Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Протеазы. Классификация, механизм действия и физико-химические свойства 10
1.2. Амилаза. Физико-химические свойства и механизм действия 20
1.3. Продуценты щелочных сериновых протеиназ и термостабильной а-амилазы 24
1.4. Физиологические функции протеаз и а-амилазы 29
1.5. Регуляция биосинтеза протеаз и а-амилазы микроорганизмами... 32
1.6. Методы повышения активности штаммов 39
1.7. Применение щелочных протеиназ, а-амилазы и комплексных препаратов в различных отраслях АПК 42
2. Материалы и методы 47
2.1. Продуцент и условия хранения посевного материала 47
2.2. Методы проведения мутагенеза 48
2.3.1. Первый и третий этапы мутагенеза. Получение стрептомицино-устойчивых штаммов В. licheniformis ST-90 и В. licheniformis 103 48
2.3.2. Второй этап мутагенеза. Получение штамма В.licheniformis К11 ... 50
2.4. Условия культивирования продуцента 50
2.5. Получение ферментных препаратов 52
2.6. Методы определения активности ферментов 52
2.7. Характеристика ферментационных сред 55
3. Получение высокоактивного штамма bacillus licheniformis 103 методами мутагенеза и селекции. оптимизация способа ведения посевного материала мутантного штамма 56
3.1. Мутагенез, селекция 56
3.2. Исследование влияния условий хранения и ведения посевного материала на ферментативную активность мутантного штамма B.licheniformis 103 59
3.2.1. Исследование морфологической изменчивости штамма B.licheniformis 103 при рассеве на разные виды агаризованных сред... 59
3.2.2. Влияние условий хранения посевного материала на ферментативную активность штамма В. licheniformis 103 61
3.2.3. Влияние длительности хранения спорового посевного материала на ферментативную активность штамма B.licheniformis 103 63
3.2.4. Влияние способа длительного хранения спорового посевного материала на ферментативную активность штамма B.licheniformis 103 65
4. Оптимизация условий глубинного культивирования мутантного штамма bacillus licheniformis 103 ... 67
4.1. Оптимизация состава питательных сред для глубинного культивирования продуцента 67
4.1.1. Культивирование исходного и мутантного штаммов на средах с кормовыми дрожжами и различными источниками углерода 67
4.1.2. Выбор оптимального комплексного источника органического азота для глубинного культивирования штамма В. licheniformis 103... 70
4.1.3. Влияние концентрации кукурузной муки на биосинтез ферментов штаммом В. licheniformis 103 72
4.1.4. Культивирование штамма B.licheniformis 103 на ферментационных средах с различным соотношением кукурузной и соевой муки 73
4.1.5. Культивирование штамма B.licheniformis 103 на ферментационных средах с полной и частичной заменой кукурузной муки пшеничной, ржаной и ячменной 75
4.1.6. Влияние неорганических источников фосфора на биосинтез ферментов штаммом B.licheniformis 103 79
4.1.7. Влияние способа ферментативной обработки среды для глубинного культивирования на биосинтез ферментов штаммом В. licheniformis 103 81
4.2. Влияние условий культивирования на синтез ферментов штаммом В. licheniformis 103 82
4.2.1 Влияние температуры культивирования и рН исходной ферментационной среды на биосинтез ферментов штаммом B.licheniformis 103 82
4.2.2. Влияние возраста и количества вегетативного посевного материала на синтез протеазы и а-амилазы штаммом B.licheniformis 103 85
4.3. Направленное культивирование продуцента 87
5. Культивирование штамма bacillus licheniformis 103 с внесением в культуральную жидкость поверхностно-активных веществ 89
5.1. Изучение локализации протеазы 89
5.2. Добавление поверхностно-активных веществ в качестве индукторов биосинтеза протеазы 90
5.3. Культивирование штамма B.licheniformis 103 с внесением в ферментационные среды промышленных поверхностно-активных веществ 92
6. Получение концентрированных ферментных препаратов амилопротолихетермг1 ох и г20х . 94
7. Исследование физико-химических свойств ферментного препарата амилопротолихетерм. 97
7.1. Влияние рН и температуры на протеолитическую и амилолитическую активность препарата Амилопротолихетерм Г20х 97
7.2. Стабильность протеолитических и амилолитических ферментов штамма B.licheniformis 103 при различных значениях рН и температуры 99
7.3. Влияние промышленных поверхностно-активных веществ и щелочных реагентов на протеолитическую и амилолитическую активность препарата Амилопротолихетерм 102
