Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Анализ состояния вопроса 10
1.1. Характеристика молочной сыворотки как сырья для получения биологически активных веществ, добавок к пище и регуляторов роста растений 10
1.2. Классификация, характеристика и особенности свойств биологически активных добавок к пище (БАД) 16
1.3. Фитохимический состав эхинацеи пурпурной и ее биологическая активность 27
1.4. Современные технологии получения, характеристика и биологическая активность препаратов растительного происхождения, применяемых в сельскохозяйственной и пищевой биотехнологии 38
Глава 2. Организация работы и методы исследований 45
2.1. Объекты и методы исследований 45
2.2. Биохимические, микробиологические и токсикологические методы исследования 49
2.3. Физико-химические методы исследования биотехнологических алюмосиликатных сорбентов 58
Глава 3. Разработка технологии получения пищевой добавки из эхинацеи пурпурной в сочетании с молочной сывороткой 62
3.1. Обоснование использования молочной сыворотки в качестве сырьевого ресурса для получения пищевых добавок и регуляторов роста растений 62
3.2. Получение экстракта и лиофилизированной формы эхинацеи пурпурной 68
3.3 Исследование химического состава и биологической ак- 80 з тивности пищевой добавки из эхинацеи пурпурной в сочетании с молочной сывороткой
3.4. Токсикологическая оценка пищевых добавок из эхинацеи пурпурной в сочетании с молочной сывороткой 90
3.5. Моделирование взаимосвязи структура-активность производных коричной кислоты на основе квантово-химических и топологических дескрипторах 92
Глава 4. Разработка технологии получения регуляторов роста растений на основе эхинацеи пурпурной и молочной сыворотки 102
4.1. Биотехнологии регуляторов роста растений на основе мо-лочно-растительных экстрактов с применением методов ферментации и сорбции 102
4.2. Разработка технологии регуляторов роста растений на основе молочной сыворотки и эхинацеи пурпурной с применением наносорбционных материалов 125
Глава 5. Разработка биотехнологий регуляторов роста растений, экономическая эффективность их производства и применения в растениеводстве 13 7
Выводы 151
Библиографический список 153
Приложения 171
- Классификация, характеристика и особенности свойств биологически активных добавок к пище (БАД)
- Биохимические, микробиологические и токсикологические методы исследования
- Получение экстракта и лиофилизированной формы эхинацеи пурпурной
- Разработка технологии регуляторов роста растений на основе молочной сыворотки и эхинацеи пурпурной с применением наносорбционных материалов
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема качества и безопасности пищевой продукции актуальна в России и за рубежом, поскольку практически во всех странах мира наблюдается тенденция к ухудшению экологической обстановки из-за антропогенной деятельности человека.
В настоящее время общепринято, что питание является одним из главных факторов, определяющим здоровье человека. В соответствии с этим в России активно осуществляется реализация национальных проектов в области АПК и медицины, что направлено на разработку технологий получения пищевых продуктов нового поколения, в том числе общего и функционального назначения.
Во всем мире диетологи рассматривают целевое питание как источник пищевых веществ в организме. Концепция специального питания, сформулированная Министерством здравоохранения России, предусматривает использование биологически активных добавок к пище, представляющих собой концентраты натуральных или идентичных натуральным биологически активных веществ, предназначенных для введения в состав пищевых продуктов с целью обогащения рациона питания человека.
Актуальным представляется разработка способов получения пищевых добавок из экологически безопасных сырьевых ресурсов, к которым относятся лекарственные растения, животные ткани, продукты пчеловодства, морепродукты. В современной литературе имеются ограниченное число публикаций по получению биологически активных пищевых добавок из лекарственных растений.
В области сельскохозяйственного производства зерна высокого качества актуальным представляется поиск наиболее перспективных сырьевых источников для получения регуляторов роста растений нового поколения, применяемых в современных технологиях возделывания зерновых культур.
Одним из перспективных сырьевых ресурсов в данном направлении, содержащим комплекс биологически активных веществ и рациональным по экономическим показателям является молочная сыворотка. В России впервые осуществлена разработка регулятора роста растений «Стимолакт» методом ферментации экстрактов из зверобоя продырявленного энзимами молочной сыворотки и показана эффективность применения препарата в технологии возделывания озимой пшеницы (патент РФ № 2280362 от 04.10 2004, опубл. 27.07.2006, БИ № 21, авторы Брыкалов А.В., Плющ Е.В., Храмцов А.Г.)
В связи с этим разработка технологий получения регуляторов роста на основе композиций экстрактов лекарственных растений и молочной сыворотки имеет научно-практический интерес, актуальное значение в направлении прикладных аспектов биотехнологии.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось проведение системных исследований по разработке технологии получения из молочной сыворотки и эхинацеи пурпурной пищевой добавки, регуляторов роста растений, изучение их состава, биологической активности.
