионизирующие излучения, приводящие к различным деструктивным и модификационным изменениям в структуре коллагена), ультразвуковую обработку. С целью ускорения технологических процессов эффективным считается совмещение щелочно-солевой обработки и УЗ- воздействия [7,25,118].
Способность коллагена дезагрегатизироваться при воздействиях высокой температуры широко применяется при обработках коллагенсодержащего сырья для получения клея, желатинов, бульонов и в ряде других традиционных технологических процессов мясной и рыбной промышленности. Необходимо выделить, что этот способ не применяют для переработки источников коллагена животного происхождения в биоматериалы различного назначения, где нашли реализацию два основных подхода:
Общие методы исследования
ПРК возможно получать по технологии [90, 107]: коллагенсодержащее сырье измельчают на частицы размером 3 -4 мм, промывают холодной водой, частично обезжиривают, после проводят солево-щелочную или ферментативную обработку. Чаше применяют 10 - 13 % раствор щелочей в насыщенном растворе сернокислого натрия. В данном растворе кусочки коллагенсодержащего сырья выдерживают от 20 до 24 часов, после чего проводят их промывку полунасыщенным раствором сернокислого натрия. Для нейтрализации оставшейся щелочи используют соляную кислоту. После проточной водой промывают уже набухший коллаген и измельчают его на частицы размером 1-2 мм. Процесс растворения коллагена осуществляют раствором какой-нибудь органической кислоты (уксусной, молочной и т.д.) подобранной оптимальной концентрации. Гомогенизируют ПРК обычно через капроновую ткань [8].
В нашей стране в 70-80 годы учеными Л.П. Истрановым, О.О. Баблояном и др. осуществлялись работы по получению ферментнорастворимого коллагена (ФРК). В РФ веский вклад к рациональному использованию коллагенсодержащих отходов и получению на их основе пищевых и биологически активных добавок, покрытий, ингредиентов, композитов внесли ученые - Л.В. Антипова, Н.Н. Липатов, А.И. Жаринов, И.А. Рогов, А.Б. Лисицын, А.Г. Розанцев, А.И. Мглинец, Г.И. Касьянов, А.Л. Кудряшов и др. В 1960-х гг. Каспарьянц С.А. и др. был предложен метод получения высококонцентрированной нейтральной дисперсии коллагена. Данный способ позволяет получать высоковязкие концентрированные дисперсий коллагена с содержанием сухого вещества 7-12 %, в то время как кислые продукты растворения коллагена имеют концентрацию не более 1,5-2 %. Множество способов для получения коллагеновых дисперсий с использованием ферментных препаратов разработано в Болгарии. В одном из них предлагается растворять коллагенсодержащие отходы овчины с помощью ферментного препарата субтилизин. Раствор для обработки содержит карбонат натрия, ферментный препарат, консервирующие вещества, хлорид кальция, рН поддерживают в пределах 8.4-8.7. К применяемому раствору добавляют уксусную кислоту до концентрации 0.05М для инактивирования ферментного препарата и переведения коллагена в раствор. Продолжительность обработки в среднем 48 час. Полученную дисперсию центрифугируют, подвергают нейтрализации до рН= 7.3-7.6. Преимуществом данного способа является отсутствие обезволашивания отходов и предварительного измельчения [98].
Немцами предложен способ, в котором овчину обрабатывают аналогичным составом. После обработки ферментом проводят промывку с целью для удаления неколлагеновых белков, а потом обработку 0.5%-м раствором уксусной кислоты в течение 0,5 часов, далее сырье помещают в 0,05 М раствор уксусной кислоты.
Сходный способ [103] основан на обработке коллагенсодержащего сырья раствором щелочи, с содержащейся в нем бактериальной протеазой (или панкреатином), бикарбонатом натрия, натриевой солью глютаминовой кислоты и неионо-генным ПАВ, рН=7.5-8. Далее осуществляют нейтрализацию молочной кислотой до рН=3,2.
