Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1 Технология производства пищевого спирта 9
1.2 Ферменты, участвующие в гидролизе зернового сырья при производстве спирта 18
1.3 Продуценты глюкоамилаз 44
1.4 Методы получения штаммов-продуцентов промышленных ферментов 49
2. Материалы и методы исследования 65
2.1 Штаммы грибов - продуцентов глюкоамилазы 65
2.2 НГ-мутагенез и выделение niaD" мутантов как реципиентов для плазмидной трансформации 65
2.3 Селекционные и ферментационные среды 66
2.4 Получение штаммов-реципиентов A. cnvamori 67
2.5 Плазмидные конструкции 68
2.6 Получение протопластов, трансформация и селекция 73
2.7 Условия облучения 74
2.8 Тесты на стабильность продукции глюкоамилазы 74
2.9 Определение активности ферментов 75
2.10 Анализ состава ферментных препаратов 77
2.11 Вискозіїметрический метод определения общей эндодеполимеразной активности ксиланаз 77
2.12 Исследования по биокатализу некрахмальных полисахаридов зернового сусла комплексными ферментными препаратами, полученными на основе рекомбинантных штаммов Aspergillus cnvamori
2.13 Структура теоретических и экспериментальных исследований 79
3. Результаты и их обсуждение 81
3.1 Выделение стабильного варианта штамма A. awamori 81
3.2 Получение высокоэффективных штаммов A. awamori - продуцентов глюкоамилазы методом плазмидной трансформации 93
3.3 Получение высокоэффективных штаммов A. awamori — продуцентов ферментов, гидролизующих НПС и фитиевую кислоту методом плазмидной трансформации 111
3.4 Влияние индуктора на продуктивность рекомбинантных штаммов А. awamori 125
3.5 Поддержание коллекции рекомбинатных штаммов A. awamori 128
3.6 Исследование биоконверсии некрахмальных полисахаридов зернового сусла комплексными ферментными препаратами, полученными на основе высокоэффективных рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori 131
3.7 Масштабирование процесса культивирования рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori в промышленных условиях 138
3.8 Испытания ферментного препарата глюкоамилазы в спиртовом производстве 143
3.9 Заключение 145
4. Выводы 149
5. Список литературы
- Продуценты глюкоамилаз
- Получение протопластов, трансформация и селекция
- Получение высокоэффективных штаммов A. awamori - продуцентов глюкоамилазы методом плазмидной трансформации
- Масштабирование процесса культивирования рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori в промышленных условиях
Введение к работе
Актуальность проблемы. Основным направлением развития спиртовой промышленности является внедрение ресурсосберегающих технологий, основанных на повышении эффективности переработки зернового сырья, увеличении выхода целевого продукта и снижении образования отходов. По традиционной технологии при производстве спирта для разжижения и осахаривания крахмала зерна применяют ферментные препараты амилолитического действия: а-амилазы и глюкоамилазы. Рядом исследователей (Гернет М.В., Синициным А.П., Мазур Н.С., Оверченко М.Б., Римаревой Л.В., Родзевич В.И. и др.) было показано, что применение ферментов, катализирующих гидролиз некрахмальных полисахаридов и фитина зерна, способствует более эффективному использованию полимеров растительного сырья, повышению выхода спирта и интенсификации процессов брожения.
Одним из перспективных продуцентов гидролитических ферментов для осахаривания крахмалсодержащего сырья является штамм Aspergillus awamori М-2002, полученный на основе низкопродуктивного промышленного продуцента Aspergillus awamori ВУД-Т2. Данный штамм синтезирует уникальный комплекс ферментов, в состав которого входят глюкоамилаза, а-амилаза и небольшое количество ферментов целлюлолитического и гемицеллюлолитического действия. Тем не менее, промышленный выпуск ферментных препаратов на основе данного штамма нерентабелен - в первую очередь, из-за нестабильности продуцента.