7.3.1. Исследование влияния промышленных поверхностно-активных веществ на протеолитическую и амилолитическую активность препарата Амилопротолихетерм Гх 102
7.3.2. Исследование влияния промышленных поверхностно-активных веществ на стабильность протеолитических ферментов препарата Амилопротолихетерм Г20х 103
7.3.3. Исследование влияния щелочных реагентов на стабильность протеолитических ферментов препарата Амилопротолихетерм Г20х 104
8. Масштабирование процесса культивирования штамма bacilluslicheniformis 103 106
8.1. Культивирование штамма B.licheniformis в лабораторных ферментерах 106
8.2. Культивирование штамма B.licheniformis 103 в полупроизводственных условиях 109
8.3. Культивирование штамма В.licheniformis 103 в условиях МЭЗ 109
9. Испытание препаратов амилопротолихетерм в спиртовой и других отраслях производства 111
Выводы 115
Список литературы 116
Приложения 140
- Амилаза. Физико-химические свойства и механизм действия
- Второй этап мутагенеза. Получение штамма В.licheniformis К11
- Исследование влияния условий хранения и ведения посевного материала на ферментативную активность мутантного штамма B.licheniformis
- Влияние концентрации кукурузной муки на биосинтез ферментов штаммом В. licheniformis 103
Амилаза. Физико-химические свойства и механизм действия
Амилаза (эндо-1,4-а-0-глюкан глюкогидролаза, КФ 3.2.1.1) -внеклеточный фермент, неупорядоченно расщепляющий 1,4-oc-D-глюкозидные связи между остатками глюкозы в крахмале и гликогене. Действие ct-амилазы на крахмал характеризуется быстрым снижением вязкости раствора и молекулярной массы олигосахаридов. Фермент предпочтительно расщепляет гликозидные связи, удаленные от конца молекулы. Гидролизу подвергаются олигосхариды, содержащие не менее 3 глюкозных остатков. При гидролизе амилопектина наряду с олигосахаридами линейного строения в продуктах гидролиза присутствуют а-декстрины, представляющие собой не затронутые реакцией разветвленные участки молекул амилопектина. Продуктами первой стадии гидролиза крахмала являются не окрашивающиеся йодом ахроодекстрины, состоящие не более чем из 12 остатков глюкозы. Во второй, стационарной, медленнотекущей стадии происходит накопление низкомолекулярных Сахаров. Чаще всего основными продуктами при длительном гидролизе амилозы а-амилазами являются мальтоза, глюкоза, мальтотриоза. а-Амилазы условно делят на две группы: разжижающие и осахаривающие.
К первым относят ферменты, расщепляющие в растворимом крахмале или амилозе не более 40% гликозидных связей, ко вторым -расщепляющие до 60% связей. При действии бактериальных амилаз разжижающего типа на растворимый крахмал основными продуктами гидролиза являются мальтогексаоза, мальтопентаоза и мальтоза. Бактериальные амилазы осахаривающего типа гидролизуют крахмал с образованием до 70% мальтозы и глюкозы (Грачева И.М., Кривова А.Ю., 2000, Диксон М., Уэбб Э., 1982, Pandey A., Nigam Р., 2000, Ingle М.В., Erickson R.J., 1978). а-Амилаза представляет собой водорастворимый белок, обладающий свойствами глобулина. Как правило, молекулярная масса а-амилаз составляет 45000 - 60000, однако встречаются ферменты с молекулярной массой до 130000 (а-амилаза В.тасегат), также известны термостабильные а-амилазы с небольшими молекулярными массами 14000 - 15000, содержащие в 2 - 3 раза больше атомов кальция. а-Амилазы относятся к металлоферментам, содержащим от 1 до 30 г атом Са на 1 г моль фермента. Их аминокислотные последовательности содержат большое количество тирозина и триптофана. Глутаминовая и аспарагиновая кислоты составляют 25% массы белка. Разжижающие а-амилазы не имеют сульфгидрильных групп, а осахаривающие содержат один остаток цистеина. Некоторые a-амилазы грибного происхождения имеют углеводный фрагмент, в состав которого могут входить манноза, ксилоза, гексозоамин (Грачева И.М., Кривова А.Ю., 2000). В зависимости от вида микроорганизма свойства a-амилаз могут сильно различаться не только по механизму воздействия на субстрат и конечным продуктам, но и по оптимальным условиям для проявления максимальной активности. Предполагается, что основные характеристики внеклеточных а-амилаз отражают рН и температуру среды, в которой выращиваются продуценты.
