Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Применение нитрита натрия в производстве мясных продуктов 11
1.2. N-нитрозоамины и другие побочные эффекты остаточного нитрита натрия в мясных продуктах 22
1.3. Превращения нитрита натрия в мясных продуктах
1.4. Механизм проявления нитритом натрия антимикробных свойств
1.5. Механизм проявления нитритом натрия антиокислительных свойств
1.6. Механизм образования окраски мясных продуктов 31
1.7. Механизм формирования органолептических свойств мясных продуктов 33
1.8. Способы снижения остаточного нитрита натрия. Бактериальная денитрификация 36
1.9. Применение микроорганизмов в производстве мясных продуктов. Staphylococcus carnosus и его генетический аппарат денитрификации 42
Глава 2. Методики постановки эксперимента и методы исследований 47
2.1. Схема постановки эксперимента. Характеристика объектов исследования 47
2.2. Методы исследований 50
2.2.1. Выделение плазмиды из грамотрицательных микроорганизмов 50
2.2.2. Выделение плазмиды из грамположительных микроорганизмов 51
2 2.3. Выделение хромосомной ДНК из прокариотических и эукариотических микроорганизмов 52
2. 2.4. Очистка плазмидной и хромосомной ДНК в градиенте хлористого цезия 53
2.2.5. Выделение фрагмента ДНК из легкоплавкой агарозы 54
2.2.6. Закладка штамма на хранение в глицерине 55
2.2.7. Приготовление компетентной культуры Е. coli для трансформации электропорацией 55
2.2.8. Электропорация Е. coli 56
2.2.9. Перенос по Саузерну 56
2.2.10. Гибридизация по Саузерну 58
2.2.11. Лигирование ДНК 59
2.2.12. Рестрикция ДНК 60
2.2.13. Щелочное дефосфорилирование ДНК 60
2.2.14. Полимеразная цепная реакция 61
2.2.15. Получение мутантных штаммов, дефектных по гену thy А 63
2 2 16 Приготовление компетентной культуры Staphylococcus carnosus для трансформации электропорацией 64
2.2.17. Электропорация компетентной культуры Staphylococcus carnosus 64
2.2.18. Определение содержания нитрита натрия в бактериальной среде и мясных продуктах 66
2.2.19. Определение степени окисления жира по пероксидному числу 67
2.2.20. Дистилляционный метод определения окислительных изменений с 2-тиобарбитуровой кислотой 68
2.2.21. Определение кислотного числа 68
2.2.22. Определение содержания нитрозопигментов мясных продуктах 69
2.2.23. Оценка органолептических показателей 69
2.2.24. Оценка микробиологических показателей 70
2.2.25. Определение количества молочнокислых микроорганизмов 73
2.2.26. Определение влагосвязывающей способности мясопродуктов 74
2.2.27. Потенциометрический метод определения рН мясопродуктов 74
2.2.28. Определение массовой доли влаги 75
2.2.29. Определение массовой доли белка 75
2.2.30. Определение массовой доли жира 77
2.2.31. Определение массовой доли золы 77
2.2.32. Определение содержания хлорида натрия 78
2.2.33. Клинические испытания in vivo 79
Глава 3. Разработка систем селекции и экспрессии. Получение штамма-продуцента фермента нитритредуктазы 80
3.1. Выбор штамма для создания продуцента фермента нитритредуктазы 80
3.2. Конструирование термочувствительного вектора pBTmcs для грамположительных микроорганизмов 82
3.3. Получение штамма Staphylococcus carnosus (thyA~) 85
3.4. Получение в составе pUC 19 конструкций для замещения промотора нитритредуктазного оперона 86
3.4.1. Клонирование флангов для интеграции 86
3.4.2. Клонирование промоторов 88
3.4.3. Клонирование селективных маркеров 89
3.4.4. Получение промежуточных конструкций 92
3.4.5. Получение конечных конструкций 93
3.5. Введение в составе pBTmcs конструкций для замещения промотора нитритредуктазного оперона 95
3.6. Трансформация, получение интеграции плазмид для замещения промотора оперона nir и изучение нитритредуктазной активности клонов 96
3.7 Замена селективного маркера в pBT-dxyl-nirR 99
3.8. Замена промотора гена xylA в плазмиде рВТ 100
3-9. Трансформация, получение интеграции плазмиды pBT-thyA-gap-nirR и изучение нитритредуктазной активности клонов 100
Глава 4. Изучение нитритредуктазной активности штамма S. carnosus LIA -96
с использованием модельной фаршевой системы 103
Глава 5. Разработка бактериального препарата «Биоцвет» 106
Глава 6. Комплексное исследование вареных колбас, изготовленных с применением бактериального препарата «Биоцвет» 112
Социальные и экономические эффекты от использования бактериального препарата «Биоцвет» 119
Заключение по работе 120
Выводы 123
Список использованной литературы 125
Приложение 1 135
- N-нитрозоамины и другие побочные эффекты остаточного нитрита натрия в мясных продуктах
- Выделение плазмиды из грамотрицательных микроорганизмов
- Дистилляционный метод определения окислительных изменений с 2-тиобарбитуровой кислотой
- Определение массовой доли жира
Введение к работе
Актуальность работы
Повышение качества, а, следовательно, безопасности выпускаемой продукции, является одной из важных задач, стоящих перед пищевой промышленностью. Эта задача в полной мере относится к мясному производству.