В связи с этим, актуальной задачей является увеличение уровня стабильной экспрессии глюкоамилазы штамма A awamori М-2002 и создание на его основе рекомбинантных штаммов - продуцентов ферментов, гидролизующих некрахмальные полисахариды (НПС) и фитин зерна. Выполнение этой задачи позволит получить конкурентоспособные ферментные препараты для эффективной конверсии зернового сырья, снизит их себестоимость и повысит рентабельность производства ферментных препаратов.
Цели и задачи исследования. Целью работы является получение рекомбинантных штаммов - продуцентов ферментов для эффективной конверсии зернового сырья на основе промышленного штамма Aspergillus awamori М - 2002 (ВКМ F-3771D).
2 Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Получить стабильный реципиентный штамм для проведения дальнейших генно-инженерных работ по повышению его биосинтетической способности.
Создать универсальную систему экспрессии генов.
Получить высокоэффективные рекомбинантные штаммы с заданными свойствами и разработать методики поддержания полученных рекомбинантных штаммов.
На основе полученных рекомбинантных штаммов наработать опытные образцы ферментных препаратов (ФП).
Изучить компонентный и биохимический состав полученных ФП и их гидролитическую способность по отношению к полисахаридам зернового сырья.
Исследовать эффективность применения новых ФП в спиртовом производстве.
Научная новизна. Методами селекции с применением индуцированного мутагенеза получен новый стабильный штамм A. awamori 6804. Впервые создана универсальная система экспрессии генов для штамма A. awamori 6804 на основе промотора и терминатора гена глюкоамилазы A. awamori 6804. С использованием этой системы получены новые рекомбинантные штаммы, обладающие повышенной биосинтетической способностью по отношению к ферментам, необходимым для эффективной конверсии зернового сырья. Впервые созданы рекомбинантные штаммы, способные наряду с глюкоамилазой экспрессировать ферменты, катализирующие гидролиз некрахмальных полисахаридов и фитина зерна. На основе установленных закономерностей выявлена возможность направленной регуляции биосинтеза отдельных ферментов у штаммов A. awamori при использовании в качестве индукторов продуктов расщепления полимерных субстратов (например, мальтодекстрина). Установлена взаимосвязь между составом ферментативных комплексов, синтезируемых рекомбинантными штаммами A.awamori, их гидролитической способностью по отношению к полисахаридам зернового сырья и эффективностью сбраживания зернового сусла.
Практическая значимость работы. Получены новые
высокоэффективные рекомбинантные штаммы A.awamori amyR-T-19, A.awamori Т-14, A.awamori Xyl-T-15, A.awamori EG-73 и A.awamori Phy-7 продуценты глюкоамилазы, ксиланазы, эндоглюканазы и фитазы, биосинтетическая способность которых превышает уровень активности исходного промышленного штамма по глюкоамилазе на 30%, по ксиланазе - в 3 раза, по Р-глюканазе - в 4-6 раз, по фитазе в 300 раз. Штаммы A.awamori amyR-T-19 и A.awamori Xyl-T-15 депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ F-4277D, F-4278D). Разработаны паспорта на штаммы, составлены «Методические рекомендации по поддержанию рекомбинантных штаммов и ведению посевного материала».
Проведены производственные испытания полученных рекомбинантных штаммов A. awamori в условиях ОАО «Спиртовый комбинат» г. Мариинск. Подтверждено, что практическая реализация результатов исследований позволяет получать на основе новых рекомбинантных штаммов A. awamori высокоактивные комплексные ферментные препараты без изменения основного технологического процесса, обеспечивая повышение выхода целевых ферментов. Производство ферментных препаратов на основе новых высокоактивных рекомбинантных штаммов A. awamori повысит экономические показатели за счет сокращения количества ферментации и расхода фермента на осахаривание. Разработаны «Технологическая инструкция» и «Технические условия» на новые ферментные препараты.