Задачи исследования:
обосновать применение молочной сыворотки для получения пищевых добавок и регуляторов роста растений;
провести скрининг растительных объектов, содержащих производные коричной кислоты, флавоноидов, дубильных веществ;
разработать технологию получения из эхинацеи пурпурной биологически активной добавки к пище на основе метода водно-спиртовой экстракции;
изучить химический состав и биологическую активность пищевой добавки из молочной сыворотки и эхинацеи пурпурной;
получить сорбенты, применяемые в разработанных биотехнологиях, исследовать их состав, структурные характеристики; провести анализ ИК-спектров, изучить кислотно-основные свойства поверхности;
- разработать технологию получения регулятора роста растений мето
дом ферментации экстракта из эхинацеи пурпурной энзимами молочной сы
воротки, изучить состав, провести стандартизацию;
осуществить разработку технологии получения регуляторов роста растений різ молочной сыворотки и эхинацеи пурпурной, включающей введение в препараты природных и синтетических нанокомпонентов, исследовать их состав, биологическую активность;
оформить и утвердить техническую документацию на разработанные регуляторы роста растений;
исследовать биологическую активность препаратов на основе молочной сыворотки и эхинацеи пурпурной в лабораторных, полевых условиях с оценкой экономической эффективности применения в растениеводстве.
Научная концепция работы заключается в обосновании принципов и методов исследований биотехнологического потенциала молочной сыворотки, эхинацеи пурпурной и эффективное применение их нутриентов в разработке биотехнологии пищевой добавки и регуляторов роста растений.
Научная новизна работы. Разработана биотехнология получения пищевой добавки из эхинацеи пурпурной в сочетании с молочной сывороткой. Установлен ее комплексный состав по биологически активным веществам, токсико-гигиенические и биологические показатели.
Осуществлена разработка технологии получения регулятора роста растений на основе ферментации экстракта эхинацеи пурпурной молочной сывороткой. Планированием и проведением многофакторного эксперимента оптимизирована стадия экстракции биологически активных веществ - гид-роксикоричных кислот - с получением адекватных уравнений регрессии. Осуществлена стандартизация препаратов по содержанию гидроксикорич-ных кислот, флавоноидов, антоцианов и микроэлементов.
Получены биотехнологические сорбенты на алюмосиликатной основе, исследованы их структурные и физико-химические характеристики, топо-
7 графия поверхности. Определены количественные показатели ионообменной активности кислотных центров, установлена эффективность применения сорбентов в технологии получения из молочной сыворотки и эхинацеи пурпурной фитопрепарата с полифункциональными свойствами.
Впервые разработана технология получения регуляторов роста растений из молочной сыворотки и эхинацеи пурпурной, включающая введение в препараты природных и синтетических нанокомпонентов, исследован их состав, биологическая активность. Выявлен эффект синергизма совместного действия нанокомпонентов фракции размола виноградных семян и углеродных нанотрубок с биологически активными веществами молочной сыворотки и экстракта эхинацеи пурпурной, который проявляется в увеличении рос-тостимулирующей активности препарата при действии на семена агрокультуры.
Новизна предложенных технологических решений подтверждена патентом РФ на изобретение № 2325807 и положительным решением о выдаче патента на изобретение № 2007123091/15 (025139) от 31.03.2008.
Практическая значимость. Проведена стандартизация пищевой добавки на основе молочной сыворотки и экстракта эхинацеи пурпурной по содержанию биологически активных веществ - производных коричных кислот, флавоноидов, дубильных веществ, установлены их биоантиоксидант-ные свойства.
Разработана технология получения из молочной сыворотки и эхинацеи пурпурной комплексных регуляторов роста растений с полифункциональной активностью, ростостимулирующими и антимикробными свойствами, с определением условий сохранения стабильности свойств препарата в растворимой и лиофилизированной форме.
Разработанные регуляторы роста растений из эхинацеи пурпурной прошли производственные испытания с положительным заключением в СХП «Новомарьевский» Шпаковского района, СПК «Мелиоратор» Труновского
района Ставропольского края, стандартизованы и рекомендованы к использованию на стадиях вегетации и для предпосевной обработки семян зерновых агрокультур с пленкообразователем «Алкил-агро», на который разработаны и утверждены ФГУ «Ставропольский ЦСМ» ТУ 2484-001-306263507600127-2006, а также разработаны ТУ 2389-002-306263507600127-2007 на препарат «Бишостим», содержащий микроэлементы.