Пропаганда продуктов здорового питания обуславливает возрастающий к ним потребительский интерес, тем самым, вынуждает производителей все больше обращать внимание на качество выпускаемых продуктов питания.
В мире широко освещена проблема присутствия остаточного нитрита натрия в мясных продуктах и его негативного влияния на здоровье людей. На сегодняшний день вопрос о возможных путях снижения содержания нитрита натрия в мясных изделиях является весьма актуальным. Отсутствие веществ, способных функционально заменить нитрит натрия, не позволяет полностью исключить его из рецептур мясных продуктов, поэтому необходимо вести работы по изысканию способов снижения его остаточных концентраций.
Одним из основных приемов восстановления нитрита натрия в технологии мясопродуктов является использование различных денитрифицирующих стартовых культур, но ограничение по уровню вводимых микроорганизмов все же не позволяет получать продукты с полным отсутствием нитрита натрия. Это связано с недостаточно высоким уровнем синтеза фермента нитритредуктазы.
Благодаря развитию таких наук, как генетика и молекулярная биология, стало возможным получение микроорганизмов с заданными свойствами. Генная инженерия обладает хорошо разработанным инструментарием, что позволяет изменять протекание различных биохимических реакций в микроорганизмах согласно поставленным задачам. Технология рекомбинантных ДНК является перспективным способом, как для повышения экспрессии различных ферментов бактериальными штаммами, в частности, нитритредуцирующего белка, так и для инактивации нежелательных путей синтеза.
Теоретическим и практическим работам, основанным на фундаментальных исследованиях в области биотехнологии и генной инженерии, посвящены многочисленные научные труды отечественных и зарубежных ученых: Л.В. Антиповой, В.И. Ганиной, Г.Ф. Жукова, В.А. Лившица, Н.Н. Липатова (мл.), А.Б. Лисицына, Л.Ф. Митасевой, И.А. Рогова, В.И. Соловьева, Е.И. Титова, В.В. Хорольского, S. Erkkila, F. Gotz, R. Cammack, R. Knowles, B. MacDonald, F. Niinivaara, R.P. Novick, J.A. Perigo, C.S. Tellefson, W.G. Zumft.
Данная работа была направлена на получение, с помощью генной инженерии, штамма микроорганизма активно редуцирующего нитрит натрия, исследование его способности восстанавливать нитрит натрия в модельной фаршевой системе, изучение целесообразности его применения в технологии мясных продуктов, в частности, вареных колбас.
Цель и задачи исследования
Целью работы является разработка бактериального препарата на основе штамма-продуцента фермента нитритредуктазы для снижения остаточного нитрита натрия в мясных продуктах.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
выбрать штамм из коллекции МГУПБ для создания штамма-продуцента фермента нитритредуктазы;
получить штамм-продуцент фермента нитритредуктазы с применением генной инженерии;
установить значения остаточных концентраций нитрита натрия в модельных фаршевых системах при использовании штамма-продуцента;
оценить степень биологической безопасности штамма-продуцента in vivo;
разработать бактериальный препарат на основе штамма-продуцента фермента нитритредуктазы;
разработать и утвердить нормативную документацию на бактериальный препарат;
оценить эффективность использования штамма-продуцента фермента нитритредуктазы для снижения уровня остаточного нитрита при производстве мясных продуктов на примере вареных колбас;
изучить влияние бактериального препарата на микробиологические, органолептические, химические и технологические показатели вареных колбас;
разработать рецептуру и технологию вареной колбасы с использованием бактериального препарата, апробировать ее в производственных условиях и разработать проект нормативных документов на данный вид изделий.
Научная новизна работы Проведено сравнение нитритредуктазной активности штаммов Staphylococcus carnosus и Staphylococcus xylosus коллекции МГУПБ, и выбран штамм с максимальной денитрифицирующей активностью -Staphylococcus carnosus В-8953; Путем генетических методов получен штамм-продуцент фермента нитритредуктазы на основе штамма Staphylococcus carnosus (thyA~). Показана важность наличия всех белковых продуктов нитритредуктазного оперона штамма Staphylococcus carnosus для активного восстановления нитрита;
Установлено, что в модельных фаршевых системах штамм-продуцент полностью восстанавливает нитрит в количестве 3 мг на 100 г фарша за 6 ч, 5 мг/100 г - за 12 ч, 7,5мг/100г-за14ч;
Применение бактериального препарата на основе штамма-продуцента нитритредуктазы обеспечивает полное восстановление нитрита натрия в мясных изделиях.