В России предложен способ получения дисперсии коллагена ферментной. В данном способе подвергают механическому измельчению, заливают раствором поваренной соли для удаления неколлагеновых белков, промывают холодной проточной водой. Далее сырье помещают в 0,04 н раствор соляной кислоты рН =1,6, в котором присутствует пепсин в дозировке 1,5 % от массы белка, процесс проводят при температуре 26 - 28 С, постоянно перемешивая. Дерма телят после 24 часов гидролиза переходит в раствор на 95 %, гольевой спилок шкур КРС и дерма растворяются полностью после 120 часов обработки. После частичного гидролиза проводят инак-тивирование ферментного препарата, результатом которого является волокнистая коллагеновая масса, которую затем отфильтровывают [69,91,99].
В способе, предусматривающем использование в качестве сырья шкуры рыб [99], проводят промывку рыбного сырья, его измельчение, последовательную об 28 работку раствором хлористого натрия, водой, раствором ферментного препарата, промывку твердой фракции водой для удаления балластных веществ и остатка фермента и диспергирование. В качестве рыбного сырья используют шкуру прудовых рыб. Твердую фракцию обрабатывают раствором коллагеназы, состоящем из 1-й части ферментного препарата и 3-х частей воды. Процесс замачивания ведут 12 ч при температуре 4 - 6 С и соотношении твердой фракции и водного раствора ферментного препарата, соответственно, 1 : 2. Далее осуществляют промывку твердой фракции холодной проточной водой для удаления балластных веществ и остатков фермента. После добавляют изолированный соевый белок, лед, взятые в соотношении, соответственно, 10,0 : 0,5:2,5. Полученную массу измельчают на куттере до сметанообразного состояния, в конце процесса добавляют хлористый натрий из расчета 2,5 % к массе полученной эмульсии [54].
Растворимый коллаген можно разделить на два основных класса. Коллаген, полученный прямым экстрагированием соединительной ткани относят к первому классу. Также выделяют кислоторастворимый и нейтрально-солерастворимыи коллаген, которые экстрагируют, соответственно, кислыми буферами и нейтральными солевыми растворами. Ко второму классу относят растворы зрелого коллагена, получаемые после предварительной ферментативной, химической и механической обработки тканей [120,121].
Способы растворения, предусматривающие ферментную обработку, дают возможность получать коллаген с хорошей волокнообразующей способностью. Стари и Кюхн доказали, что коллагеназа из Clostridium histolytium разрушала натив-ный растворимый и нерастворимый коллаген. В Америке запатентован способ очистки коллагена от балластных белков (эластина, ретикулина и др.) с помощью ферментных препаратов заданного действия [150, 156]. Чаще всего для перевода коллагена в состояние растворения осуществляют ряд последовательных операций. Так примером такой комплексной обработки является способ, предусматривающий очистку соединительной ткани от неколлагеновьгх компонентов, заморозку, измельчение и последующую обработку 0,1 М раствором №зР04 и 10 %-ным хлористого натрия. Продукты, полученные описанным методом, промывают, отжимают и приготавливают дисперсию с 0,3 % сухого остатка [119,129]. Применение щелочно-солевого метода позволяет получать астворенный коллаген [92,118],который можно использовать в медицинской промышленности, например, при изготовлении протезов полых органов, гемостатических губок, пленок и т.д. Пленки возможно получать путем высушивания на воздухе тонкого слоя растворов коллагена, с определенным значением рН, применяя при этом лекарственными веществами или и вовсе без них. Для приготовления основы для мази используется порошок диспергированного коллагена, который получают низкотемпературным измельчением, в концентрации от 2 до 5 %. Более высокая-концентрация приводит к получению плотной густой массы, применяемую как основа для изготовления свечей [31, 32,64, 68, 127].
Микроструктура нативных шкур прудовых рыб
Идентификацию продуктов и сорбционные свойства коллагена определяли методом инфракрасной спектроскопии [34]. ИК-спектры коллагеновых фракций и ГУК снимали на многофункциональном ИК-спектрофотометре Specord М-80 (Германия) и Vertex-70 в диапазоне 4000-400 см"1.