На VIT Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, февраль 2007 г.) разработка «Биотехнология получения препарата с полифункциональным действием «Стимокор» награждена дипломом и серебряной медалью. На Международной выставке-конгрессе «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции» (Санкт-Петербург, октябрь, 2007) получен диплом за работу «Разработка биотехнологии препаратов растительного происхождения с ростостимулирующей активностью с применением нано-сорбционных материалов» в номинации «Лучший инновационный проект в области технологий живых систем».
Основные положения диссертации использованы в учебном процессе по курсу «Основы биотехнологии» для студентов биологических специальностей Ставропольского государственного аграрного университета.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология 2003» (Сочи, 2003); 50-й научной конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2005); Международной научной конференции «Фитопатоген-ные бактерии. Фитонцидология. Аллелопатия» (Киев, 2005); III Международной научно-практической конференции «Проблемы экологической безопасности и сохранение природно-ресурсного потенциала» (Ставрополь, 2006); II Международной конференции «Проблемы экологической безопасности и сохранения природно-ресурсного потенциала» (Ессентуки, 2006); Международной научной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения академика Гродзинского A.M., «Аллелопатия и современная биоло-
9 гия» (Киев, 2006); Международном симпозиуме по нанобиотехнологиям «Nanobio 6» (Санкт-Петербург, 2006); IV Международной научной конференции «Производственные технологии» (Италия, 2006); II Международной научной конференции «Современные наукоемкие технологии» (Испания, 2006); II Международной научной конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Куба, 2007); 52-й научной конференции «Университетская наука — региону» (Ставрополь, 2007); Международной конференции «Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие регионов Юга России» (Сочи, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 в реферируемых журналах, рекомендуемых ВАК. Получен 1 патент РФ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, библиографического списка, приложений. Работа изложена на 170 страницах, содержит 28 рисунков, 39 таблиц. Библиографический список состоит из 157 наименований.
Классификация, характеристика и особенности свойств биологически активных добавок к пище (БАД)
Великому Гиппократу принадлежит мудрое изречение «Пусть твоя пища будет твоим лекарством, а твое лекарство — твоей пищей».
В настоящее время, спустя 2,5 тысячи лет, данное изречение воплощено учеными всего мира в жизнь в виде обоснования использования биологически активных добавок к пище. К созданию, изучению и применению БАД и привело представление о пище как об источнике комплекса фармакологических веществ, оказывающих регулирующее влияние на организм. БАД, как определяет Минздрав РФ, являются концентратами натуральных или идентичных натуральным биологически активных веществ, предназначенными для непосредственного приема или введения в состав пищевых продуктов с целью обогащения рациона питания человека отдельными биологически активными веществами или их комплексами.
В комплексе мер государственной политики в области здорового питания в России предусматривается увеличение производства и потребления основных видов пищевых продуктов, витаминов и БАД; получение новых видов пищевых продуктов общего и специального назначения с использованием ферментных препаратов и биологически активных веществ; создание технологии производства новых продуктов лечебно-профилактического назначения, дифференцированных для профилактики различных заболеваний и укрепления защитных функций организма, снижения риска воздействия вредных веществ; расширение производства БАД. Таким образом, производство и потребление БАД признано сегодня актуальным и необходимым.
За рубежом в последние два десятилетия активно используют БАДы для профилактики таких заболеваний, как рак, атеросклероз, сердечнососудистые заболевания. В США данные продукты принимают в пищу более 100 млн. американцев, тогда как, по данным института питания РАМН, по-ливитаминоминеральные препараты в России принимает не более 3% населения.
В специальной литературе в традиционном понимании под термином «пищевые добавки» понимают природные или синтезированные вещества, преднамеренно вводимые в пищевые продукты с целью придания им заданных характеристик, например, для улучшения внешнего вида и органолепти-ческих свойств, увеличения срока годности, ускорения сроков изготовления, и не употребляемые сами по себе в качестве пищевых продуктов или обыч 18 ных компонентов пищи [45]. Классификация пищевых добавок включает 4 больших класса: 1. Пищевые добавки, обеспечивающие необходимый внешний вид и органолептические свойства продукта (улучшители консистенции, красители, ароматизаторы, вкусовые вещества); 2. Пищевые добавки, предотвращающие микробную или окислительную порчу продуктов — консерванты (антимикробные средства, антиокси-данты); 3. Пищевые добавки, необходимые в технологическом процессе производства пищевых продуктов (ускорители технологического процесса, разрыхлители, желеобразователи, пенообразователи, отбеливатели); 4. Улучшители качества пищевых продуктов (улучшители муки и хлеба; вещества, препятствующие слеживанию и комкованию, глазирователи, наполнители).