Практическая значимость
Проведены доклинические испытания штамма-продуцента S. carnosus LIA-96 in
vivo на белых линейных мышах, в результате которых штамм был признан
безопасным по показателям безвредности, токсичности, токсигенности и
вирулентности;
Штамм Staphylococcus carnosus LIA-96 депонирован по форме национального патентного депонирования в ВКПМ ГосНИИгенетика под номером В-9518;
На основе штамма-продуцента фермента нитритредуктазы разработан бактериальный препарат «Биоцвет» для производства термически обработанных предварительно ферментированных мясных изделий, ТУ 9229-047-02068640-07, применение которого позволяет получать вареные колбасные изделия с полным отсутствием нитрита без снижения показателей качества;
Установлен оптимальный уровень вводимого бактериального препарата «Биоцвет» - 100 г на 100 кг фарша во время посола мясного сырья при содержании клеток 109 КОЕ/г и оптимальные режимы посола (вакуумная мешалка, время посола- 6часов,t = 8... 12С);
Проведены исследования органолептических, химических, микробиологических показателей опытных образцов вареных колбас. Установлено, что во всех образцах, кроме контрольного, отсутствуют ионы нитрита. При этом образец, приготовленный с добавлением 0,003% нитрита, не уступал контрольному по качественным характеристикам.
В результате проведенных исследований и производственных испытаний в промышленных условиях ОАО «ИКМА» разработана рецептура и технология, а также проект нормативной документации на колбасу вареную «Экстра-М» первого сорта, ТУ 9213-...-02068640-08.
Апробация работы
Основные положения работы и результаты исследований были представлены на следующих конкурсах и конференциях:
Финалист конкурса на1 премию Георга Фридриха Хана, Немецко-Русский институт современных технологий пищевых продуктов и маркетинга (Санкт-Петербург, 2004).
Медаль за разработку штамма-продуцента фермента нитритредуктазы, полученная на конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007).
Победитель молодежного научно-инновационного конкурса «УМНИК 2007» (Пущино, 2007).
Диплом за разработку бактериального препарата «Биоцвет», полученный на конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2008).
Всероссийский конкурс на лучшие научные работы студентов по техническим наукам (проекты в области высоких технологий) и инновационным научно-образовательным проектам (Москва, 2004).
Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2006), II Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003,2005,2007,2008),
Научно-практическая конференция «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем» (Калининград, 2005), Международная конференция «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004), Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006), VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007).
Технология апробирована в промышленных условиях ОАО «ИКМА».
Публикации
По результатам исследований, изложенных в диссертационной работе, опубликовано 14 печатных работы, (в т.ч. статей в журналах, рекомендованных ВАК - 2, в других изданиях -11), 1 патент, лабораторный практикум.
Структура и объем работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, экспериментальной части с обсуждением результатов исследований, выводов, списка литературы, содержащего 103 источников, в том числе 95 работы зарубежных авторов, и приложений.
Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 47 рисунков.
N-нитрозоамины и другие побочные эффекты остаточного нитрита натрия в мясных продуктах
Исследование проводилось при значениях рН от 5,1 до 6,4 с добавлением и без добавления нитрита натрия и при различном времени воздействия, от 30 минут до 2 часов. В результате показано незначительное ингибирование роста микроорганизмов в кислой среде, в то время как комбинация кислой среды и нитрита натрия полностью подавляет рост патогенных микроорганизмов. При кислых значениях рН среды нитрит оказывает бактерицидное действие на такой патогенный организм как Helicobacter pylori [26]. Эффект нагревания В технологических процессах различные виды посоленного мяса подвергаются термообработке, в результате чего происходит уничтожение вегетативных клеток. Нагревание нитрита натрия в бактериологической среде приводить к образованию оксида азота и его производным, которые являются более токсичными для бактерий, чем сам нитрит натрия. Perigo и др., 1967 г., в своих исследованиях показали, что нитрит натрия, нагреваемый в бактериологической среде, оказывает более выраженный ингибирующий эффект на рост С. sporogenes, чем нитрит натрия, добавленный к среде после автоклавирования. Этот эффект наблюдался в интервале температур от 95 до 125 С и рН 6 (эффект Периго) [74].
