Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 8
2. Экспериментальная часть 59
2.1 Материалы и методы исследований 59
2.1.1 Объекты исследований 59
2.1.2 Методы исследований 60
2.1.2.1 Культивирование микроорганизмов 60
2.1.2.2 Определение ферментативной активности 61
2.1.2.3 Изучение зависимости протеолитической и амилолитической активностей от рН и температуры 63
2.1.2.4 Изучение степени гидролиза белковых субстратов 63
2.2 Результаты экспериментов и их обсуждение 65
2.2.1. Скрининг эффективной ферментативной системы для гидролиза дрожжевой биомассы 65
2.2.1.1 Сравнительная характеристика микробных протеаз различного происхождения по степени гидролиза белковых субстратов 65
2.2.1.2 Скрининг активных продуцентов комплекса ферментов протеолитического и р-глюканазного действия 65
2.2.1.3 Получение комплексного ферментного препарата КФПА протеолитического и р-глюканазного действия 74
2.2.2 Влияние ферментативного комплекса Aspergillus oryzae 387-4-1
на степень гидролиза биополимеров дрожжевой биомассы 82
2.2.2.1 Влияние индивидуальных ферментов грибного протеолитического комплекса на степень гидролиза дрожжевого белка 83
2.2.2.2 Исследование оптимальных условий ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы ферментами гриба Aspergillus oryzae 85
2.2.2.3 Подбор оптимальной мультиэнзимной композиции для эффективного гидролиза дрожжевой биомассы 92
2.2.2.4 Гидролиз дрожжевой биомассы различного происхождения побранным ферментативным комплексом 96
2.2.3 Исследование процесса и разработка технологических параметров энзиматического гидролиза дрожжевой биомассы амилопротооризином КФПА 98
2.2.3.1 Исследование влияния физико-химических методов обработки дрожжевой биомассы на эффективность процесса гидролиза полимеров клетки 98
2.2.3.2 Разработка технологического процесса гидролиза дрожжевой биомассы подобранным ферментативным комплексом 106
2.2.3.3 Производственные испытания разработанного процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы 110
2.2.4 Получение получение пищевой добавки «Протамина» - белково-аминокислотного обогатителя и БАД «Суперпротамин» на основе регулируемого процесса биокатализа дрожжевой биомассы 114
2.2.4.1 Биохимические и санитарно-гигиенические исследования белково-аминокислотного обогатителя - ферментолизата дрожжевой биомассы «Протамина» пищевого 118
2.2.4.2 Клинические испытания БАД «Суперпротамин» 122
2.2.5 Исследования и испытания эффективности применения ферментолизатов дрожжевой биомассы в различных производствах 125
2.2.5.1 Применение пищевой добавки - гидролизата дрожжевого «ПРОТАМИН» в хлебопечении 127
2.2.5.2.Использование ПРОТАМИНА в ликероводочном производстве... 128
2.2.5.3 Использование ПРОТАМИНА при производстве сухих завтраков.. 129
2.2.5.4 Применение Протамина в косметологии 129
2.2.5.5 Использование Протамина для генерации дрожжей в спиртовом производстве 130
2.2.5.6 Применение Протамина для повышения биологической полноценности сухого корма для собак с нормальной активностью 130
3 .Выводы 134
4. Список литературы
- Определение ферментативной активности
- Получение комплексного ферментного препарата КФПА протеолитического и р-глюканазного действия
- Разработка технологического процесса гидролиза дрожжевой биомассы подобранным ферментативным комплексом
- Применение пищевой добавки - гидролизата дрожжевого «ПРОТАМИН» в хлебопечении
Введение к работе
В настоящее время в структуре питания населения России преобладает углеводная пища при остром дефиците белка, пищевых волокон, незаменимых аминокислот, витаминов, микроэлементов и других биологически важных нутриентов. Только половина населения России обеспечена минимально необходимой нормой потребления белков (49 г/сутки). Мировой дефицит белка составляет около 15 млн тонн. Особенно остро ощущается недостаток животного белка, отличающегося высокой биологической ценностью. В результате неправильного питания понижается резистентность населения к неблагоприятным факторам, развиваются заболевания, сокращается продолжительность жизни.