Это подтверждает a-амилаза B.flavothermus, культивируемого при рН 6,0 и 55С, имеющая рН и термооптимум при 5,5 - 6,0 и 60С. Также в качестве примера можно привести алкалофильный штамм Bacillus sp. GM8901, растущий при рН 10,5 и 50С и продуцирующий а-амилазу с рН- и термооптимумом при 11,0 — 12,0 и 60С, соответственно. Другой штамм Bacillus sp. хорошо растет при рН 8,5, а рН-оптимум синтезируемой им ос-амилазы составляет 9,0 (цит. по Pandey A., Nigam Р., 2000). Из литературных данных известно, что молекула термостабильной ос-амилазы B.licheniformis представляет собой мономер с молекулярной массой 55200 Да и содержит 483 аминокислотных остатка. Третичная структура молекулы данного фермента состоит из трех доменов. Первый домен (домен А) содержит 291 аминокислотный остаток (с 3 по 103 и с 207 по 396) и формирует (3/а-бочкообразную структуру в виде цилиндрических областей, связанных между собой спиралями, образующими широкие петли. Домен А создает компактную, стабильную, жесткую структуру молекулы. Второй домен (домен В), состоящий из остатков с 104 по 206, включен между 3-цепью и третьей а-спиралью домена А. Третий С-концевой домен (домен С), состоящий из остатков с 397 по 482, закручивается в восьмивитковую Р-«бочку». Между доменами А и В находится глубокая «расщелина» для связывания с субстратом и катализа, а также участок для связывания с ионами кальция, необходимыми для поддержания третичной структуры и каталитической активности молекулы фермента. Важную роль в процессе катализа играют аминокислотные остатки активного центра - Asp231, Glu261 и Asp328, сосредоточенные в С-концевом участке центральной (Уа)-бочки. Термостабильность а-амилаз достигается за счет различных факторов, повышающих ионные взаимодействия, сокращающих площадь поверхности и усиливающих внутренние взаимодействия, что приводит к уплотнению структуры молекулы. Известно, что гомологичные а-амилазы Bacillus проявляют различную термостабильность. Так а-амилаза B.amyloliquefaciens (BAA) быстро инактивируется при 90С, несмотря на 80%-ную идентичность а-амилазе B.licheniformis (BLA), а а-амилаза B.stearothermophilus (BSA), проявляющая 65%-ную идентичность BLA, занимает промежуточную позицию по термостабильности. Основным отличием аминокислотной последовательности BLA является высокое содержание остатков гистидина по сравнению с другими бактериальными а-амилазами. Некоторые остатки гистидина включены во внутримолекулярные взаимодействия. Одним из основных факторов, стабилизирующих термоустойчивые белки, являются «солевые мостики», представляющие собой ионные взаимодействия между полярными атомами заряженных боковых цепочек аминокислотных остатков. В структуре BLA насчитывается 39 солевых мостиков. Также исследователи отмечали, что молекула BLA отличается компактностью, отсутствием внутримолекулярных пустот и очень небольшой площадью поверхности молекулы, что, по-видимому, значительно повышает термостабильность фермента (Kwang Yeon Hwang et al., 1997, Khajeh Kh. et al., 2001, Fagain CO., 1995, Declerck N. et al., 2000).