Дальнейшие изучения Perigo и Roberts, 1968 г., показали увеличенное ингибирующее действие термообработанного нитрита натрия в бактериологической среде более чем на 30 штаммах клостридий различных видов [75]. Какова же природа антимикробного действия нитрита в мясных продуктах? При добавлении к мясному сырью, под воздействием различных факторов из нитрита натрия образуется соединение, играющее основную роль в проявлении антимикробного эффекта - оксид азота (N0). Так, оксид азота является токсичным соединением для бактерий рода Clostridium и Listeria, которые имеют низкую концентрацию ферментов, участвующих метаболизме нитрита [71]. В 1992 группой ученых под руководством Cammack было показано, что оксид азота в 125 раз более эффективно действует на данные бактерии, чем сам нитрит [17]. В том же самом эксперименте участвовали и другие NO-донирующие соединения, цитотоксичное действие которых было на четыре порядка выше, чем у нитрита. Одним из них была красная соль Росина - нитрозильный комплекс железа, употреблявшаяся до конца 19 века при стерилизации воды. Нитрозильные комплексы железа донируют оксид азота при физиологических значениях рН без какой-либо активации (фото-, термо- или редокс-) и при разложении этих комплексов не образуется никаких токсичных или канцерогенных веществ [22]. Основной мишенью оксида азота при попадании в микробную клетку являются: Ферменты и белки Клеточная стенка и мембрана
Связывание незаменимых питательных соединений Генетический аппарат Ферменты и белки Это, прежде всего, жизненно важные белки гликолитического пути и цикла Кребса, дыхательные белки, которые инактивируются при взаимодействии оксида азота с из железо-серными кластерами [2Fe-2S] и [4Fe-4S]. К этим белкам относятся: аконитаза, НАДН-дегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, цитохром с редуктаза, оксидоредуктаза и др.). Оксид азота является высокореактивным соединением и хорошо связывается с металлами с переменной валентностью (Fe, Со, Си, Мп), входящих в состав таких кластеров [16]. Tompkin и др. показали в своих экспериментах, что при добавлении к консервированной свинине атомов железа в составе железосодержащей соли, печени или сердца происходит уменьшение антиботулинистического действия нитрита натрия. Это связано с титрованием оксида азота атомами железа, тем самым, исключая его цитотоксический эффект [91]. Кроме Fe-S кластеров оксид азота взаимодействует со следующими компонентами белков: гемовыми группами, тиолами, ароматическими и фенольными остатками, тирозильными радикалами. В работах Woods и др. доказано, что одним из важных механизмов цитотоксического действия на CI. sporogenes является взаимодействие NO и негемового атома железа пируват-ферредоксин оксидоредуктазы [101], [102]. Аналогичная работа была проведена Carpenter и др. на С/, botulinum. Payne и др. изучили влияние нитрозильных комплексов на следующие белки клостридий: пируват:ферродоксин редуктаза и гидрогеназа; они показали ингибиторное влияние на синтез Fe-S кластеров [72]. Показана чувствительность Fe-S содержащего белка - феррохелатазы, который встраивает атом железа в гемовую группу [33]. Клеточная стенка и мембрана Оксид азота нарушает процесс синтеза клеточной стенки бактерий, связываясь со строительными мономерными единицами полимерного S-слоя клеточной стенки. Взаимодействие оксида азота с компонентами клеточной стенки C.sporogenes и L. monocytogenes рассмотрено в работах [19], [77]. Связывание незаменимых питательных соединений Как уже упоминалось выше, оксид азота, способен связывать атомы металлы с переменной валентностью, тем самым он может блокировать их поступление в клетку из внешней среды.
Это происходит за счет инактивации заряда металлы, который необходим для транспорта внутрь бактерии [17]. Генетический аппарат Оксид азота и его производные - нитрозотиолы наносят повреждения генетическому аппарату клетки, вызывая разрывы цепочки ДНК [52], [69]. Повреждения ДНК: образование необычных оснований и разрывы цепочек под действием оксида азота показаны также в работе Wogan и Juedes [100].
Выделение плазмиды из грамотрицательных микроорганизмов
Выделение плазмиды из грамотрицательных микроорганизмов [6] 1. Нарастить «ночную» культуру в требуемом объеме питательной среды с подходящим антибиотиком. 2. Отделить клетки от питательной среды центрифугированием три раза по 1,5 мл в эппендорфе в течение 3 мин при 14500 об/мин. 3. Осадок ресуспендировать в 200 мкл раствора I . 4. Выдержать 5 мин. 5. Добавить 400 мкл раствора II (мягко перемешать). 6. Поместить в ледяную баню на 2-3 мин. 7. Добавить 300 мкл раствора III (с перемешиванием). 8. Поместить в ледяную баню на 10 мин. 9. Центрифугировать при 14500 об/мин в течение 5 мин. 10. Перелить в новый эппендорф. 11. Добавить 650 мкл изопропанола. 12. Встряхивать в течение 2 мин. 13. Центрифугировать при 14500 об/мин в течение 6 мин. 14. Растворить осадок в 500 мкл воды. 15. Добавить 250 мкл насыщенного раствора LiCl. 16. Выдержать при -20 С в течение 30 мин. 17. Центрифугировать при 14500 об/мин в течение 5 мин. 18. Надосадочную жидкость перелить в новый эппендорф. 19. Добавить 600 мкл изопропанола. 20. Перемешать, выдержать 5 мин на столе. 21. Центрифугировать при 14500 об/мин в течение 6 мин. 22. Промыть осадок в 700 мкл 80%-ного этанола. 23. Центрифугировать при 14500 об/мин в течение 5 мин. 24. Подсушить осадок при 37 С в течение 10-15 минут. 25.