Поэтому одним из актуальных и перспективных направлений в
решении проблемы коррекции питания для поддержания адаптивно-
компенсаторных механизмов организма человека является использование
пищевых белково-аминокислотных добавок, способствующих повышению
биологической полноценности продуктов питания, созданию
сбалансированных продуктов и напитков функционального назначения.
Дрожжевая биомасса является полноценным источником белковых
веществ, аминокислотный скор которых приближается к животному белку,
особенно по содержанию лизина. Кроме того, наличие витаминов, ценных
полисахаридов и микроэлементов позволяет рассматривать микроорганизмы,
как перспективные субстраты для получения биологически активных
добавок.
Питательная ценность дрожжевой биомассы ограничена низкой доступностью внутриклеточных биополимеров для действия пищеварительных ферментов. Для полноценного усвоения этого субстрата необходимо разрушить клеточные стенки дрожжей и перевести все содержащиеся в них биологически ценные высокомолекулярные полимеры в растворимые легко усвояемые соединения.
6 Одним из наиболее применяемых способов переработки клеточной
биомассы является метод автолиза. Однако этот метод недостаточно
эффективен, энергоемок, так как требует проведения длительного процесса.
Состав автолизатов полностью зависит от качества и физиологической
активности используемых дрожжевых клеток. Вместе с тем известно о
способности различных ферментативных систем разрушать клеточные
стенки микроорганизмов.
В связи с этим, проблема подбора активной мультиэнзимной системы, обеспечивающей интенсивный и глубокий гидролиз высокомолекулярных полимеров микробной биомассы, и создание эффективного биотехнологического процесса получения конкурентоспособных пищевых белково-аминокислотных добавок, весьма актуальна и перспективна. Реализация этого направления исследований позволит повысить удельный вес наукоемкой отечественной продукции на мировом рынке, произвести импортозамещение на отечественном рынке, т.к. высокая цена биопрепаратов и добавок ограничивает их широкое применение в пищевой промышленности России.
Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в разработке научных основ биотехнологии белково-аминокислотных обогатителей и биологически активных добавок (БАД) на основе энзиматического гидролиза высокомолекулярных полимеров дрожжевой биомассы, теоретическом и экспериментальном обосновании целесообразности использования полученных препаратов для повышения качества питания.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
провести анализ и исследовать биохимическую характеристику и гидролитическую способность ферментных препаратов различного спектра действия по отношению к структурным полимерам дрожжевой клетки;
обосновать необходимость использования комплекса ферментов и
осуществить скрининг эффективной ферментативной системы,
гидролизующей белковые вещества и полисахариды дрожжевых клеток;
исследовать влияние ферментативного комплекса на процессы
гидролиза биополимеров дрожжевой биомассы;
исследовать влияние индивидуальных ферментов протеолитического комплекса на степень гидролиза дрожжевого белка;
разработать оптимальные условия и мультиэнзимную систему для направленного ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы;
разработать и испытать в производственных условиях
биотехнологический процесс ферментолиза дрожжевой биомассы с
получением биологически активных добавок со специальными свойствами.
Определение ферментативной активности
Важной характеристикой любой ферментной системы является уровень активности отдельных ферментов комплекса. В настоящем исследовании проводилось определение различных ферментативных активностей, позволяющих составить представление о качественном и количественном составе того или иного комплекса, а также направленности его действия.
Амилолитическая активность Амилолитическую активность определяли общепринятым методом гидролиза крахмала по ГОСТу РФ 20264.4-89. Общая протеолитическая активность
Протеолитическая активность характеризует способность фермента катализировать расщепление белков до аминокислот или пептидов. Протеолитическую активность (ПС) определяли модифицированным методом Ансона по гидролизу гемоглобина препаратам фермента с последующей его инактивацией и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ). За единицу активности принимали такое количество фермента, которое за 1 мин при 30С способствовало образованию 1 мкм тирозина при гидролизе белка (Полыгалина Г.В. и др., 2003).