В последние десятилетия количество пищевых добавок, применяемых во многих отраслях пищевой промышленности, во всех странах мира резко возросло. У некоторых пищевых добавок, содержащих нитриты, красители, фосфаты, обнаружено отрицательное воздействие на здоровье. В связи с этим Всемирная организация здравоохранения требует тщательного изучения, а также санитарно-гигиенической и токсикологической оценки пищевых добавок [42].
В современной литературе часто употребляется термин «биологически активные добавки к пище», которые применяются для коррекции питания, насыщения организма эссенциальными и биологически активными веществами, для поддержания здоровья, профилактики заболеваний, а также используются в качестве вспомогательных лечебных средств.
Общеизвестны отрицательные последствия цивилизации. К ним относятся и современные продукты питания, подвергнутые термической обработке, вымораживанию, ректификации, дезодорации — «очистке» от многих жизненно важных компонентов пищи. Положение усугубляет наличие в продуктах питания синтетических добавок: красителей, ароматизаторов, консервантов и др. Широкое использование БАД — один из наиболее эффективных и экономически приемлемых путей регулирования питания, обогащения организма незаменимыми компонентами. „Это, в свою очередь, является основой для регулирования физиологических функций через нормализацию ли-пидного, углеводного и водно-солевого обмена веществ. Здоровье можно сохранить, если удовлетворяются потребности организма в необходимых ему веществах, тогда как отклонения от формулы сбалансированного питания неизбежно приводят к нарушению различных функций. Ведущие отечественные диетологи признают сегодня перспективность научных и технологических разработок БАД и их применение для коррекции питания и профилактики хронических заболеваний [42, 79, 124].
Как указано выше, БАД изготавливают из растительного, животного или минерального сырья. К ним относят также эубиотики — ферментные и бактериальные препараты, оказывающие регулирующее действие на микрофлору желудочно-кишечного тракта. Но все же большая часть БАД — препараты растительного происхождения. Несомненным преимуществом обладают те из них, которые получены из пищевых или лекарственных растений нашей экологической ниши: содержат натуральные жиро- или водорастворимые комплексы биологически активных компонентов в природой созданных соотношениях; выделяются с помощью технологических приемов, позволяющих сохранить в нативном состоянии биологически активные вещества, даже такие мобильные, как пигменты и витамины. Необходимым уело-виєм является экологическая чистота БАД.
Биохимические, микробиологические и токсикологические методы исследования
Определение белкового азота по Къельдалю Использовали при экспериментальных исследованиях метод, основанный на осаждении белков в водных растворах трихлоруксусной кислотой. После чего белок сжигали и определяли азот по методу Къельдаля. Для определения 0,5-1,0 мл исследуемого раствора препарата на основе лекарст 50 венных растений разбавляли 20 мл дистиллированной воды, нагревали до кипения в химическом стакане 40 минут. После охлаждения к раствору белка приливали равный объем 10% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивали и оставляли на 2 часа. Осадок отфильтровывали через безазотистый фильтр и далее, вместе с фильтром подсушивали в сушильном шкафу при 45-50%. Фильтр вместе с осадком помещали в колбу Къельдаля и определяли азот по методу, описанному в литературе [127].
Определение флавоноидов в растительном сырье и препаратах проводили спектрофотометрическим методом с измерением оптической плотности исследуемого раствора препарата при длине 415 нм [97].
Для исследования количественного содержания флавоноидов 1 г растительного сырья или 2 мл образца препарата помещали в колбу объемом 150 мл, добавляли 30 мл 50% этанола. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Горячее содержимое фильтровали в колбу объемом 100 мл.
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл раствора хлорида алюминия в 95% этаноле и доводили объем раствора этанолом до метки. Через 40 мин измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при D4i5 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 1 мл экстракта, 1 капли уксусной кислоты и доведенной 95% этанолом до метки в мерной колбе объемом 25 мл.
К 2 г измельченного сырья с размером частиц 2-3 мм или 3 мл раствора препарата помещали в коническую колбу объемом 500 мл, добавляли 250 мл дистиллированной воды и нагревали до кипения, используя систему обратного холодильника в течение 30 мин. Жидкость охлаждали до комнатной температуры и фильтровали в колбу на 250 мл. Затем отбирали 25 мл полученного экстракта в колбу на 750 мл, прибавляли 500 мл дистиллированной воды, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титровали при постоянном перемешивании раствором перманганата калия (0,02 моль/л) до золотисто-желтого окрашивания.