Растворить осадок в 20 мкл бидистиллята (оМНгО) или буфера ТЕ. 26. Провести рестрикцию по уникальному сайту и определить концентрацию при помощи гель-электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле при напряженности электрического поля 5 В/см. раствор I: 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис, рН 8,0. раствор II: 1% NaOH, 1% додецил сульфат натрия (SDS) (готовить перед применением!). раствор III: З М ацетат натрия, довести рН до 4,5-5 при помощи уксусной кислоты . 1. Нарастить «ночную» культуру в 600 мл питательной среды. 2. Центрифугировать в пробирку при 8000 об/мин в течение 5 мин. 3. Ресуспендировать осадок в 30 мл раствора, включающего 6,7% глюкозы,. 50 мМ трис, 1 мМ ЭДТА. 4. Нагреть до 37 С. 5. Добавить 7,5 мл раствора лизоцима (10 мг/мл 25 мМ трис, рН 8,0). 6. Инкубировать при 37 С в течение 5 мин. 7. Добавить 3,75 мл раствора 0,25 М ЭДТА, 50 мМ трис, рН 8,0. 8. Добавить 2,25 мл раствора SDS (20% раствор SDS в 50 мМ трис,20 мМ ЭДТА, Н 8,0). 9. Перемешать. 10. Инкубировать в течение 5-10 мин при 37 С до полного лизиса клеток. 11. Интенсивно перемешать в течение 30 сек. 12. Добавить 2,4 мл свежего раствора З Н NaOH. 13. Аккуратно перемешать, перевернув пробирку несколько раз. 14. Добавить 3,9 мл 2,0 М раствора трис-НС1, рН 7,0. 15. Добавить 5,7 мл 5,0 М раствора NaCl. 16. Добавить 55,8 мл фенола, насыщенного 3% NaCl, тщательно перемешать. 17. Центрифугировать при 8000 об/мин в течение 5 мин. 18. Отобрать верхнюю фазу и экстрагировать ее в 55,8 мл смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1). 19. Отобрать верхнюю фазу и осадить ДНК, добавив один объем изопропанола. 20. Выдержать 60 мин или более при температуре 0 С. 21. Центрифугировать при 8000 об/мин в течение 20 мин. 22. Удалить изопропанол и ресуспендировать в 1,2 мл раствора 10 мМ трис 1 мМ ЭДТА, рН 7,5. 23. Провести гель-электрофорез в 1,5%-ном агарозном геле при напряженности электрического поля 5 В/см. 1. Нарастить «ночную» культуру в требуемом объеме питательной среды с подходящим антибиотиком. 2.
Клетки собрать центрифугированием при 6000 об/мин. 3. Промыть 0,05 М ЭДТА, рН 7,8. 4. Ресуспендировать в минимальном объеме буфера А и по каплям добавить в ступку с жидким азотом. 5. Образовавшуюся замороженную биомассу тщательно растереть пестиком. 6. В начале оттаивания биомассы добавить фермент протеинкиназу до конечной концентрации 200 мкг/мл. 7. После полного оттаивания до комнатной температуры добавить SDS до конечной концентрации 0,5%. 8. Инкубировать 3 ч при 37 С, затем 30 мин при 60 С. 9. Охладить до комнатной температуры и экстрагировать равным объемом смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25 : 24 : 1). Ю.Получить супернатант центрифугированием при 6000 об/мин. 11.Повторить пункты 9 и 10 еще один раз. 12.Экстрагировать равным объемом хлороформ : изоамиловый спирт (24:1). 13.Получить супернатант при 6000 об/мин. 14.Экстрагировать равным объемом хлороформа. 15.Получить супернатант центрифугированием при 6000 об/мин. 16.Осадить ДНК двумя объемами холодного 95%-ного этанола и намотать на палочку. 17.Ополоснуть в 70%-ном этаноле. 18.Подсушить до исчезновения запаха спирта при комнатной температуре. 19. Оставить растворяться на ночь в необходимом объеме дистиллированной воды при 4 С. 2.2.4. Очистка плазмидной и хромосомной ДНК в градиенте хлористого цезия [6] 1. Отмерить необходимый объем раствора ДНК. 2. На каждый мл раствора добавить 1 г твердого CsCl. 3. Нагреть раствор до 30 С, аккуратно перемешать для растворения соли. 4. Добавить 0,8 мл бромистого этидия с концентрацией 10 мг/мл на каждые 10 мл раствора. Сразу же перемешать раствор. 5. Центрифугировать раствор при 8000 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре. 6. Используя пастеровскую пипетку или иглу, перенести чистый красный раствор под пеной в новую пробирку. 7. Центрифугировать раствор при 45000 об/мин в течение 48 ч при комнатной температуре. 8. На фоне ультрафиолета отобрать полосу ДНК с помощью шприца и иглы диаметром 2,1 мм в чистую пробирку. 9. К раствору ДНК добавить равный объем изоамилового спирта, перемешать. 10. Центрифугировать раствор при 1500 об/мин в течение 3 мин при комнатной температуре. 11. Удалить верхний розовый слой. 12. Повторить пункты 9-12 до тех пор, пока не исчезнет розовая окраска.