Показана высокая эффективность использования комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы, полученных на основе высокоактивных рекомбинантных штаммов, в спиртовом производстве. Их применение позволило повысить степень конверсии полисахаридов зернового сырья с образованием дополнительного количества сбраживаемых углеводов, исключить введение дополнительных источников гемицеллюлаз, улучшить реологические свойства зернового сусла и снизить его вязкость в 1,3 раза, интенсифицировать процесс брожения и повысить выход спирта на 1,2 %. Экономическая эффективность от производства 100 т комплексного ферментного препарата глюкоамилазы на основе новых рекомбинантных штаммов составит порядка 15-20 млн. руб.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: International Conference «BIOCATALYSIS 2009: Fundamentals&Applications» (Arkhangelsk, 2009), Пятый Московский Международный Конгресс «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), Научно-практическая конференция «Современные биотехнологии переработки сельскохозяйственного сырья и вторичных ресурсов» (Углич, 2009). Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средств переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (Москва, 2009), Международная научно-практическая конференция «Инновационные технологии в пищевой промышленности» (Минск, 2009), Международный симпозиум "Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (262 источника). Диссертация содержит 210 страниц печатного текста, включает 32 рисунка и 48 таблиц.
Продуценты глюкоамилаз
По традиционной технологии производства спирта для разжижения крахмала растительного сырья применяют ферментные препараты амилолитического действия, в основном а-амилазы и глюкоамилазы [10].
При обработке крахмального клейстера а-амилазой происходит эффективное разжижение и декстринизация крахмала. Средняя степень полимеризации значительно снижается, крахмал частично гидролизуется. В таком состоянии растворы при охлаждении остаются подвижными, не загустевают и не наблюдается ретроградации. Крахмальные растворы, разжиженные а-амилазой, более эффективно осахариваются глюкоамилазой на последующей стадии гидролиза [10].
а-Амилаза (эндо-1,4-а-0-глюкан глюкогидролаза, КФ 3.2.1.1) -внеклеточный фермент, неупорядоченно расщепляющий 1,4-а-Б-гликозидные связи между остатками глюкозы в крахмале и гликогене. Действие а-амилазы на крахмал характеризуется быстрым снижением вязкости раствора и молекулярной массы олигосахаридов. Фермент предпочтительно расщепляет гликозидные связи, удаленные от конца молекулы. Гидролизу подвергаются олигосахариды, содержащие не менее 3 глюкозных остатков. При гидролизе амилопектина наряду с олигосахаридами линейного строения в продуктах гидролиза присутствуют а-декстрины, представляющие собой незатронутые реакцией разветвленные участки молекул амилопектина (рис. 3). а-Амилаза
Схема гидролиза (а) амилозы и (б) амилопектина, катализируемого а-амил азами а-Амилазы условно делят на две группы: разжижающие и осахаривающие. К первым относят ферменты, расщепляющие в растворимом крахмале или амилозе не более 40% гликозидных связей, ко вторым -расщепляющие до 60% связей [11,12, 13,14]. а-Амилаза представляет собой водорастворимый глобулярный белок. Молекулярные массы большинства а-амилаз находятся в диапазоне от 45 кДа до 60 кДа, однако встречаются ферменты и с большей молекулярной массой, например, 160 - 210 кДа (а-амилазы Alicolabacillus acidocaldarius [15] и Chloroflexus auraniiacus [16]). А также известны а-амилазы с меньшими молекулярными массами 10-15 кДа (а-амилазы Bacillus caldolyticus [17] и Micrococcus varians [18]).