Для исследования 0,3 г измельченного до размера частиц 1-2 мм сырья помещали в колбу объемом 250 мл, добавляли 100 мл 1% раствора хлороводородной кислоты, колбу выдерживали на водяной бане при температуре 40-45С в течение 15 мин. Экстракт фильтровали через вату в мерную колбу на 250 мл. Вату с сырьем вновь помещали в колбу и повторяли экстрагирование указанным выше способом, затем повторно фильтровали экстракт в мерную колбу на 250 мл. После охлаждения экстракта доводили объем 1% раствором хлороводородной кислоты до метки. Измеряли оптическую плотность фильтрата на спектрофотометре при D5IOHM В кювете с толщиной слоя 10 мл. В качестве раствора сравнения использовали 1% раствор хлороводородной кислоты.
Для выполнения анализа 2 мл экстракта вносили в мерную колбу объемом 25 мл и доводили водой до метки. Далее 5 мл данного раствора переносили в мерную колбу на 25 мл и доводили до метки ОД М раствором хлороводородной кислоты. Оптическую плотность измеряли при D = 320 нм и концентрацию гидроксикоричных кислот определяли по калибровочному графику.
Для выполнения исследований 0,1 мл водно-спиртового экстракта из эхинацеи пурпурной наносили на круг из фильтровальной бумаги в пятно диаметром 8-10 мм. Затем после подсушивания в данное пятно однократным касанием наносили 0,1 мл хлороформа. Фильтровальную бумагу повторно высушивали и в центр пятна наносили 0,05 мл 1% раствора хлорида железа (III) в 95% этаноле. При наличии фенольных соединений наблюдается окрашивание пятна в темно-зеленый цвет [113].
Определение экстрактивных веществ в растительном сырье проводили в соответствии с методикой, предусмотренной Госфармакопеей РФ в основе которой лежит весовой анализ [98]. Метод определения активности каталазы в растительных объектах Использован метод газометрического определения активности каталазы, основанный на измерении объема кислорода при активировании растительной каталазы перекисью водорода [103]. Сущность метода основана на ферментативном расщеплении перекиси водорода под действием энзима каталазы на воду и кислород:
2Н202 ката 2Н20 + 02 Выделяющийся в результате реакции объем кислорода определяли газометрическим методом на приборе, состоящем из двух бюреток, соединенных между собой тройником из резиновых трубок. Таким образом, в приборе создана система трех сообщающихся сосудов. Последовательность и содержание этапов выполнения методом определения активности каталазы осуществляется как описано в литературе [103].
Микробиологический анализ по определению общего числа бактерий Для исследования в направлении аллелопатической активности экстрактов сорных растений для выбора активаторов почвенных микроорганизмов использовали метод определения общего числа бактерий в почвах после воздействия на них экстрактов сорных растений.
Вытяжку из почвенных образцов 1 мл вносили в чашку Петри на питательную среду на основе мясопептонного агара (МПА). Чашки Петри инкубировали в течение 5 суток при температуре 37С в термостате. Посевы просматривали ежедневно, а через 5 суток проводили окончательный подсчет бактериальных колоний, осуществляя математическую обработку результатов исследования [90].
Использована методика, предназначенная для определения токсичности биологических проб по реакции инфузорий, с применением в качестве тест-объекта Paramecium caudatum. Все параметры поведенческой реакции инфузорий были определены на приборе «Биотестер — 2».
В сущности метод определения токсичности экстрактов из растений основан на способности инфузорий реагировать на присутствие в водной среде веществ, обладающих токсичностью и представляющих опасность для их жизнедеятельности. Таким образом, отмечается хемотаксическая реакция данного тест-объекта на вредное воздействие. Для выполнения хемотаксической реакции создавали градиент химических веществ путем наслоения в вертикальной кювете инфузорий в загустителе испытуемой жидкости. При этом в измерительной кювете образуется стабильная реакция раздела, сохраняемая в течение всего времени биотестирования. Данная граница не препятствует свободному перемещению инфузорий в предпочтительном для них направлении. После создания в кювете двух зон в течение 30 минут происходит перераспределение инфузорий по зонам. Особенностью поведенческой реакции инфузорий является массовое перемещение организмов в верхние слои жидкости. В случае если исследуемая проба не содержит токсических соединений, в кювете будет наблюдаться концентрирование клеток инфузорий в верхней зоне. При наличии токсических веществ в пробе отмечается иной характер перераспределения инфузорий в кювете: чем выше токсичность пробы, тем меньшая доля инфузорий перемещается в верхнюю зону.
Значимое различие в числе клеток инфузорий, наблюдаемых в верхней зоне кюветы в пробе, не содержащей токсические вещества (контроль), по сравнению с эти показателем, наблюдаемым в исследуемой пробе (опыт), называется критерием токсического действия.
Количественная оценка параметра тест-реакции, характеризующего токсическое действие, производится путем расчета соотношения числа инфузорий, наблюдаемых в контрольной и исследуемой пробах и выражается в виде безразмерной величины - индекса токсичности (Т) [104].