Активность индивидуальных протеолитических ферментов Активности сериновой, карбоксильной и металлопротеиназ, лейцинамино- и карбоксипептидаз измеряли по специфическим субстратам. Для обнаружения возможного вклада в гидролиз субстратов других протеаз комплекса применяли специфические ингибиторы. За единицу активности во всех случаях принимали такое количество фермента, которое в стандартных условиях за 1 мин расщепляло 1 мкм субстрата.
Активность сериновой протеиназы определяли по специфическому субстрату n-нитроанилид бензол-оксикарбонил-Ь-аланил-Ь-аланил-Ь-лей-цину (Z-Ala-Ala-Leu-pNa, завод химреактивов "Олайне"). При определении вклада в гидролиз субстрата других протеолитических ферментов комплекса применяли специфический ингибитор сериновой протеиназы фенилметилсульфонилфторид (PMSF, фирмы "Serva", Германия) [Епремян А.С.идр., 1981].
Об активности нейтральной металлопротеиназы судили по гидролизу специфического субстрата динитрофенил-Ь-глицил-Ь-глицил-Ь изолей- цил-Ь-аргинина (DNP-Gly-Gly-Ile-Arg), синтезирован Л.А.Люблинской). Активность металлопротеиназы подавляли атилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) [Люблинская и др., 1976].
Наличие активности карбоксильной протеиназы подтверждали с помощью специфического ингибитора пепсина їч[-диазоацетил-І\Р-2,4-динитрофенил-этилендиамина (ДДЭ). Активность нейтральной протеиназы, которая также могла гидролизовать субстрат, подавляли CuCl . Остаточную активность определяли по методу Ансона с гемоглобином [Ковалева и др., 1977]. N-нитроанилид-Ь-лейцин служил специфическим субстратом при определении активности лейцинаминопептидазы [Иванова и др., 1977]. Активность карбоксипептидазы определяли по специфическому субстрату динитрофенил-Ь-глицил-Ь-глицил-Ь-аргинину (DNP-Gly-Gly-Arg) [Азаренкова и др. 1976]. Экзо-Р-глюканазная активность Метод основан на определении восстанавливающих Сахаров, образующихся при действии фермента на ячменный р-глюкан [Полыгалина и др., 2003 г.]. Ксиланазная активность Определение ксиланазной активности основано на способности фермента расщеплять ксилан с образованием восстанавливающих Сахаров [Полыгалина и др., 2003 г.] Целлюлазная активность Активность комплекса целлюлаз определялась по гидролизу карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) [Полыгалина и др., 2003 г.].
Влияние температуры и рН на общую протеолитическую активность ферментного препарата определяли по результатам его воздействия на 2%-ный раствор гемоглобина при различных температурах и рН.
Аналогично определяли оптимум рН и температуры действия а-амилазы. В качестве субстрата использовали 1%-ный раствор крахмала.
При изучении степени гидролиза микробного белка объектом исследований являлись сухие дрожжи Saccharomyces cerevisiae, из которых готовили 30%-ную водную суспензию. Ферментолиз осуществляли исследуемыми протеолитическими препаратами при 50 С в течение 5 ч из расчета 5 - 25 ед ПА/г сухих дрожжей в зависимости от условий эксперимента. Процесс гидролиза дрожжевой биомассы оценивали по нарастанию в получаемых ферментолизатах концентрации растворимых сухих веществ (по рефрактометру), аминного азота, растворимого белка. В качестве контроля служила дрожжевая суспензия, не обработанная протеазами и подвергнутая автолизу в условиях, аналогичных опыту.
Получение комплексного ферментного препарата КФПА протеолитического и р-глюканазного действия
С целью получения концентрированных ферментных препаратов были исследованы и подобраны оптимальные условия выделения мультиэнзимных препаратов с различным ферментативным составом из культуральной жидкости мутантного штамма микромицета A. oryzae 387-4-1 и природного штамма 251.