Из различных микроорганизмов были выделены а-амилазы, способные гидролизовать помимо крахмала пуллулан и циклодекстрины. Например, а-амилазы из Thennoactinomyces vulgaris R-47 [19] и B.stearothermophilus КР 1064 [20], при действии которых на растворимый крахмал в качестве основных продуктов образуются мальтоза и глюкоза, также гидролизуют циклодекстрины и переводят пуллулан в паннозу. Из B.thermoamyloliquefaciens КР1071 [21] была выделена а-амилаза, расщепляющая а-1,6-связи в амилопектине и гидролизующая а- и Р-циклодекстрины и пуллулан. Также ос-амилазы, гидролизующие пуллулан, были обнаружены в B.megaterium и B.Hcheniformis [22]. В пищевой, косметической и фармацевтической промышленности нашли применение ос-амилазы, образующие при гидролизе крахмала мальтоолигосахариды [23, 24]. Подобные нетипичные ос-амилазы были выделены из B.stearothermophilus US 100, B.circulans G-6, Bacillus sp. H-167, Pseudomonas sp. IMD 353 [25, 26, 27,28].
В зависимости от вида микроорганизма свойства ос-амилаз могут сильно различаться не только по конечным продуктам гидролиза, но и по оптимальным условиям для проявления максимальной активности. В таблице 2 представлены свойства а-амилаз из различных микробных источников. рН-Оптимум большинства бактериальных и грибных а-амилаз лежит в диапазоне от кислых до нейтральных значений. а-Амилаза из Alicyclobacillus acidocaldarius имеет кислый рН-оптимум, равный 3,0 [18], в отличие от щелочной а-амилазы из Bacillus sp. с рН-оптимумом при 11,0-12,0 [29]. Как правило, а-амилазы стабильны в широком диапазоне значений рН от 4 до 11 [30].
Температурный оптимум а-амилазной активности сопряжен с температурой роста микроорганизма-продуцента. Самый низкий температурный оптимум 25 С встречается у грибной а-амилазы из Fusarium oxysporum [31], а самый высокий 100 и 130С у а-амилаз из архебактерий рода Pyrococcus: P. furiosus и P. woesei, соответственно [32]. Термостабильность а-амилаз зависит от многих факторов: наличие кальция, защитного действия субстрата и других стабилизаторов [30].
В спиртовом производстве, как правило, применяют бактериальные а-амилазы, полученные из В. amyloliquefaciens, В. subtilis, В. licheniformis и Bacillus sp. Штаммы В. amyloliquefaciens обычно синтезируют мезофильную разжижающую а-амилазу [33, 34]. В. licheniformis является основным продуцентом термостабильной а-амилазы, как разжижающего, так и осахаривающего действия [35, 36, 37, 38]. В. subtilis продуцирует мезофильную а-амилазу осахаривающего действия [39, 40, 41, 42]. В. stearothermophilus US100 синтезировал термостабильную мальтогексаозообразующую а-амилазу [25]. Из термофильной бактерии В. thermooleovorans была выделена кальций-независимая термостабильная а-амилаза [43]. Термостабильная а-амилаза из В. stearothermophilus при 100С сохраняла до 90% каталитической активности, однако максимальную амилолитическую активность проявляла при 50С [44]. Из Alicyclobacillus acidocaldarius АТСС 27009 была выделена термостабильная кислотоустойчивая а-амилаза, фермент гидролизовал крахмал с образованием мальтотриозы и мальтозы, проявляя максимальную активность при рН 3 и 75С [15].