Получение экстракта и лиофилизированной формы эхинацеи пурпурной
Актуальным направлением является разработка природных пищевых добавок, применяемых для функционального питания населения, профилактики и лечения хронических заболеваний.
Современное развитие нанобиотехнологии предусматривают разработку технологий получения из природных объектов биологически активных добавок к пище, которые содержат флавоноиды, фенольные (коричная и гидроксикоричная) кислоты, антоцианы, кумарины, дубильные вещества. [58]. Данные биологически активные соединения являются перспективными компонентами для пищевой и фармацевтической промышленности.
В задачу исследований входило получение экстрактов растительного происхождения, содержащих в качестве действующих веществ фенольные соединения — фенольные кислоты, антоцианы, дубильные вещества, флаво-ноиды.
Для получения экстрактов, содержащих гидроксикоричные кислоты, в качестве растительных объектов в результате скрининга из 22 видов растений отобраны 6 лекарственных и пищевых растений: эхинацея пурпурная (Echinacea purpurea L. Moench), змееголовник молдавский (Dracocephalum moldavica L.), амарант белосемянный (Amaranthus leukospermus), мелисса лекарственная (Melissa officinalis L.), донник белый (Melilothus album), а также в качестве доступного сырья предложено использование листьев винограда сортов: «Восторг», «Молдова», «Левокумский устойчивый», «Ливадийский черный».
Экстракцию биологически активных веществ из растительных источников осуществляли водно-этанольным экстрагентом при соотношении ком 70 понентов 1:25, 1:50, 1:75 при температуре 50-70С и времени процесса экстракции 0,5-2 часа.
В растительном сырье определение содержания гидроксикоричных кислот и дубильных веществ проводилось в соответствии с методиками, представленными в главе «Организация работы и методы исследований».
В таблице 9 представлены результаты исследований по содержанию в растительных объектах гидроксикоричных кислот и дубильных веществ, которые свидетельствуют, что наибольшее содержание гидроксикоричных кислот наблюдается в эхинацее пурпурной, змееголовнике молдавском, а также в листьях винограда сортов «Восторг» и «Ливадийский черный». Наибольшее содержание дубильных веществ обнаруживается в змееголовнике молдавском, эхинацее пурпурной и в листьях винограда сорта «Восторг».
Листья винограда сортов:Левокумский устойчивый, Молдова, Восторг, Ливадийский черный 0,10±0,005 0,10±0,005 0,12±0,006 0,14±0,008 2,3±0,11 5,4±0,27 б,0±0,32 4,0±0,21 Проведено исследование содержания биологически активных веществ в препаратах из эхинацеи пурпурной методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Silufol UV-254» в системе растворителей: бутанол - муравьиная кислота - вода (18:2:9). По результатам хроматографии ее ких исследований идентифицированы в препарате из эхинацеи пурпурной гидроксикорич-ные, янтарная и яблочная кислоты, что представлено в таблице 10.
Ключевой стадией разработанной технологии получения препарата из эхинацеи пурпурной является стадия экстракции действующего вещества — гидроксикоричных кислот.
В соответствии с методикой, представленной в литературе [12], проведено изучение кинетики экстракции гидроксикоричных кислот из растительного сырья. На основании исследований константа скорости экстракции гидрокси-коричных кислот из эхинацеи пурпурной составила 5,3-10" мин" . На основе данных литературного обзора диссертации и с учетом рекомендаций государственной фармакопеи нами в качестве сырьевого источника для получения препаратов использовано лекарственное растение — эхина-цея пурпурная. Краткое описание представлено в разделе «Организация работы и методы исследований».
Препараты на основе эхинацеи пурпурной включены в фармакопеи многих стран и характеризуются широким спектром лечебного действия: противомикробное, противовоспалительное, противоаллергическое. Однако в отечественной литературе имеются ограниченные сведения по созданию из эхинацеи пурпурной пищевых добавок, в большей степени проводятся исследования ее применения в виде фитодобавки для кормопроизводства [67].