Второй этап мутагенеза. Получение штамма В.licheniformis К11
Культивирование продуцента в лабораторных условиях осуществляли на в колбах объемом 750 мл с 30 мл ферментационной среды (кроме опыта по изучению влияния объема питательной среды в колбах на биосинтез ферментов) на качалке (240 об/мин) при 37 - 43С в течение 48 - 144 ч. Состав основных ферментационных сред: Среда № 1 (исходная) — кукурузная мука - 16%; кормовые дрожжи — 2 — 3%; MgS04x7H20 - 0,2%; СаСОэ - 0,25%. рН среды до стерилизации устанавливали 8,0 - 8,2. Среда №2 (оптимизированная для синтеза протеазы) - кукурузная мука - 16%; соевая мука - 1%; MgS04x7H20 - 0,2%; СаСОз - 0,25%. рН среды до стерилизации устанавливали 7,0 - 7,2. Среда №3 (оптимизированная для синтеза протеазы, со стабилизацией рН) - кукурузная мука - 16%; соевая мука - 1%; MgS04x7H20 - 0,2%; СаСОз - 0,25%; Na2C03 - 0,1%. рН среды до стерилизации естественный - 6,5 - 6,7. Среда №4 (оптимизированная для синтеза а-амилазы) - кукурузная мука - 8%; пшеничная мука - 8%; соевая мука - 1%; MgS04x7H20 - 0,2%; СаС03 - 0,25%). рН среды до стерилизации устанавливали 8,0 - 8,2. Среда №5 (оптимизированная для синтеза а-амилазы) - кукурузная мука - 8%; пшеничная мука - 8%; кормовые дрожжи - 3%; MgS04x7H20 -0,2%; СаС03 - 0,25%. рН среды до стерилизации устанавливали 8,0 - 8,2. Среда №6 (оптимизированная для синтеза а-амилазы) - кукурузная мука - 8%; пшеничная мука - 8%; кормовые дрожжи - 1%; соевая мука - 1%; MgS04x7H20 - 0,2%; СаСОз - 0,25%. рН среды до стерилизации устанавливали 8,0 - 8,2. Оптимизацию процесса культивирования штаммов также осуществляли в лабораторных ферментерах, емкостью от 1 до 3 л, оснащенных системами автоматического регулирования рН, р02 температуры и пеногашения. Условия культивирования: коэффициент загрузки ферментеров - 0.5, посевной материал - вегетативная культура, выращенная в колбах 24 ч при 41 С, доза засева посевной культуры в ферментер - 1 - 2%. Препараты степени очистки Гх получали, отделяя биомассу клеток продуцента от культуральной жидкости центрифугированием 8000 об/мин в течение 10 мин.
Препараты Г10х получали осаждением препаратов Гх ацетоном в соотношении 1:2, этиловым спиртом в соотношении 1:5 или эфиро-альдегидной фракцией в соотношении 1:3 Препараты Г18х - ультраконцентраты культуральной жидкости, полученные при концентрировании фильтрата культуральной жидкости продуцента на полых волокнах. Препараты Г20х получали осаждением препаратов Г18х ацетоном в соотношении 1:2, этиловым спиртом в соотношении 1:5 или эфиро-альдегидной фракцией в соотношении 1:3. Осаждение органическими растворителями проводили, предварительно охлаждая растворители и препараты Гх или Г18х до 5С. Протеолитическая активность характеризует способность ферментного препарата катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот и выражается числом единиц протеазы в 1 г (мл) препарата. В основу положен метод Ансона. Воздействие исследуемого ферментного препарата на раствор казеина (или гемоглобина, если фермент активен в кислой среде), осаждают не распавшийся белок 10% ТХУ и в фильтрате определяют количество не осаждаемого ТХУ белка колориметрической реакцией с реактивом Фолина. Принимается, что количество не осаждаемого белка пропорционально количеству находящегося в фильтрате тирозина. За единицу протеолитической активности (ПС) принимается количество фермента, которое за 1 минуту в условиях опыта (60С, рН 8,0) катализирует переход в не осаждаемое ТХУ состояние такого количества казеина (гемоглобина), которое содержит 1 микромоль тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг). Протеолитическая активность препарата (ПС в ед/г) выражается числом протеолитических единиц (ПЕ) в 1 г ферментного препарата. Определение активности щелочной протеиназы (по ФОЛП) Активность щелочной протеиназы определяли по ГОСТ 20264.4-74. За единицу активности щелочной протеиназы принято такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г белка (казеина) в строго определенных стандартных условиях: температура 40С, концентрация водородных ионов (рН) 10,5 