Получение протопластов, трансформация и селекция
Суспензию спор штаммов обрабатывали нитрозогуанидином (НГ) в концентрации 2,0, 1,0, 0,5 и 0,1 мг/см"5 в течение 15-30 мин. Выживаемость клеток при этом составляла от 7 до 0,13%. Для выделения хлорат-устойчивых мутантов обработанную суспензию рассевали на минимальные среды с хлоратом натрия. Для выявления подлинности предполагаемых niaD" мутантов выросшие клоны пересевали на чашки Петри на минимальные среды с нитратом натрия, нитритом натрия, гипоксантином и аспарагином, т.е., клоны проверялись на способность расти» на данных компонентах в качестве единственных источников азота. Среди, них определяли клоны, которые соответствовали по свойствам мутантам niaD", отличающиеся от исходного штамма только по признаку роста на среде с NaN03. Принтом способность таких мутантов расти на средах с другими источниками азота оставалась такой же, как у исходного штамма мицелиального гриба. Кроме того, у полученных штаммов-реципиентов сохранялась способность к биосинтезу всех секретируемых ферментов как и у исходного штамма. 2.3 Селекционные и ферментационные среды
Для выращивания посевного материала и селекции штаммов A. awamori использовалась минимальная среда РМ следующего состава (%): КН2Р04 -1,5, KCl-0,5, MgS04 7H20 - 0,5, Н3В03 - 0,0025, CuSO4 5H2O-0,02, FeS04 7H2O 0,04, MnSO4 2H2O-0,04, Na2MoO4 2H2O-0,04, ZnSO4 7H2O-0,04, глюкозы-1, (2% агара).
Посевной материал выращивали в течение 7 сут. при 35С.
Селекционные среды. В качестве селекционных использовались среды РМ с добавками (ЮмМ NaC103; ЮмМ NH4C1; ЮмМ NaN03; ЮмМ аспарагина; ЮмМ гипоксантина, 100-1000 мкг/см гигромицина).
Для проведения трансформаций мицелий штаммов A. awamori и A. niger выращивали на среде Чапека-Докса следующего состава (%j:NH4Cl- 0,3, КС1-0,2, КН2Р04 -0,1, MgS04 7H20- 0,05, CuS04 5H20 - 0,002, глюкозы- 2. Мицелий выращивали в течение 16 часов при 30 С и при 250 об/мин.
Для поддержания штаммов A. awamori и хранения посевного материала использовали следующие агаризованные среды: РМ + 10 мМ NaN03 + 2,0-ный % агар; среда Чапека (%): картофельный крахмал - 3,0, NaN03 - 0,91, КС1 67 0,05; MgS04 7H20 - 0,05; КН2Р04 - 0,1; агар-агар - 2,0; а также среду СА : солодовое сусло 7Б, агар-агар - 2,0%. Посевной материал хранили при + 4С, с периодическим (через 2-3 месяца) проведением поддерживающего отбора. Ферментационная среда для глубинного культивирования штаммов A. awamori содержала 24% пшеничной муки, обработанной а-амилазой, из расчета 2 ед. АС/ г крахмала. Ферментационная среда для глубинного культивирования штамма A. niger содержала (%): пшеничная мука (обработанная а-амилазой, из расчета 2 ед. АС/ г крахмала) - 6,0, соевой муки - 4,0, СаСО3-0,6, 1,0 % кукурузного экстракта.
Условия культивирования штаммов A. awamori и A. niger: рН среды 5,2 — 6,0; температура роста - 35 С, скорость перемешивания - 250 об/мин, продолжительность выращивания 192 ч.
Суспензию спор штамма A. awamori М-2002 обрабатывали нитрозогуанидином с концентрацией 2, 1, 0,5 и 0,1 мг/см- в течение 15-30 мин. Выживаемость клеток при этом составляла от 0,13 до 7%. Для выделения хлорат-устойчивых мутантов обработанную суспензию рассевали на чашки Петри с минимальной средой с хлоратом натрия. Выросшие клоны для выявления подлинности предполагаемых мутантов niaD" пересевали на чашки Петри с минимальными средами с нитратом натрия, нитритом натрия, гипоксантином и аспарагином, т.е. клоны проверяли на способность расти с использованием данных веществ в качестве единственных источников азота. Среди селектаптов определяли клоны, которые соответствовали по свойствам мутантам niaD , отличавшиеся от исходного штамма только по признаку роста на среде с NaNC 3, при этом способность этих мутантов расти на средах с другими источниками азота оставалась такой же, как у исходного штамма A. awamori 6804. Кроме того, отбирали полученные штаммы-реципиенты с такой же способностью к биосинтезу глюкоамилазы как у исходного штамма.