Дистилляционный метод определения окислительных изменений с 2-тиобарбитуровой кислотой
Навеску продукта массой 10 г растереть в ступке с 50 мл дистиллированной воды. 2. Полученную смесь с помощью дистиллированной воды объемом 47,5 мл количественно перенести в колбу Къельдаля 3. Добавить 2,5 мл 3 М раствора соляной кислоты и произвести дистилляционную отгонку в течение 10-15 мин,1 в ходе которой собирают 50 мл дистиллята 4. Для проведения цветной реакции 5 мл дистиллята поместить в пробирку с притертой пробкой, прилить 5 мл 0,02М раствора 2-тиобарбитуровой кислоты в 90%-ной ледяной уксусной кислоте, перемешать 5. После перемешивания пробирку с содержимым поместить в кипящую водяную баню на 35 мин. Раствор охладить в проточной воде в течение 10 мин. 6. Определить оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 532-535 нм. Результаты анализа выражают в величинах оптической плотности с учетом данных контрольного опыта, в котором вместо 5 мл дистиллята используют 5 мл воды. 1. Взвесить навеску продукта массой 3-5 г (с точностью до 0,01 г) в конической колбе вместимостью 250 мл с 2. Растопить на водяной бане и прилить 50 мл нейтрализованной смеси этилового спирта и этилового эфира. 3. Взболтать содержимое колбы. К раствору добавить 2-3 капли индикатора (1%-ный раствор фенолфталеина) и быстро титровать 0,1 М раствором КОН или NaOH до появления розоватого окрашивания. 4.
Определить кислотное число по формуле: X - кислотное число, мг КОН; 5,61 - количество КОН, содержащееся в 1 мл 0,1 М раствора, мг; V - объем 0,1 М раствора КОН, израсходованного на титрование, мл; К - коэффициент пересчета на точно 0,1 М раствора КОН; то — масса навески, г. 2.2.22. Определение содержания нитрозопигментов мясных продуктах [47] 1. Измельчить в мясорубке 25 г продукта 2. В пробирку вместимостью 50 мл поместить 5 г измельченного образца, взвешенного с точностью до 0,001 г (0,001 мл) добавить 10 мл раствора А 3. Провести гомогенизацию образца с помощью блендера до пастообразного состояния 4. Добавить 12 мл раствора А и гомогенизировать до однородного состояния 5. Выдержать образец в темном месте в течение 1 часа 6. Тщательно перемешать 7. Профильтровать содержимое пробирки через складчатый фильтр 8. Провести повторную фильтрацию через мембрану с диаметром пор = 0,45 мкм 9. Измерить поглощение волны при 640 нм против раствора А 10. Повторить пункты 2-8 при используя вместо раствора А раствор В 11. Измерить поглощение волны при 540 нм против раствора В 12. Рассчитать содержание нитрозопигментов по формуле: нитрозопигментов, %; ОП540 - оптическая плотность раствора нитрозопигментов; ОПб4о - оптическая плотность раствора, содержащего все пигменты, присутствующие в продукте. Раствор А: 80% ацетона+13% воды + 7% НС1К0Нц Раствор В: 80% ацетона+20% воды
Проводится по 5-ти бальной шкале комиссией, состоящей из 5 или более человек. 2. Помещение для работы дегустаторов должно быть защищено от шума, вибрации; хорошо вентилируемо, но без сквозняков; хорошо освещено (не менее 500 лк). Температура воздуха должна быть 20±2 С, относительная влажность 70±5 % 3. Рабочие места должны располагаться так, чтобы дегустаторы не оказывали влияния друг на друга 4. На столе дегустатора должны быть: дегустационные листы, карандаш или ручка; тарелки, стаканы или чашки; нож и вилка из нержавеющей стали; салфетка; посуда для отходов; нейтрализующие средства для восстановления вкусовой чувствительности; 5. Показатели качества определяют сначала на целом, а потом разрезанном продукте; 6. Показатели качества целого продукта определяют в следующей последовательности: внешний вид, цвет, состояние поверхности; запах - на поверхности продукта. 7. Показатели качества целого продукта определяют в следующей последовательности: мясные изделия освобождают от упаковки, нарезают ломтиками; цвет, вид и рисунок - визуально на сделанном поперечном и продольном разрезах; запах, аромат, вкус и сочность - опробованием; консистенцию - надавливанием, разрезанием. Устанавливают плотность, рыхлость, нежность, жесткость, крошливость, упругость. Подготовить пробу: объединенную пробу массой 50 г составляют из точечных проб следующим образом: колбасные изделия в оболочке тщательно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и дважды обжигают над пламенем. Затем батоны разрезают продольно стерильным (фламбированным) ножом или скальпелем на две половинки, не рассекая оболочку противоположной стороны батона. Пробу отбирают из нескольких участков центральной части и из-под оболочки обеих половинок батона; 2. Из объединенной пробы каждого образца берут в стерильную посуду (пергамент) навеску массой 20 г с погрешностью, не превышающей 0,1 г. Навеску помещают в стерильную колбу (стакан) гомогенизатора для приготовления испытуемой взвеси. Для этого в колбу добавляют раствор 1 г/дм пептонной воды или стерильного физиологического раствора в четырехкратном количестве и гомогенизируют в электрическом смесителе; вначале измельчают материал на кусочки замедленной скоростью вращения ножей, затем при 15000—20000 об/мин в течение 2,5 мин. Для посевов на питательные среды стерильной градуированной пипеткой отбирают взвесь после 15 мин выдержки при комнатной температуре. 1 см приготовленной испытуемой взвеси содержит 0,2 г продукта; 3. Определить общее количество микроорганизмов в 1 г продукта. Для этого питательный L-arap с добавлением глюкозы (2%) расплавляют на водяной бане и охлаждают до температуры 45 С.