Исследуемые образцы сушили до значения постоянной массы при температуре 37 С для удаления свободной воды, далее проводили измельчение в вибраторе фон Ардена в течение 4 мин., взвешивали 1,5 мг образца и 9,5 мг подготовленного КВг, мешали, брали 2 мг полученной порошкообразной смеси и помещали в пресс-форму, где путем вращения пуансона выравнивали поверхность смеси. Дальше смесь подвергали прессованию (при давлении 150 кг/см ) в течение 10 мин. Получившуюся таблетку, имеющую диаметр 3 мм, вставляли во внутренние направляющие держателя спектрофотометра. Все время проведения процесса влажность воздуха в помещении не должна превышать 75 %.
Рассмотрение спектра начинали с области больших значений волновых чисел, ориентировочно 4000 - 2500 см"1. В этой спектральной области проявляются валентные колебания О-Н-, N-H- и С-Н-связей.
Колебания свободных, не образующих водородных связей О-Н-групп, проявляются в виде узкой полосы средней интенсивности в области 3800-3650 см 1. В этой области О-Н-группы проявляются редко, что обусловлено стремлением соединений, содержащих О-Н-группы, образовывать водородные связи. Включение О-Н-групп в систему водородных связей смещает сигнал в область 3600-3200 см 1 и значительно его уширяет.
Валентные колебания N-Н-связей наблюдаются в области 3400-3200 см", соответствующая им полоса поглощения имеет среднюю интенсивность, из-за меньшей склонности к образованию водородных связей - небольшую полуширину. Положение полос, соответствующих валентным колебаниям С-Н-связей зависит от гибридизации атома углерода.
Спектральная область (2400 - 1900 см"1) является бедной на сигналы. К характеристическим колебаниям, проявляющимся в этой области, относят валентные колебания тройных связей C=N и С=С. Положение и интенсивность полосы, соответствующей колебаниям C N-связей, зависит от прочности образуемых азотом координационных связей, а интенсивность полосы, соответствующей колебаниям С=С-связи - от симметрии молекулы относительно нее.
Определение безвредности и биологической активности проводили на биотесте (культура Paramecia caudatum) [17]. В качестве биотеста использовался легко культивируемый свободноживущий одноклеточный организм -Paramecia caudatum, который очень чувствительно реагирует на активные вещества, которые могут содержаться в испытуемых объектах и отражает их отношение к жизнеспособности организма. Качество и количество пищевого субстрата напрямую влияет на скорость течения процессов жизнедеятельности биотеста.
Экспресс-биотест обычно состоит из трех основных этапов: -1 этап - оценивают биологическую активность исследуемого объекта. Получают разведение 1:1000. Готовят пробы с разведениями исследуемого объекта 1:10000, 1:100000, 1:1000000,а состояние инфузорий оценивают через 0,5; 1,0; 3,0; 6,0 и 24,0 часа культивирования при температуре 25 С. Выделяют следующие критерии оценки состояние инфузорий по их количеству и характеру движений: ИН - индифферентность - клетки совершают равномерные броуновские движения; БА - биоактивность - движения клеток изменены; БЦ -биоцидность, токическое действие: БЦ-50 -погибло 50±10 % клеток, БЦ-100 -погибло 100±10 % клеток. - II этап - оценивают биологическую активность исследуемого объекта методом разрешающего воздействия. Суть метода - выявление с помощью дополнительного разрешающего неблагоприятного фактора биологического действия заданного объекта на механизм адаптации и резистентности клетки.
Нами использовалась культура инфузорий из первого этапа, контактировавшая с разными концентрациями исследуемого объекта в течение 24 часов. Устанавливали время гибели 100 % клеток под действием 8 %-го раствора поваренной соли.
Культуру инфузорий в экспоненциальной фазе роста вносят в заранее подготовленные образцы, определяют плотность инокулята, далее культивируют при температуре 25 С в течение 72 часов. По истечению времени культивирования определяли плотность инокулята.