Для получения ферментного препарата Протооризин с преобладающей протеолитической активностью использовали такое свойство протеолитического комплекса гриба A. oryzae, как устойчивость к низким значениям рН. Известно, что микромицеты A. oryzae 387-4-1 и 251 синтезируют наряду с исследуемыми ферментами другие гидролазы, например а-амилазу. Поэтому, для получения комплексного протеолитического препарата, не содержащего р-глюканазу и а-амилазу, применяли культуральную жидкость (КЖ) гриба A. oryzae 251, предварительно подвергнутую кислотной инактивации ферментов. При этом, кислые протеазы были устойчивы к понижению рН, и уровень их активности после подкисления по отношению к активности в исходной КЖ снизился только на 25%, в то время как активность Р-глюканазы и а-амилазы не проявилась из-за кислотной инактивации ферментов (рис. 1).
Выделение, очистка и концентрирование ферментных препаратов осуществляли методом осаждения ферментов этанолом из супернатанта КЖ, а также с помощью мембранных процессов, включающих микрофильтрацию и ультрафильтрацию.
Получение ФП категории очистки Г10х осуществляли методом осаждения ферментов этиловым спиртом (96 % об.) из супернатанта культуральной жидкости (КЖ) Aspergillus oryzae, варьируя соотношение растворителя и супернатанта КЖ, при различных значениях рН.
В результате были подобраны оптимальные условия получения концентрированных спиртоосажденных препаратов: рН 5,0 и соотношение этанол : КЖ =3 : 1 (табл.7 ). Выход препарата составил по протеолитической активности 90%, по Р-глюканазе 85%.
Проведены производственные испытания и наработаны опытные партии ферментного препарата Амилопротооризин в промышленных условиях Бердского завода биопрепаратов. Наработаны 3 вида препаратов, различающиеся по способам очистки и концентрирования: - (1) с использованием методов микрофильтрации, ультрафильтрации и сушки распылением; - (2) сушка распылением фильтрата культуральной жидкости Aspergillus oryzae - источника кислой протеазы; - (3) вакуум-сушка ферментного препарата кислой протеазы, полученного осаждением ферментов этиловым спиртом.
Проведены сравнительные исследования ФП по уровню в них общей и удельной протеолитической активности (табл.9).
Как видно из представленных данных, самая высокая удельная активность по протеазам наблюдалась в ФП 3 (1000: 400 =2,5 ед ПС/мг белка). При получении ФП методом осаждения этанолом были оптимизированы параметры концентрирования и подобрано оптимальное соотношение спирта и культуральной жидкости, что способствовало максимальному выделению фермента. При концентрировании ФП методом ультрафильтрации имели место потери, поэтому в дальнейшем были подобраны мембраны с размером пор, соответствующим молекулярной массе ферментов.
Подбор штамма-продуцента и условий его культивирования являются ключевым моментом в разработке биотехнологии производства ферментных препаратов микробного происхождения. При этом особое внимание уделялось изучению состава ферментативного комплекса, синтезируемого исследуемым микроорганизмом (табл. 10). Это позволило определить сферу и производственно-экономические аспекты его использования. Наличие ферментативного комплекса с широким спектром действия будет способствовать эффективной конверсии высокомолекулярных полимеров микробного сырья при получении биологически активных добавок.
Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что наибольшей гидролитической способностью по отношению к гемицеллюлозе и белковым полимерам микробной клетки из исследованных ферментных препаратов протеолитического действия обладал ферментный препарат амилопротооризин КФПА, выделенный из A. oryzae 387-4-1. Поэтому в дальнейшем исследовали процессы биокатализа высокомолекулярных структур дрожжевых клеток под действием амилопротооризина КФПА.
Выявление роли гидролитических ферментов исследуемого комплекса в эффективности гидролиза микробного белка, создание оптимальных мультиэнзимных композиций и параметров катализа позволит получать пищевые добавки с высоким содержанием свободных аминокислот для повышения биологической ценности продуктов питания.