Стерильные чашки Петри раскладывают на столе, подписывают наименование анализируемого продукта, дату посева и количество посеянного продукта. Из каждой пробы должно быть сделано не менее двух посевов, различных по объему, взятых с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. Суспензии клеток помещают в чашки Петри и заливают средой. Тщательно перемешивают и после застывания перевертывают и помещают в термостат с температурой 30 С на 72 ч. Через 72 ч подсчитывают общее количество колоний бактерий, выросших на чашках. 4. Определить бактерии группы кишечной палочки в 1 г продукта. Сущность метода заключается на способности бактерий группы кишечной палочки расщеплять глюкозу и лактозу. При этом в среде «ХБ» образуются кислые продукты, меняющие цвет индикатора, а в среде Кесслер в поплавке образуется газ вследствие расщепления лактозы. Проведение анализа: В пробирки, содержащие по 5 см среды «ХБ», вносят по 5 см испытуемой взвеси стерильной пипеткой вместимостью 5—10 см с широким концом.
Определение массовой доли жира
Высушенную навеску продукта (2 г) количественно перенести в бумажную гильзу, на дно которой положен кусочек обезжиренной ваты; 2. Гильзу тщательно закрыть, загибая края, и поместить в экстрактор; 3. В приемную колбу, высушенную до постоянной массы, налить растворителя на 0,67 объема колбы так, чтобы он мог заполнить экстрактор выше верхнего колена сифонной трубки; 4. Приемную колбу присоединить к экстрактору и поместить на нагреватель, экстрактор соединить с холодильником и провести экстракцию в течение 6 часов при кратности слива растворителя 5 в течение 1 часа; 5. Проверить полноту обезжиривания нанесением на фильтровальную бумагу капли растворителя, стекающего из экстрактора. Процесс считают законченным при отсутствии жирного пятна после испарения растворителя; 6. Отогнать растворитель из приемной колбы на водяной бане через холодильник, а оставшийся в приемной колбе жир высушить до постоянной массы при 100-105 С; 7. Рассчитать содержание жира по формуле X = (ПІ! - m2)100/m0, где X - содержание жира, %; mi - масса колбы с жиром, г; т2 - масса колбы, г; то - масса навески, г. 1. Поместить навеску (2 г) в предварительно прокаленный тигель 2.