Схема технологии получения пищевой добавки из эхинацеи пурпурной в сочетании с молочной сывороткой Стадия 1. Для подготовки фитосырья надземную часть эхинацеи пурпурной собирали в период цветения (июль-август). Надземную часть растения — траву, представленную листоносными и цветоносными стеблями ере 75 зали секатором на уровне нижних листьев. Определяли содержание влаги фитосырья, которое составило 61-72%. Стадия 2. Надземную часть эхинацеи пурпурной консервировали в темноте при температуре 4-5С в холодильной камере 8-10 дней. Выход растительного фитосырья после стадии консервации составил 95-97%. На данной стадии отбраковывали до 3-5% почерневших листьев растения. Стадия 3. На данном этапе фитосырье, размельчив до размера 4-7 см, с соблюдением пространственной изоляции располагали на стелажах с последующим высушиванием при температуре 21-24С в течение 25-27 часов. Окончание процесса сушки фитосырья определено анализом на содержание в нем влаги до 10-15%. Стадия 4. На лабораторной мельнице проводили измельчение фитосырья в течение 20 минут до размера частиц 1-1,5 мм и при этом выход сырья составляет 99-99,3%. Стадия 5. Для экстрагирования комплекса биологически активных веществ из эхинацеи пурпурной фитосырье в соотношении 1:25, 1:50, 1:75 заливали в круглодонной колбе водно-этанольным экстрагентом (вода и 96% этанол при соотношении 1:1) и далее проводили экстрагирование в течение 0,5-2 часов при температуре 50-70С в системе с обратным холодильником. Стадия 6. Для осаждения в экстракте растительных белков и других лабильных примесей проводили процесс термоденатурации при температуре 75 С в течение 30 минут. Стадия 7. Стерилизацию фитопрепарата проводили автоклавированием при температуре 120С и давлении 0,098 МПа в течение 30 минут. Стадия 8. Розлив препарат осуществляли в склянки объемом 100 мл из затемненного стекла для исключения возможности появления осадков при хранении препарата. На заключительном этапе флаконы укупоривали резиновыми пробками и металлическим колпачком по технологии изготовления фармацевтических препаратов. Для получения лиофилизированной формы разлитый в пенициллино-вые флаконы препарат с уровнем жидкости 1-1,5 см замораживали в морозильном столе НС 700/50 "Frigera" (Чехия) до температуры -40С и выдерживали в течение 16-18 часов. Перед загрузкой ампул в лиофильную установку TG-5 (Германия) температуру десублиматора доводили до -70С. В камеру загружали флаконы, герметизировали, устанавливали рабочее давление 10-30 Па. Препараты высушивали при температуре 28±2С в течение 18 часов. По внешнему виду лиофилизированные препараты имели вид пористых таблеток бурого цвета без признаков микрооттаивания.
Разработка технологии регуляторов роста растений на основе молочной сыворотки и эхинацеи пурпурной с применением наносорбционных материалов
В настоящее время активно развиваются направления нанотехнологий и основными объектами прикладных исследований являются наноматериалы, которые перспективны в нанобиотехнологиях при разработке диагностикумов, биосенсоров, конвертирующих бимолекулярные взаимодействия в оптический, электрический, акустический сигналы [59]. Разработаны наночастицы-контейнеры для направленного транспорта лекарств. Преимущество систем доставки лекарств с помощью наночастиц по сравнению с обычными лекарственными формами состоит в улучшении их проникновения в клетки, в появлении способности пересекать мембранные и гемато-энцефалические барьеры в значительном уменьшении токсичности препаратов [59, 39].
Одним из ведущих направлений в области применения сорбционных материалов в биотехнологии является решение проблемы создания новых путей биодизайна модифицированных свойств поверхности и установление влияния структуры и свойств адсорбционных компонентов на механизмы биологической активности поверхности и адсорбатов [157].
На поверхности вещества атомы находятся в особенном состоянии; они обладают определенным количеством ненасыщенных связей и поэтому характеризуются повышенной реакционной способностью по сравнению с атомами в объеме. На основании этого понятно, почему наноразмерные частицы, обладающие значительным количеством атомов на поверхности, отличаются необычными химическими свойствами [138, 139, 89].
В задачу исследований по данному разделу входила разработка технологии комплексного препарата на основе сорбции биологически активных веществ из эхинацеи пурпурной на поверхности нанокомпонентов растительного происхождения и синтетических углеродных материалов.
В качестве нанокомпонентов природного происхождения использованы семена винограда с фракционным составом 40-60 нм. Получение нанокомпонентов осуществляли на механохимической мельнице в Кубанском государственном технологическом университете в соответствии с режимами размельчения виноградных семян, представленными в литературе [1].