Суспензию спор штамма A. awamori Т-19 обрабатывали нитрозогуанидином с концентрацией 2, 1, 0,5 и 0,1 мг/см в течение 15-30 мин. Выживаемость клеток при этом составляла от 0,13 до 7%. Далее так же.
Для котрансформации по признаку niaD использовали трансформирующую плазмиду pSTAlO [242]. Для трансформации по hph признаку (устойчивость к антибиотику гигромицину В) использовали плазмиду pAN7-l [243], в которой ген гигромицин В фосфотрансферазы Е. coli встроен между промоторной последовательностью гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (gpdА) и терминатором гена многофункционального белка биосинтеза триптофана (trpC). Экспрессия гена hph привела к возможности отбора полученных котрансформантов на агаризованных средах, содержащих гигромицин В. Частота трансформации по hph признаку составила около 30 трансформантов на 1 мкг целевой ДНК. Плазмиду pAN7-l использовали также как матрицу для конструирования плазмиды pAN52 4myR, в которой ген гигромицин-В-фосфотрансферазы был замещен на ген активатора amyR с использованием стандартных методик клонирования генов (рис.10).
Получение высокоэффективных штаммов A. awamori - продуцентов глюкоамилазы методом плазмидной трансформации
С использованием указанных схем селекции был выбран наиболее активный штамм A. awamori 6804, который при глубинной ферментации обеспечивал активность глюкоамилазы 590 ед/см ЮК. Отобранный штамм был проверен на стабильность продукции глюкоамилазы в нескольких генерациях (табл.16). Кобальтовый мутант A. awamori 6804 в отличие от УФ-мутанта A. awamori М-2002 сохранил уровень активности целевого фермента при ферментации в 5 генерациях при различных интервалах пересева, на основании чего был сделан вывод о высокой стабильности данного штамма по признаку биосинтеза глюкоамилазы. Таблица 16 - Сравнение активности глюкоамилазы штаммов A. awamori в процессе хранения при пересевах
Для работы с грибами рода Aspergillus широко используется трансформационная система метаболического пути ассимиляции азота. Метод основан на получении мутантов niaD", дефектных по ферменту нитрат-редуктазе, и, вследствие этого, неспособных расти на минимальной среде, где в качестве единственного источника азота используется нитрат натрия - NaNCb. Вторым признаком, отличающим мутанты niaD" от исходного штамма, является их устойчивость к токсическому веществу, хлорату натрия - ИаСЮз.
Таким образом, для получения мутантов niaD" сначала получают устойчивые к хлорату натрия мутанты. Среди них определяют клоны, которые соответствуют по свойствам мутантам niaD", отличающиеся от исходного штамма только по признаку роста на среде с NaNC . При этом способность таких мутантов расти на средах с другими источниками азота остается такой же, как у исходного штамма мицелиального гриба. Кроме того, должна сохраняться способность к биосинтезу всех секретируемых ферментов (активностей) как у исходного штамма.
Мутации, приводящие к устойчивости штамма к хлорату натрия, могут происходить в ряде других генов, таких как транспортный ген стА и гены cnxA-J, требующихся для биосинтеза молибденового кофактора, необходимого как для нитрат редуктазы, так и для ксантин дегидрогеназной активности. Хлорат устойчивые мутанты также могут получиться в результате мутации в nirA и агеА, позитивно-контролирующих генах системы. niaD" мутанты можно отличить от crnA, cnxA-J, nirA и areA мутантов на основе простых тестов роста. Данная система получения ауксотрофных реципиентов имеет ряд преимуществ: - возможность быстрого отбора мутантов по устойчивости к хлорату натрия; - мутанты имеют простой фенотип роста - неспособность потреблять нитраты в качестве единственного источника азота; - данный метаболический путь несуществен для клетки, поэтому мутации в нитратном пути не влияют на рост культуры и другие метаболические процессы; - большинство мицелиальных грибов способны потреблять нитраты в качестве единственного источника азота.
