Содержание к диссертации
Crp.
ВВЕДЕНИЕ 7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Протеолитические ферменты микроорганизмов 12
Классификация протеаз 12
Продуценты протеолитических ферменюв 17
Физико-химические свойства иротеолитических ферментов 20
Регуляция синтеза протеолитических ферменюв 22
Применение протеолитических ферментов 28
1.2. Ксиланолитические ферменты микроорганизмов 36
Классификация ксиланаз 36
Продуценты ксиланолитических ферментов 38
Физико-химические свойства ксиланоли і ических ферментов 43
1 2.4. Регуляция синтеза ксиланолитических ферментов 47
1.2.5. Применение ксиланолитических ферментов 55
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАС ІЬ 59
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 59
Объекты исследований 59
Условия хранения посевного материала 59
Условия культивирования 60
Приї отовление вегетативного посевного материала 60
Культивирование микроорганизмов 60
Влияние возрасіа посевного материала 60
Влияние начального значения рН питаїельной среды 61
Влияние аэрации питательной среды 61
Получение концентрированных фермешных препарате 61
Метод проведения мутагенеза 62
Селекция активного варианта продуцента комплекса кислых и слабокислых протеаз 62
Изучение культуральных признаков продуцента 63
Методы определения активностей ферментов 64
2.1.8.1. Определение общей протеолигической активное і и
по модифицированному методу Ансона 64
Определение активностей индивидуальных протеолитических ферментов 64
Определение амилолитической активное і и 66
Определение ксиланолитической активносіи 66
Определение целлюлазной акіивносіи 67
Определение |3-глюканазной активности 67
Определение глюкоамилазной активности 67
Определение фосфагазной активности 68
2.1.9. Определение содержания растворимого белка по методу Лоури 68
Определение термостабильности протеолитических ферментов 69
Определение рН-стабильности протеолитических ферментов 69
Структура теоретических и экспериментальных исследований 69
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 71
2.2.1. Селекция и скрининг активных продуцентов комплекса
кислых протеаз и ксиланаз 71
Сравнительная характеристика продуцентов кислых и слабокислых протеаз при твердофазном и игубинном кулыивировании. ...71
Селекция акіивною варианта продуцент комплекса кислых
и слабокислых протеаз 74
2.2.1.3. Устойчивость штаммов Aspergillus oryzae при пересевах
и хранении 77
Исследование состава ферментативного комплекса, синтезируемого микромицеюм Aspergillus oryzae 78
Изучение морфологических особенностей ипамма
Aspergillus oryzae 387'-32-5 79
Влияние спорового и вегетаїивного посевного материала на биосиніез протеазы штаммом Aspergillus oryzae 387-32-5 80
Проведение мутагенеза и селекционных работ по получению штамма-суперпродуцента кислой и слабокислой протеаз 85
2.2.5.1. Подбор питательных сред для тестирования мугантных вариантов
5
микромицета Aspergillus oryzae 387-32-5 85
Проведение I этапа мутагенеза селекционированною штамма Aspergillus oryzae 387-32-5 86
Селекция активных вариантов штамма Aspergillus oryzae 387-32-5, полученных методом мутагенеза (II этап) 89
Получение активных вариантов микромицета Aspergillus oryzae 387-32-5 с применением повторного мутагенеза и методов рассева мугангных вариантов (III этап) 95
2.2.6. Кульїурально-морфолоіические признаки новою мутантною
штамма Aspergillus oryzae 107 - продуцента протеаз и ксиланазы 98
Характеристика ферментативного комплекса, сишезируемою мутантным штаммом Aspergillus oryzae 107 98
Культ урально-морфологические особенное і и мутантного
штамма Aspergillus oryzae 107 100
2.2.7. Разработка метода ведения и хранения в активном состоянии
высокоактивного штамма Aspergillus oryzae 107 - суперпродуцента
кислых и слабокислых протеаз 105
Пригоіовление посевного материала 105
Получение исходной кулыуры на косяках 106
Способ приготовления посевного маіериала 106