и время гидролиза 1 ч. Определение амилолитической активности Определение амилолитической активности (АС) проводили в соответствии с ГОСТ 20264.4-74. Метод основан на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы. За единицу активности принимали количество фермента, которое при 90С и рН 7,5 в течение 10 мин катализирует расщепление 1 г растворимого крахмала до декстринов различной молекулярной массы, составляющих 30% от крахмала, введенного в реакцию. Определение коллагеназной активности На основании литературных данных для определения способности ферментных препаратов гидролизовать коллаген была выбрана следующая методика (Жолнер Л.Г. и др., 1988): 1 мг субстрата (коллагена) суспендировали в 4,8 мл 50 тМ трис-НС1-буфера (рН 9,1) и инкубировали 15 мин при 60С. В приготовленный субстрат вносиили 0,2 мл раствора ферментного препарата и выдерживали 10 мин при 60С для проведения гидролиза. Затем в пробы добавляли 5 мл 10% ТХУ для осаждения непрогидролизованного белка и выдерживали 20 мин при 60С для формирования осадка.
Осадок отделяли фильтрованием. В фильтрате определяли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 при 280 нм. В контрольные пробы добавляли ТХУ до внесения фермента. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое вызывает увеличение A2so на 0,01 в условиях опыта. Определение кератинолитической активности Активность кератиназы определяли с использованием в качестве субстрата азо-кератина (Novus, США). Гидролиз проводили при 50С и рН 7,5 в течение 30 мин. Реакцию останавливали добавлением 10%-ной ТХУ. В отфильтрованных супернатантах измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм. За единицу активности кератиназы принимали увеличение оптической плотности на 0,01 за 30 мин при 50С, рН7,5. Определение активности (3-глюканазы Метод основан на измерении скорости образования восстанавливающих Сахаров методом Шомоди-Нельсона при гидролизе (3-глюканазами Р-глюкана ячменя (Синицын А.П. и др., 1995). За единицу Р-глкжаназной активности принимают начальную скорость гидролиза Р-глюкана, равную 1 микромолю восстанавливающих Сахаров (в глюкозном эквиваленте), образующихся за 1 мин при 50С и рН 5,0. Определение активности пуллуланазы Пуллуланаза гидролизует а-1,6-связи в пуллулане с образованием мальтотриозы. Количество прогидролизованных связей определяют по высвобождению восстанавливающих Сахаров методом Шомоди-Нельсона. За единицу пуллуланазной активности принимают такое количество фермента, которое при гидролизе пуллулана высвобождает редуцирующие сахара в количестве, эквивалентном одному микромолю глюкозы, в минуту при 60С и рН 4,5 (Solvay, США).
Исследование влияния условий хранения и ведения посевного материала на ферментативную активность мутантного штамма B.licheniformis
Известно, что условия хранения оказывают значительное влияние на морфологические свойства, ферментативную активность и стабильность культуры при пересевах (Бахматова И.В., Жарикова Г.Г., 1978, 1979, Колтукова Н.В. и др., 1990). Поэтому нами была проведена работа по изучению влияния условий хранения спорового посевного материала на морфологическую стабильность и ферментативную активность нового мутантного штамма В. licheniformis 103. Был проведен рассев штамма B.licheniformis 103 на ч. Петри с различными агаризованными средами по следующей схеме: Схема 2. Рассев штамма B.licheniformis 103 на агаризованные среды различного состава. С чашек Петри отбирали морфологически отличающиеся колонии, пересевали на косяки с соответствующими средами, выращивали при 35 С в течение 5 суток и проверяли ферментативную активность отобранных вариантов при глубинном культивировании в колбах на оптимизированной среде №2 (16% кукурузной муки, 1% соевой муки, соли) при 41 С в течение 72 ч. На средах М+С и МПСА отмечено расщепление культуры: 60% составляли слизистые, пигментированные колонии с неровными краями; 30% составляли более светлые, плотные колонии с ровными краями, также наблюдались прозрачные, круглые, выпуклые колонии и сильно пигментированные прозрачные колонии с неровными краями.