Разработка технологического процесса гидролиза дрожжевой биомассы подобранным ферментативным комплексом
Разработанные технологические процессы биоконверсии остаточных пивных и хлебопекарных дрожжей были апробированы в производственных условиях Тульского пивоваренного и Московского дрожжевого заводов. Промышленная наработка ферментолизата хлебопекарных (Saccharomyces cerevisiae) или пивных дрожжей (Saccharomyces carlsbergensis) осуществлялась на установке, состоящей из реактора, где непосредственно проводили ферментолиз дрожжевой суспензии, промежуточной емкости для охлаждения и хранения ферментолизата и сушильных агрегатов для сушки готовой продукции.
Реактор наполняли суспензией хлебопекарных дрожжей с концентрацией сухих веществ 16-19%. Дрожжевую суспензию подвергали термолизу при 85-90С в течение 15 мин при рН 5,0-5,5. Массу выдерживали при перемешивании, затем охлаждали до 50С и задавали амилопротооризин из расчета 5,0-10,0 ед. ПС/г сухих веществ дрожжевой суспензии. Протеолиз проводили при 50С в течение 14-16 часов. По окончанию гидролиза ферментолизат дрожжей пастеризовали при 80-85С и захолаживали. Сушку готового продукта осуществляли на распылительной сушилке с получением сухой аминокислотной смеси - гидролизата дрожжевого.
Испытания по гидролизу биомассы остаточных пивных дрожжей проводили по аналогичной схеме. Контроль протеолиза осуществляли по нарастанию концентрации растворимых сухих веществ и аминного азота в получаемом ферментолизате. В готовом продукте определяли содержание сырого протеина, массовой доли влаги и аминного азота.
Высокая степень гидролиза дрожжевой биомассы амилопротооризином была достигнута при использовании КФПА в дозировке 7-10 ед. ПС/г биомассы после 10-12 часов ферментолиза (рис.11). При дозировке 5 ед ПС продолжительность процесса составила 16 ч.
Концентрация аминного азота в готовых ферментолизатах дрожжевой биомассы составила 2,0-3,5%. При этом степень гидролиза белка хлебопекарных дрожжей достигала 80-85%, а пивных - 78-82%. Помимо гидролиза белковых веществ протоплазмы ферментный препарат амилопроооризин катализирует расщепление полисахаридов клеточных стенок дрожжей. Содержание редуцирующих углеводов в ферментолизатах хлебопекарных и пивных дрожжей составило 8,8-11,5% и 6,0-6,6%, соответственно. Дальнейшее увеличение длительности гидролиза не оказывало существенного влияния на степень деструкции высокомолекулярных полимеров клетки. В результате наработаны опытные партии гидролизата дрожжевого «Протамин», средние показатели которых представлены в таблице 19.
Таким образом, разработаны оптимальные технологические параметры энзиматического гидролиза дрожжевой биомассы ферментативным комплексом амилопротооризина. Производственные испытания подтвердили эффективность использования комплексного ферментного препарата амилопротооризин (КФПА) для гидролиза клеточных стенок и протоплазмы хлебопекарных и остаточных пивных дрожжей с получением аминокислотных смесей - пищевых и биологически активных добавок.
Сравнительная характеристика технологий гидролиза дрожжевой биомассы существующим ранее методом автолиза и разработанным способом ферментолиза приведена в таблице 20.
Отличительной особенностью разработанного нами метода является то, что впервые осуществлена комплексная переработка дрожжевой биомассы под действием нового ФП амилопротооризин КФПА. Метод основан на регулируемом процессе биокатализа дрожжевых клеток с получением пищевых добавок «Протамин» и БАД «Суперпротамин» (рис.13).
При использовании в качестве источника дрожжевой биомассы живых клеток дрожжей, обладающих бродильной активностью, для устранения процессов вспенивания и брожения перед началом гидролиза проводится инактивация дрожжей путем нагревания дрожжевой суспензии до температуры 75-90С в течение 15-20 минут. Гидролиз дрожжевой биомассы ведется при естественном значении рН дрожжевой суспензии (4,5-6,0, в зависимости от вида используемых дрожжей), одним комплексным ферментным препаратом амилопротооризином (продуцент Aspergillus oryzae sp.) с преобладающей протеолитической активностью (1000-1050 ед ПС/г) в слабокислой зоне рН, содержащий наряду с протеиназами (карбоксильной, сериновой и металзависимой) активные карбокси-и аминопептидазы, позволяющие достигать глубокого гидролиза белков.