Степень влияния заданного объекта на механизм размножения характеризуется величиной индекса интенсивности размножения в сочетании с его концентрацией в среде [35].
Для пористых материалов (например, кожа и кожевая ткань меха) характерно наличие кажущейся и истинной плотности [50].
Отношение массы образца кожи к его полному объему, включающему объем пор называют кажущейся плотностью, она пропорциональна объему пор в коже, и зависит от вида сырья и технологии производства.
Если условия производства одинаковы, то кожи, которые выделывают из рыхлого кожевенного сырья, имеют меньшей значение кажущейся плотности. Разнообразные технологические операции, в которых происходит разделение структуры дермы (пикелевание и др.), тоже способствуют уменьшению кажущейся плотности кожи и кожевой ткани.
Величина кажущейся плотности позволяет судить о способности кожи пропускать воздух, воду, тепло, так как она связана с пористостью. Чтобы определить кажущуюся плотность надо знать массу образцов и их объем. Истинная плотность кожи - отношение массы образца к объему его плотного вещества (без пор). Истинная плотность кожи пропорциональна плотности входящих в нее составных частей: жировых веществ, наполнителей, гольевого вещества и т.д. Для определения истинной плотности объем плотного вещества измеряли погружая измельченный образец в жидкость, которая заполняет поры и не вызывает при этом набухания кожи и вымывания ее составных частей. Керосин чаще всего используют для этого.
Для испытания кожу необходимо измельчить на куски шириной 2-3 мм и длиной 20 см, затем 5 - 10 г измельченного образца, взвешенного на технических весах, вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, который затем запол-нялют до метки керосином из бюретки. Замеряют объем прилитого керосина Vi, а пикнометр прикрывают пробкой и оставляют на 24 часа. За это время поры кожи заполняются керосином, и в пикнометре устанавливается определенный и не изменяющийся его уровень. Затем в пикнометр вновь наливают керосин до метки, замеряя при этом его количество V2.
Величина разницы между объемом пикнометра Vo и объемом керосина, который вливали в него оба раза, и есть истинный объем плотного вещества кожи.
Керосин из пикнометра сливают, кожу раскладывали на фильтровальной бумаге и, не отжимая, удаляли с ее поверхности избыток керосина. Затем все кусочки перекладывали в тот же пикнометр, заранее подсушенный, и наливали в него керосин до метки.
Величина разницы между объемом пикнометра Vo и объемом влитого в этот раз керосина V3 равняется значению объема плотного вещества кожи плюс объем их пор, т. е. кажущемуся объему Vk Плотность кожи, объем U пор и пористость Р рассчитывали по величине истинного и кажущегося объемов:
Применение физико-химических и биотехнологических методов модификации соединительной ткани рыб с целью выделения коллагена
Изучение научно-технической литературы показало, что большинство методы получения гиалуроновой кислоты и коллагена продолжительны во времени, неэкологичны, перегружены рядом лишних операций [98,99, 103,107].
В настоящее время повсеместно применяются ферментные препараты, имеющие широкую субстратную специфичность, приемлемые диапазоны технологических параметров (температура, рН среды), что и приводит к отсутствию нежелательных экологических воздействий и дополнительных затрат.
Выявление оптимальных условий получения очищенного коллагена и гиалуроновой кислоты представляет собой задачу, которая обуславливает селективное выделение биопрепаратов - ГУК и коллагена, связанное прежде всего с разрушением белково-липидных и белково-углеводных комплексов сырья, а также удалением сопутствующих липидов и углеводов.
Патентный поиск показал, что некоторые методы препаративного получения ГУК включают приемы, неизбежно ведущие к ее деполимеризации и сильно перегружены рядом лишних операций. В то же время большинство из них не дает гарантии полной очистки ГУК от белка [101,102].