На чашках с пептоном наблюдались два вида колоний: 60% составили светлые колонии с ровными краями; 40% - пигментированные розово-кремовые колонии с неровными краями ОА оказался непригоден для изучения морфологии колоний, в связи с непрозрачностью и неоднородностью слоя среды на ч.Пегри и слабым ростом колоний. С каждого вида агаризованных сред было отобрано по 50 колоний, максимально различающихся по внешнему виду. Колонии пересеяли на пробирки с агаризованными средами в соответствии с приведенной выше схемой и выращивали 72 ч при 35С и 2 недели при 20С. Ферментативную активность отобранных вариантов проверяли при глубинном культивировании в колбах на среде №2 при 42С в течение 72 ч. Результаты эксперимента приведены в табл. 2. При использовании среды М+С (мясопептонный бульон с солодовым суслом) наблюдается снижение морфологической стабильности штамма. По-видимому, это связано с большей степенью расщепления культуры на среде с высоким содержанием аминокислот, пептидов и ростовых веществ без внесения стабилизирующего фактора - крахмала. Штамм B.licheniformis 103, хранившийся на среде МПСА, пересеяли на четыре вида агаризованных сред: МПСА, М+С, ПА и ОА. Культуру выращивали на агаризованных средах в течение 5 суток при 37С. Полученный посевной материал хранили при 4 и 20С в течение 1 и месяцев. Ферментацию проводили в колбах на среде №2 при 41 С в течение 72 и 96 ч. Результаты эксперимента приведены в табл. 3. Очевидно, что результаты эксперимента по хранению посевного материала также показали преимущество среды ПА (пептонный агар-агар). Среда М+С нежелательна для хранения посевного материала штамма B.licheniformis 103. Температура хранения посевного материала не оказывает значительного влияния на активность ферментов мутантного штамма. Учитывая полученные результаты, в дальнейшей работе ведение посевного материала мутантного штамма B.licheniformis 103 осуществляли на среде ПА при 20С.
Известно, что значительное влияние на ферментативную активность микроорганизма при глубинном культивировании может оказывать возраст (длительность хранения) спорового посевного материала (Колтукова Н.В., Лугинина Т.Н., 1989). Нами был проведен эксперимент по исследованию влияния длительности хранения спорового посевного материала штамма B.licheniformis 103 на среде ПА при 20С на его ферментативную активность. Для всех вариантов опыта использовали единый исходный посевной материал, который через определенные периоды времени пересевали на среды ПА, выращивали в течение 3 суток при 35С и хранили при 20С. Глубинное культивирование проводили в колбах на среде №2 при 41 С в течение 72 - 96 ч. Данные эксперимента приведены в табл. 4. Из представленных результатов, очевидно, что для засева ферментационных сред оптимален посевной материал, хранившийся на среде ПА не менее 2 недель. Максимальная протеолитическая и амилолитическая
Влияние концентрации кукурузной муки на биосинтез ферментов штаммом В. licheniformis 103
Далее был проведен выбор оптимальной концентрации кукурузной муки на фоне 1% соевой муки, 0,25% углекислого кальция и 0,2% сульфата магния. Концентрацию кукурузной муки варьировали от 6 до 24%. В связи с тем, что уменьшение или увеличение концентрации основного субстрата может изменить динамику синтеза ферментов штаммом, ферментативные активности определяли на 48, 72, 96, 120 и 144 ч роста. Так как эксперимент проводился в несколько этапов, результаты удобнее выражать в процентах. Полученные ферментативные активности пересчитывали относительно данных, полученных на среде с 14% кукурузной муки, культивирование на которой повторялось на каждом этапе опыта. За 100% протеолитической активности приняли ПС на 72 ч культивирования при 42С на контрольной среде (100-120 ед/мл); за 100% амилолитической активности - АС при культивировании в аналогичных условиях в течение 120 ч (100 - 105 ед/мл). Данные эксперимента представлены на рис. 2. Результаты эксперимента показывают, что для синтеза штаммом протеазы и а-амилазы наиболее благоприятны ферментационные среды с содержанием кукурузной муки от 14 до 20%. При снижении концентрации кукурузной муки в среде до 10% наблюдается значительное падение протеолитической и амилолитической активности (на 30 - 35%). Максимальная протеолитическая активность наблюдается при увеличении концентрации кукурузной муки до 24%, однако использование такой среды неэкономично, ввиду большого расхода сырья, увеличения срока культивирования и повышения вязкости среды, что влечет за собой технологические затруднения.