В качестве пищевой добавки был получен «Протамин» - белково-аминокислотный обогатитель (после 4-х часового гидролиза). БАД «Суперпротамин» получали после 12-ти часового гидролиза дрожжевой биомассы.
Применение пищевой добавки - гидролизата дрожжевого «ПРОТАМИН» в хлебопечении
При производстве хлебобулочных изделий ПРОТАМИН дозировали в количестве от 1 до 5% в зависимости от вида. При добавлении ПРОТАМИНА в замес сокращается процесс созревания теста, отмечается повышение подъемной силы дрожжей, которая составляла 35-38 минут против 40-45 минут в контроле (без добавления ПРОТАМИНА). В процессе созревания теста наблюдается более интенсивный газообмен, при этом изменяется показатель газообразующей способности дрожжей, который составил 1750-2000 мл С02 /г СВ в опытных вариантах, в то время как в контрольном он был равен 1000-1300 мл С02 /г СВ.
Использование ПРОТАМИНА при замесе теста позволяет уменьшить расход дрожжей на 30-50% , сократить длительность процесса созревания теста, улучшить органолептические и физико-механические свойства готовой продукции: повышается равномерная пористость изделий, увеличивается удельный объем хлеба и улучшаются физико-механические свойства мякиша. Введение ПРОТАМИНА способствует образованию более интенсивной окраски корки хлеба, создает более приятный вкус и аромат, ведет к уменьшению скорости черствения хлеба. Использование ПРОТАМИНА осуществляют с целью повышения и разнообразия органолептических достоинств напитков. Введение
ПРОТАМИНА в водно-спиртовые растворы при купажировании ликероводочных изделий осуществляли в виде вкусо-ароматической добавки в количестве от 0,01 до 2% в зависимости от рецептуры изделия. Использование ПРОТАМИНА, содержащего растворимые углеводы, пептиды, аминокислоты, микро- и макроэлементы, позволяет смягчить вкус водок, бальзамов, придавая им большую насыщенность и тем самым повышая качество изделий. Это было подтверждено результатами дегустационных комиссий ВНИИПБТ.
ПРОТАМИН используется при приготовлении таких видов ликероводочных изделий, как: «Новэре», «Сибирская элитная люкс» /Ишимский винно-водочный завод/, «Солнечный камень» /ЛВЗ «Икалто»/, «Франт крепкая» /ЛВЗ «Фаюр-Союз»/, «Алеша», «Сергей» /Калужский ЛВЗ/, «Штрафная рота» /Калининградский завод шампанских вин/, «Тагайская легенда», «Боярин» /Уссурийский ЛВЗ/ и другие. Ликероводочные изделия, приготовленные по рецептурам, в состав которых входит ПРОТАМИН, пользуются повышенным спросом у покупателей.
ПРОТАМИН рекомендуется к использованию в качестве вкусо-ароматической добавки в составе сухих экструзионных завтраков из зернобобовых, сухих концентратов для супов и соусов. Рекомендуемая доза от 5 до 20% в зависимости от рецептуры. Введение ПРОТАМИНА в состав экструзионных продуктов улучшает их вкусовые качества, сокращает расход или полностью исключает из рецептуры натриевую соль, улучшает ароматику готового продукта, придает ему грибной запах и вкус.
Биологически активный аминокислотный препарат Протамин может быть использован в парфюмерно-косметической отрасли в составе косметических изделий для ухода за кожей и волосами.
Предварительная апробация этого препарата была проведена в клинических условиях; он использовался при приготовлении лечебно-профилактических лосьонов. При этом имел место положительный эффект: улучшалось питание кожного покрова головы и корневой системы волос.
Парфюмерно-косметической фирмой «Квадрига» разработан лосьон для волос Neotonus лечебно-профилактического действия. Его биологически активной основой является ферментолизат пивных дрожжей Протамин пищевой. Кроме того, в состав рекондиционера для волос вводят экстракты крапивы, хмеля, женьшеня и лаванды.