Добавить 1 мл раствора ацетата магния (150 г безводной соли на литр) 3. Высушить в сушильном шкафу при 180 С в течение 30 мин 4. Обуглить на электрической плитке и поместить в муфельную печь для прокаливания при 500 - 600 С на 30 мин и 5. Повторно прокалить содержимое тигля в течение 20 мин 6. В таких же условиях провести минерализацию 1 мл ацетата магния 7. Содержание золы определить по формуле X = (т2 - mi)100/m0, где 8. X - содержание жира, %; тг - масса золы, г; тг — масса ацетата магния, после минерализации г; т0 - масса навески, г. 1. Взвесить 10 г измельченной пробы с точностью до 0,01 г и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 200 мл 2. Добавить 100 мл горячей дистиллированной воды и выдержать на кипящей водяной бане в течение 15 мин, далее охладить до комнатной температуры и добавить 10 мл реактива Карреза I и 10 мл реактива Карреза II, встряхивая колбу после каждого добавления реактива 3. Добавить дистиллированную воду до метки "200 мл" 4. Перемешать содержимое и профильтровать через складчатый фильтр 5. Перенести 20 мл фильтрата в коническую колбу вместимостью 200 мл 6. Добавить 5 мл 4 М раствора азотной кислоты, 2 мл раствора железоаммонийных квасцов, 20 мл 0,1 М раствора нитрата серебра и 3 мл нитробензола. 7. Титровать содержимое колбы 0,1 М раствором роданида калия при энергичном встряхивании до появления неисчезающей красноватой окраски 8. Содержание хлорида натрия рассчитывают по формуле X = 0,00584 х (20К! - VK2)200 х 100/(m0 х 20) , где X - содержание хлорида натрия, %; 0,00584 - количество хлорида натрия, эквивалентное 1 мл 0,1 М раствора нитрата серебра; Ki - коэффициент пересчета на точно 0,1 М раствор нитрата серебра; V - объем роданида калия, израсходованного на титрование, мл; Кг - коэффициент пересчета на точно 0,1 М раствор роданида калия; 200 - разведение, мл; то - масса навески, г; 20 -объем титруемого раствора, мл. 1. Нарастить исследуемый штамм в жидкой среде L в течение 20 часов при 37 С. Определить количество клеток в 1 мл с помощью стандарта мутности 2. Провести изучение безвредности на 10 белых беспородных мышах массой 12-14 г при введении per os дозы 1011 КОЕ/0,5 мл. В качестве контроля служит группа мышей, получавшая физиологический раствор. 3.
Провести изучение вирулентности путем введения внутрибрюшинно 15 белым беспородным мышам массой 15 г 0,5 мл бактериальной суспензии с титром 10б, 107, 108 КОЕ/0,5 мл. В качестве контроля служит группа мышей, получавшая физиологический раствор. 4. Провести изучение токсичности путем введения внутрибрюшинно трем группам белых беспородных мышей (5 голов в каждой) по 0,5 мл бактериальной суспензии с титром 106, 107, 108 КОЕ/0,5 мл, прогретой при 100 С в течение 1 часа. В качестве контроля служит группа мышей, получавшая физиологический раствор. 5. Провести изучение токсиногенности введения внутрибрюшинно трем группам белых беспородных мышей (5 голов в каждой) по 0,25 мл, 0,5 мл и 1мл надосадочной жидкости культивированного штамма. В качестве контроля служит группа мышей, получавшая стерильную среду. 6. Провести изучение хронической токсичности на 50 белых беспородных мышах массой 12-14 г ежедневным введением per os 0,5 мл живой культуры штамма при КОЕ = 3 103 в течение 30 сут. В качестве контроля служит группа мышей (10 голов), получавшая физиологический раствор. Для выбора наиболее эффективного штамма по утилизации нитрита натрия был проведен скрининг штаммов S. camosus В-8953, В-8950, В-8951 и В-8947 и S. xylosus В-8945 и В-8944 из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Оценку эффективности утилизации нитрита натрия проводили, измеряя значения концентрации ионов нитрита в культуральнои среде каждые два часа в течение 16 часов. Штаммы растили в анаэробных условиях в L-среде (пептон -10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 5 г/л). В результате исследования было определено, что все штаммы S. camosus имеют приблизительно одинаковые, и большие чем у штаммов S. xylosus, значения скорости утилизации нитрита натрия (рис. 5). Исходя из полученных данных, в дальнейшей работе, для получения продуцента нитритредуктазы использовали штамм S. camosus В-8953, который, в сравнении с другими штаммами S. camosus, незначительно, но эффективнее утилизирует нитрит натрия.
После выбора штамма с наибольшей нитритредуктазной активностью, первоначально была проверена целесообразность замещения промотора нитритредуктазного оперона как способа увеличения соответствующей активности штамма. В связи с противоречивыми данными о роли белкового продукта гена nirR. было решено проводить замену промоторной части генов nirR. и sir А. Для усиления транскрипции оперона был выбран изученный промотор гена xylA из Staphylococcus xylosus с геном белка-регулятора xylR или без него [99]. Наличие гена, кодирующего белок-регулятор позволяет контролировать уровень экспрессии целевого фермента, и таким образом, дает возможность избежать больших количеств белка, которые могут быть токсичными для клетки. Быстрый отбор трансформантов осуществлялся за счет использования в качестве селективного маркера - гена устойчивости к эритромицину егт из транспозона917. Замена промотора осуществлена с помощью термочувствительной плазмиды pBTmcs, используя двойной кроссинговер при длине флангов для интеграции 750-960 пн. Отсутствие чужеродных генетических элементов является обязательным условием при использовании штамма в пищевой промышленности, поэтому в дальнейшем селективный маркер - ген егт был замещен геном thy А, а промотор гена xylA более сильным промотором гена gap, которые были получены из штамма Staphylococcus carnosus В-8953. Введение конечной конструкции осуществлено в штамм S. carnosus (thyА"). Общая схема получения штамма-продуцента фермента нитритредуктазы представлена на рисунке 6.