Для разработки более рационального способа получения гиалуроната необходимо учитывать чувствительность его, как полимера, к разным воздействиям из вне, избегая тех процедур, которые могут привести к деполимеризации. Основные моменты, которые необходимо учитывать при получении ГУК: - при приемке сырья нужно устранить возможность присутствия гиалуронидазы и предупредить энзиматическую деградацию гиалуроновой кислоты. - гиалуроновая кислота является чувствительной к сдвигам рН и температуры, при которой происходит экстрагирование, поэтому важным является проведение экспериментов для выбора оптимального режима экстрагирования. - при выделении биопрепарата необходимо предупредить возможность загрязнения ее нуклеиновыми кислотами. Так как нуклеиновые кислоты экстрагируются вместе с гиалуроновой кислотой из ткани, поэтому надо использовать экстрагент, в котором нерастворимы ядерные нуклеопротеиды. - наличие белка в экстрактах с гиалуроновой кислотой устраняется применением органических растворителей.
В настоящее время имеются данные, что высокий эффект достигают тем, что не только не очищают гиалуроновую кислоту от белковых веществ, а, наоборот, дополнительно вводят в нее разные белки.
Проведенный анализ литературы показал, что для получения ГУК может быть использованы различные способы: щелочной экстракции, водного экстрагирования с добавлением хлороформа и т.д. Однако все они характерны присутствием значительного количества токсичных растворителей [29].
Анализ других литературных источников свидетельствует о том, что экстрагирование ГУК вполне может происходить водным способом с образованием вязких растворов, учитывая биологические свойства кислоты [93].
На кафедре пищевой биотехнологии и переработки животного и рыбного сырья ВГУИТ несколько лет назад была разработана технология получения ГУК методом водного экстрагирования из гребней петухов [102].
Предлагаемая модифицированная технологическая схема получения гиалуроновой кислоты из шкур прудовых состоит из последовательных операций. Прием и промывку шкур проводили в проточной воде с температурой 10-15 С, так как цель данной операции состоит, прежде всего, в механической очистке от загрязнений и слизи, скапливающихся на сырье, то достаточным будет использование холодной проточной воды, дополнительные затраты на подогрев воды не требуются. После промывки проводили очистку от прирезей мяса и чешуи, использование в качестве сырья шкур, снятых с тушек шкуросъемными машинами, практически исключает очистку от прирезей мяса, а имеющиеся данные о содержании коллагена в чешуе рыб [14, 25] свидетельствуют о том, что можно использовать шкуры с чешуей. Далее проводили измельчение сырья. Грубое измельчение структуры тканей не дает достаточного выхода препарата. Поэтому рекомендуется использовать последовательно грубое и тонкое измельчение. Тонкое измельчение осуществляли на волчке с диаметром решетки 2-3 мм. Поскольку ГУК хорошо растворяется в теплой воде, далее проводили водную экстракцию в термостате.
В процессе водного экстрагирования значительное влияние на выход ГУК оказывает температура (рис. 4.1). Отмечено, что при достижении температуры 40 С наблюдается максимальный выход биополимера, причем, дальнейшее увеличение температуры не приводит к существенному изменению выхода ГУК, но создает условия для развития денатурационных и коагуляционных процессов, снижающих чистоту и качество препарата. Кроме того, значительное повышение температуры выше 40 С, приводит к невозможности дальнейшего получения коллагена, так как температура сваривания коллагена дермы рыб порядка 55-58 С [123].
Экстрагирование проводили при температуре 40 - 45 С при гидромодуле 1 : 2 в течение 40 мин с периодическим помешиванием. Затем жидкость не 87 сколько раз декантировали и отфильтровывали. Твердая фракция пригодна для выделения коллагена, гиалуроновую кислоту из жидкой фракции осаждали этиловым спиртом с массовой долей 96 %. На этой стадии важно определить рациональный объем органического растворителя, для этого исследовали показатель вязкости раствора, известно [23, 29], что чем выше концентрация ГУК в растворе, тем выше будет значение вязкости. Результаты исследований изменения вязкости раствора гиалуроновой кислоты от количества внесенного этилового спирта показывают, что максимальный выход препарата наблюдается при соотношении водный раствор: спирт равном