При проведении экспериментов по оптимизации состава ферментационной среды в лабораторных условиях в качалочных колбах было отмечено, что, помимо других факторов, значительное влияние на биосинтез ферментов штаммом оказывает вязкость среды. С увеличением в среде концентрации источников азота и ростовых веществ (кормовых дрожжей, кукурузного экстракта и соевой муки) до 3% значительно возрастала вязкость ферментационных сред. Было сделано предположение, что повышение амилолитическои активности и резкое снижение активности протеиназы может быть связано не только с включением азотистых веществ и фосфора в метаболические пути синтеза данных ферментов, но и с изменением условий аэрации. Таким образом, снижение протеолитической активности может происходить не вследствие катаболитной репрессии ввиду избытка азотистых веществ или фосфора, а в результате недостатка кислорода. В связи с этим было проведено культивирование продуцента с изменением соотношения кукурузной и соевой муки в ферментационных средах. В качестве контрольной рассматривали среду, содержащую 16% кукурузной и 1% соевой муки, в среде №2 на фоне 16% кукурузной муки повысили концентрацию соевой муки до 4%, что значительно увеличило вязкость. В средах №3 и 4 концентрацию соевой муки увеличивали, соответственно снижая содержание кукурузной муки. Полученные данные представлены в табл. 8. Результаты опыта показали, что для биосинтеза штаммом протеазы оптимальна контрольная среда, содержащая 1% соевой муки. По-видимому, высокое содержание соевой муки оказывает репрессирующие влияние на синтез протеазы штаммом независимо от условий аэрации.
Для синтеза штаммом а-амилазы наиболее благоприятны среды №2 и 3, содержащие 14 -16% кукурузной и 4% соевой муки. Снижение концентрации кукурузной муки до 12% привело к падению как протеолитической, так и амилолитической активности штамма. Вероятно, такой показатель, как концентрация редуцирующих веществ, не учитывающая присутствие разветвленных декстринов, образующихся при гидролизе амилопектина и других олигосахаров, которые могут индуцировать синтез литических ферментов, дает неполное представление о качестве ферментационной среды. Поэтому увеличение концентрации соевой муки, содержащей всего лишь 25% углеводов, из которых 0,5 - 1,0% составляет крахмал, не компенсирует недостаток кукурузной муки с крахмалистостью 65 - 70%. В связи с труднодоступностью кукурузной муки на отечественных заводах был проведен ряд экспериментов по культивированию штамма на средах с полной или частичной заменой кукурузной муки пшеничной, ржаной или ячменной.
В первой части эксперимента при полной замене кукурузной муки в качестве контроля использовали оптимизированную среду, содержащую 14% кукурузной, 1% соевой муки, углекислого кальция и сернокислого магния. В опытных средах кукурузную муку заменяли пшеничной, ячменной и ржаной в концентрациях 10, 14 и 18%. Результаты опыта определяли в динамике на 48, 72, 96 и 120 ч роста. В исходных средах определяли содержание редуцирующих Сахаров и растворимого белка. Исходные характеристики ферментационных сред приведены в табл. 9. Данные опыта представлены на рис. 3. По балансу ферментов оптимальными для культивирования продуцента оказалась контрольная среда (14% кукурузной муки) и среда, содержащая 18% пшеничной муки, на которой протеолитическая активность составила 75% от контроля, а амилолитическая - 128%. На остальных вариантах сред при достаточно высоком уровне а-амилазы протеаза составляла от 20 до 61% от контроля, причем на средах с 18% пшеничной, ячменной и ржаной муки наблюдалось замедление динамики накопления протеазы на сутки.