Из источников получения семян винограда были использованы виноградные выжимки, представляющие собой отходы винодельческого производства. Стадия 1. Виноградные выжимки из-под пресса равномерно размещали на крытой бетонированной площадке площадью 200 м с толщиной слоя 6-8 см и высушивали при температуре 28-32С в воздушной среде, исключая прямое попадание солнечных лучей. Стадия 2. Для отделения семян от виноградной выжимки использовали модификацию ситового агрегата барабанного типа. Выход семян при этом составил 9,7-10,1% от массы виноградных выжимок. 128 Стадия 3. Очистку виноградных семян от примесей осуществляли вручную на бетонированной площадке и при этом достигалось требование - содержание примесей в сырьевом источнике не более 2%. Впоследствии проводилось досушивание виноградных семян в воздушной среде при температуре 25-30С до влажности в пределах 11-14%. Стадия 4. Проводили оценку сырья по качеству и количеству с определением его влажности, размера виноградных семян, а также насыпной плотности в соответствии с ГОСТами. Также оценивали внешний вид семян, их цвет и запах по органолептическим показателям. Стадия 5. Осуществляли размельчение виноградных семян на установке, включающей дезинтегратор Д-06, механохимический активатор и пятивальцо-вую мельницу 912/2, которая обеспечивает получение фракции 40-60 нм. Стадия 6. Виноградные семена в размельченном виде расфасовывали в бумажные мешки массой не более 50 кг, которые в последующем хранили в помещениях, исключающих прямое попадание солнечных лучей с относительной влажностью воздуха не более 70%, в диапазоне температур от 21 до 28 С. Срок хранения составляет один год.
Для получения наночастиц высокого качества, пригодных для биотехио-логических целей, необходимо к сырьевому источнику предъявлять следующие требования: - внешний вид — поверхность семян чистая, без посторонних примесей и без следов плесени; - цвет - темно-красный или коричневый, характерный для каждого сорта винограда; - запах - естественный для виноградных семян, без посторонних оттенков запаха; - наличие примесей не более 2%. 129 В соответствии с методиками, представленными в литературе [60] в составе семян винограда определены важнейшие биологически активные соединения - углеводы, белки, экстрактивные вещества, липиды. В таблице 32 представлен химический состав виноградных семян. Таблица 32 — Химический состав виноградных семян Наименование показателя Сорт винограда «Жемчуг» «Ркацители» «Левокум-ский устойчивый» Адсорбционноактивные компоненты: - целлюлоза, пектины, лигнин 34,8 32,1 33,5 Дубильные вещества 7,0 6,9 6,7 Липиды 5,9 6,4 7,2.
Содержащийся в виноградных семенах лигнин является активным сорб-ционным компонентом, широко распространенным органическим полимером растительного происхождения [105]. Мономерными составляющими лигнина являются производные фенилпропана, а именно конифериловый, синаповый и п-кумаровый спирты. Лигнин является сложным трехмерным аморфным полимером, содержащим набор функциональных групп, в первую очередь меток-сильных и гидроксильных [143, 146, 154].
Адсорбционными свойствами также обладает целлюлоза, состоящая из множества остатков P-D-глюкопиранозы.
В современной литературе имеются ограниченные сведения о количественном содержании микроэлементов в виноградных семенах. Поэтому дальнейшей целью данной работы является исследование количественного состава микроэлементов, содержащихся в виноградных семенах.
Высокая гидрофильность наносорбента из виноградных семян обусловлена структурно упорядоченными гидроксилами целлюлозы и лигнина. При взаимодействии с водой основной вклад вносят: электростатическое взаимодействие, водородные связи и комплексы с переносом заряда.
В результате адсорбированные молекулы воды на поверхности наночастиц поляризуются и свойства воды на межфазной границе существенно отличаются от свойств воды в объеме растворителя. В первую очередь увеличиваются дипольный момент, диэлектрическая постоянная, растворяющая способность, протонная проводимость и облегчается трансмембранный перенос. Таким образом, следствием адсорбции является повышение биоактивности воды.
Биоактивная вода характеризуется эффективной способностью к поглощению семенами. Известно, что активное водопоглощение семенами способствует их продуктивному прорастанию [2]. Биологические мембраны являются тонко уравновешенными системами, в которых вода активно участвует не только в организации их пространственной структуры, но и активно воздействует на происходящие в них процессы [2].
Сорбционные нанокомпоненты активно участвуют, по-видимому, в трансмембранном переносе биологически активных веществ из препарата эхи-нацеи пурпурной, что повышает их доступность проникновения в структуру зерна. Общеизвестно, что перенос вещества осуществляется только под действием разности потенциалов, химического Др. или концентрационного АС. Поскольку повышение биодоступности является общим явлением для веществ различной химической природы, естественно предположить, что величина Ар, в переносе играет второстепенную роль. На первый план выступает концентрационный потенциал, который повышается в результате адсорбции. Концентрационный потенциал определяется разностью концентраций до и после мембраны (СІ — Со). Для малорастворимых веществ Са СІ , а значит Са— Со Q - С0. Следовательно, при адсорбции разность концентрационного потенциала всегда повышается, чем и обусловлен рост проникновения и биодоступность биологически активных веществ. Биодоступность (БД) есть функция свойств сорбента и адсорбента БД = f (АС, Ар.), причем АС определяет вектор эффекта, а Ар -его величину.