Контроль микробиологической чистоты посевного материала 106
Контроль ферментативной активности посевного материала 107
2.2.8. Подбор натуральных питательных сред для культивирования
гриба Aspergillus oryzae 107 - продуцента кислой иротеазы 108
2.2.9. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза ксиланазы
Aspergillus oryzae 107 методом аддитивно-решетчатою математического
описания объекта 113
2.2.10. Регуляция сишеза кислых протеаз условиями кулыивирования
Aspergillus oryzae 107 117
Влияние возраста и дозы посевного материала на рост и биосинтетическую активность продуцента 117
Влияние температуры культивирования на биосинтез кислых
протеаз и ксиланаз Aspergillus oryzae 107 119
2.2.10.3. Влияние начального значения рН пиіагельной среды при культивиро
вании Aspergillus oryzae 107 на биосинтез кислых протеаз и ксиланаз 120
2.2.10.4. Влияние интенсивности аэрирования при культивировании
Aspergillus oryzae 107 на биосинтез кислых протеаз и ксиланаз 121
2.2.11. Получение концентрированного комплексного препарата кислых
и слабокислых протеаз 123
2.2.11.1. Получение комплексного препарата кислых и слабокислых
протеаз методом спиртоосаждения 123
2.2.11.2. Получение комплексного препарата кислых и слабокислых проіеаз
методом ультрафильтрации 127
Разработка сіадии отделения биомассы штамма-продуцента и холодной «стерилизации» культуральной жидкости 128
Исследование процесса концентрирования методом ультрафильтрации 131
2.2.12. Изучение фракционного состава и биохимических свойсів ферментного
препарата кислых протеаз, полученного на основе нового мутантною штамма
Aspergillus oryzae 107 134
2.2.12.1. Хроматої рафическое разделение ферментных комплексов Aspergillus
oryzae 107 на компоненты 134
2.2.12.2. Определение рН- и іермосіабильности препарата кислых протеаз,
полученных на основе мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 138
Масштабирование процесса культивирования мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 - продуцента кислых проіеаз 143
Разработка ТИ по применению ферментного препарата кислых протеаз в спиртовом производстве 146
2.2.15. Заключение 148
2.3. ВЫВОДЫ 153
3. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 155
ПРИЛОЖЕНИЯ 184
Введение к работе
Актуальность темы. В основе большинства биоіехнологий в промышленности и сельском хозяйстве лежат каталитические процессы, осуществляемые ферментами микробного происхождения. Особое значение в настоящее время придаеіся комплексным ферменшым препаратам протеоли-тического и ксиланолитического действия, чю обусловлено значні ел ьными возможное і ями их многоцелевого применения в пищевой промышленности для решения практических задач биотехнологических производств, перерабатывающих сырье с высоким содержанием белка и полисахаридов.
Применение высокоактивных биологических катализаторов направленного спектра действия позволяет ускорить решение ряда проблем, которые сдерживали развитие технологий использования белковых субстратов в последние юды. Наиболее характерное практическое применение про политических комплексов, содержащих активные иротеиназы и пепгидазы, связано с интенсификацией биотехнологических процессов, основанных на энзи-матическом гидролизе растительного и животного сырья, для получения легкоусвояемых продуктов питания, пищевых и кормовых добавок, для повышения качества мясопродуктов, а также для интенсификации технологических процессов в кондитерском, спиртовом, пивоваренном и других производствах пищевой промышленности.
Таким образом, разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства и применения комплексных ферментных препаратов, содержащих наряду с активными протеиназами и пептидазами, действующими в кислой и слабокислой зоне рН, ферменты ксиланолитическою действия актуальна и перспективна, особенно в свете отсутствия подобных препаратов в России.
Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в проведении селекционных работ по получению активного инамма
8 Aspergillus oryzae - продуцента комплекса кислых и слабокислых протеаз, оптимизации условий его культивирования для биосинтеза ферментов и экспериментальном обосновании целесообразности использования полученных ферментных препаратов в спиртовой и других отраслях пищевого производства.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
научное обоснование критериев отбора препаратов протеолитических ферментов, эффективных при биоконверсии расіиіельного сырья в перерабатывающих отраслях АПК;
скрининг и селекция перспективных штаммов продуцентов кислых протеаз;
направленный мутагенез отселекционированных штаммов-продуцентов, исследование комплексов гидролитических ферментов, синтезируемых муташными штаммами;
на основе отселекционированных штаммов и выявленных закономерностей биосинтеза гидролитических ферментов с заданным составом отработать оптимальные биотехнологические процессы производства комплексных препаратов, содержащих ферменты протеолитического и кси-ланолитического действия в различных соотношениях в зависимости от целевого назначения их применения;
выявление оптимальных параметров технологических процессов очистки и концентрирования ферментных препаратов;
изучение основных физико-химических и биохимических свойств полученного комплексного ферментного препарата кислых протеаз;
создание нормативно-технической документации на комплексный ферментный препарат кислых протеаз и проведение необходимых санитарно-гигиенических исследований;
9 - наработка опытных партий препаратов и испытание их в различных отраслях народного хозяйства.
Научная новизна работы. Впервые методом направленного муіагене-за и селекции получен новый мутантный штамм Aspergillus oryzae 107 - суперпродуцент комплекса ферментов протеолитическоіо действия, а также сопутствующею фермента - ксиланазы; исследованы его морфолого-биохимические и культуральные признаки.
На основе установленных физиологических особенностей полученного мутантного штамма и закономерностей биосинтеза экзогидролаз впервые подобраны условия, позволяющие синтезировать фермент а іивньїй комплекс с заданным составом индивидуальных ферментов, а именно, с преимущественно протеолитической или ксиланолитической активностью.
Получены новые экспериментальные данные по составу ферментного комплекса протеолитического действия и изучены его физико-химические свойства
Выявленные зависимости качественных показа і елей комплексных ферментных препаратов от условий культивирования муіантного ппамма Aspergillus oryzae 107, способа их выделения и очисіки позволили даіь научное обоснование новой технологии получения препаратов кислых протеаз и рекомендации по их использованию в пищевой промышленности.
Практическая значимость и реализация результатов работы. Проведенные исследования явились основой для решения задачи по получению мутантного ш гамма Aspergillus oryzae 107 - супериродуцента комплекса ферментов про политического и ксиланолитического действия.
В резулыаге изучения свойств полученною муіантного ппамма Aspergillus oryzae 107 разработана и экспериментально обоснована новая технология комплексного ферментного препарата с возможностью преимущест-
10 венною синтеза протеаз или ксиланаз путем варьирования условий культивирования.
Разработаны паспорт на штамм Aspergillus oryzae 107, Технические условия на комплексный ферментный препарат кислых протеаз и Технологическая инструкция по получению комплексного препарата кислых протеаз. Подана заявка на патент РФ на мутантный штамм Aspergillus oryzae 107.
Проведены производственные испытания, подтвердившие разработанные технологические параметры получения комплексного ферментного препарата кислых протеаз и эффективность его использования в спиртовом производстве для интенсификации процессов генерации дрожжей, спиртовою брожения и увеличения выхода спирта.
Разработаны и апробированы в производственных условиях Мичуринского экспериментального спиртового завода биотехнологические схемы получения комплексного ферментного препарата протеолитического и ксила-нолитического действия и его применения для ферментолиза хлебопекарных дрожжей для получения аминокислотных смесей мноюцелевого назначения.
Исследованы перспективы применения комплексного ферментного препарата кислых протеаз в кондитерском производстве, мясной промышленное і и, сыроделии, косметологии.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на российских и международных конференциях и симпозиумах: Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2004 и 2005); Научно-практической конференции «Качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов» (Углич, 2004); Научно-практической конференции «Приоритетные направления комплексных научных исследований в обласіи производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» (Углич, 2005); Пятой ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ (Москва, 2005); Третьем международном
симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях ЛПК» (Москва, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, подана 1 заявка на патент РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающею 284 источника, из них 159 иностранных, и 10 приложений. Работа изложена на 227 страницах машинописного іексга, включает 33 іабли-цы и 20 рисунков.