При спонтанной мутации образование niaD" мутантов происходит с очень низкой частотой. Применение мутагенов повышает частоту образования мутантов в 100-1000 раз, что облегчает работу по их выделению. Широкое применение в селекционной работе с микроорганизмами получил нитрозогуанидин (НГ). Алкилируя основания в точке репликации, где ДНК существует в однонитевой форме, НГ часто вызывает множественные мутации на ограниченном участке хромосомы (а также в различных районах хромосомы) [198].
Опыты по получению niaD" мутантов выполнялись в соответствии со схемой, представленной на рис. 17: Споровая суспензия штамма A. awamori НГ-мутагенез (концентрация 2,0, 1,0, 0,5 и 0,1 мг/см3) Рассев на среды с хлоратом натрия
Отбор хлорат-устойчивых клонов и пересев на среды РМ с NaN03 и с другими источниками азота (NaN02, гипоксантином, аспарагином) для отбора истинных niaD" - мутантов Выделение истинных niaD"- мутантов Проверка активности истинных NiaD" - мутантов при глубинном культивировании в колбах
Для получения мутантов, устойчивых к хлорату натрия, штамм А. awamori 6804 был подвергнут обработке нитрозогуанидином. Выросшие клоны для выявления подлинности предполагаемых niaD" мутантов были пересеяны на среды с различными источниками азота. Из популяции обработанных клонов было выделено 2 варианта с фенотипом niaD" (табл. 17). Хлоратустойчивыеклоны Селективные среды Среда РМ +ЮмМNaC103 Среда РМ +ЮмМ+NH4CI Среда РМ + ЮмМ+NaN03 Среда РМ+ЮмМ Аспарагина Среда РМ +ЮмМГипоксантина
После хранения в течение двух месяцев при 4С на скошенном агаре со средой РМ + NH4C1 niaD" мутантные штаммы, как первого, так и второго пассажа, были неоднократно проверены на реверсию к прототрофному типу, а также на способность к биосинтезу ферментов при культивировании на жидких средах в колбах, где показали контрольный уровень биосинтеза глюкоамилазы (табл.18). Таблица 18 - Глюкоамилазная активность в КЖ niaD" мутантов A. awamori
Анализ состава ферментных препаратов, полученных с помощью селекционированных штаммов A. awamori
Для определения состава исследуемых препаратов было проведено их аналитическое фракционирование с использованием FPLC-системы и последующим анализом активности глюкоамилазы в полученных фракциях (для всех препаратов количество белка, наносимого на колонку, было одинаковым - 6 мг). На рис. 18 представлен хроматографический профиль препарата УФ-мутантного штамма A.awamori М-2002, на котором видны два основных белковых пика. По данным ДДС-электрофореза первый пик соответствует "легкой" форме глюкоамилазы с молекулярной массой - 80 кДа, второй - "тяжелой" форме с молекулярной массой 140 кДа (результаты ДДС-электрофореза представлены на рис. 21).
Масштабирование процесса культивирования рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori в промышленных условиях
Масштабирование процесса культивирования рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori amyR-19 и Aspergillus awamori Xyl-15 - продуцентов глюкоамилазы и ксиланазы осуществляли в: ферментном цехе ОАО « Спиртовый комбинат » г. Мариинска.
Технология культивирования микромицетов, разработанная на основе установленного промышленного технологического регламента на производство ГлюкаваморинаРх инструкции включает следующие основные стадии: приготовление питательной среды для посевного материала; - выращивание посевного материала; - приготовление питательной среды для производственной ферментации; - получение стерильного воздуха для аэрации растущей культуры; - ферментация производственной,- культуры Глюкаваморина Гх.
Процессуально-технологическая схема получения ферментного препарата Глюкаваморин Гх приведена на рисунке 28. В качестве исходной культуры использовали конидии штаммов Aspergillus awamori amyR-\9 и Aspergillus awamori Xyl-15, хранящихся на скошенном в музее ВНИИПБТ.
Для инокуляции ферментационных производственных сред использовали споровый посевной материал, выращенный в колбах на твердых сыпучих средах (50% пшеничных отрубей и 50% солодовых ростков, увлажненных водопроводной водой до 60%, рН среды - 5,2-5,5) в стационарных условиях при температуре 35С в течение 5-6 суток и далее выдержанных при 22-23С - в течение 7 суток.
Культивирование проводили на ферментационных средах на основе ферментативного гидролизата пшеничной муки с концентрацией 24%, в ферментерах объемом 16 м , оснащенных барботерами для подачи воздуха в аппарат и одноярусной турбинной мешалкой, двигатель которой позволяет развивать обороты до 220 об/мин. В качестве разжижающего ферментного препарата использовали концентрированный препарат термостабильной а-амилазы (2ед АС на 1 г крахмала).
Для проведения испытаний технологии культивирования штаммов использовалась реальная аппаратурно-технологическая схема. Данной схемой предусматривалось смешивание муки и воды в смесителе при температуре 30С, подогрев замеса до температуры 60 и внесение ФП ферментного препарата термостабильной а-амилазы, дальнейший нагрев до 85-90, инкубирование в течение 1 часа (стадия клейстеризации и разжижения), разваривание и стерилизация мучного замеса под давлением и температуре 132-136С методом прокачивания массы через установку непрерывной стерилизации, включающую контактную головку и выдерживатель, в ферментер, где дополнительно масса выдерживалась при температуре 120С в течение 30 мин. Охлаждение питательной среды осуществлялось холодной водой, подаваемой в рубашку ферментера, и воздухом через барботер, питательные среды инокулировали при температуре 35-36 С.
Инокуляция осуществлялось через посевной лючок в зоне огня: Количество конидиального посевного материала 9-14 г на 1 м3 среды. Культивирование штаммов Aspergillus awamori атуЯ-ТАЭ и Aspergillus awamori Xyl-15, производилось в ферментере в течение 192 - 216» ч. при постоянном аэрировании и перемешивании питательной среды. Режим культивирования соответствовал следующим параметрам: - максимальная скорость перемешивания - 220 об/мин; - коэффициент загрузки ферментеров - 0,7; - режим расхода воздуха постоянный - 1,0 об/мин; - температура культивирования - 35С; - давление в ферментере в процессе роста - 0,05 - 0,07 МПа;
При культивировании рекомбинантного штамма A. awamori amyR-19 -продуцента ГлА активность фермента на 192-216 ч составила порядка 650 -730 ед/см культуральной жидкости. При культивировании штамма , awamori Xyl-15 - продуцента комплекса ферментов, активность глюкоамилазы составила 380-520 ед/см3, а уровень синтеза ксиланазы увеличился до 180-230 ед/см3.
Таким образом, на базе ферментного цеха Мариинского спирткомбината проведены производственные испытания технологии культивирования рекомбинантных штаммов A. awamori в ферментерах объемом 16 , подтвердившие высокую продуктивность и технологичность новых продуцентов. Определены и подтверждены ранее оптимизированные в лабораторных условиях основные параметры процесса ферментации - состав питательных сред, способ засева питательных сред, коэффициент загрузки ферментера, температурный режим культивирования. Практическая реализация оптимизированного режима позволяет получать комплексные ферментные препараты с активностью глюкоамилазы и ксиланазы до 700 и 230 ед/см3 культуральной жидкости, соответственно. Полученные результаты свидетельствует об успешном внедрении технологии производства ферментных препаратов глюкоамилазы и ксиланазы в промышленных условиях на основе рекомбинантных штаммов.
