Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор научно-технической и патентной литературы 5
1.1. Пищевые колоранты для мясоперерабатывающей промышленности 5
1.1.1. Систематизация пищевых колорантов, используемых в пищевой промышленности 5
1.1.2. Пищевые колоранты красной гаммы растительного происхождения 7
1.1.3. Пищевые колоранты из сырья животного происхождения 12
1.1.4. Пищевые красители - продукты жизнедеятельности биосистем 13
1.1.5. Синтетические пищевые колоранты 15
1.2. Использование препаратов на основе гемоглобина в качестве пищевого красителя . 17
1.2.1. Структура и физико-химические свойства гемоглобина 17
1.2.2. Пищевые красители на основе гемоглобина 20
1.3. Токсикологическая оценка безопасности пищевых добавок 22
2. Объекты, методы и организация эксперимента 34
2.1. Объекты исследования 34
2.2. Методы исследований 35
2.3. Организация эксперимента. 38
3. Экспериментальная часть . 42
3.1. Изучение состава и свойств препарата гемоглобина 42
3.2. Разработка состава колорантов для мясопродуктов с различным уровнем содержания мышечной ткани 43
3.2.1. Краситель Гемо-кол 43
3.2.2. Краситель Гемо-фор 50
3.3. Изучение физико-химических свойств пищевых красителей «Гемокол» и «Гемо-фор». 58
3.4. Изучение токсикологической безопасности пищевых колорантов, используемых в технологии мясопродуктов 64
3.5. Промышленная апробация колорантов 79
3.6. Модификация соевых белковых препаратов путем трансгемирования. 86
Список использованной литературы 96
Приложение
- Использование препаратов на основе гемоглобина в качестве пищевого красителя
- Токсикологическая оценка безопасности пищевых добавок
- Методы исследований
- Разработка состава колорантов для мясопродуктов с различным уровнем содержания мышечной ткани
Введение к работе
Актуальность работы: Массовое использование при производстве мясопродуктов сырья длительного низкотемпературного хранения, с высоким содержанием жировой и соединительной ткани, имеющего признаки PSE, RSE и DFD, а также пищевых гидроколлоидов приводит к «разбавлению» цвета готовой продукции, в связи с чем, мясоперерабатывающие предприятия России вынуждены применять разнообразные колоранты красно-розовой гаммы.
При этом следует отметить, что большая часть препаратов на основе натуральных пигментов не стабильна по составу и свойствам, в связи, с чем их спектральные характеристики претерпевают существенные изменения в процессе технологической обработки сырья и при последующем хранении готовой продукции; применение синтетических красителей ограничивается отсутствием абсолютной гарантии их безопасности для здоровья человека.
В этих условиях актуальным является поиск возможностей использования в этом качестве гемоглобина - основного пигмента крови, которая на протяжении многих десятилетий применяется в различных отраслях пищевой промышленности. Однако многократные попытки получить на ее базе краситель не привели к его распространению на продовольственном рынке, что было обусловлено либо сложностью производства и, как следствие, высокой стоимостью продукции, либо не достаточной устойчивостью к окислению. Анализ научно-технической литературы позволяет сделать вывод о том, что эффективное проявление окрашивающих свойств гемоглобина во многом зависит от валентности железа гем-группы.
Разработка состава комплексного красителя на основе препарата гемоглобина и его применение позволит не только придать готовому продукту необходимую окраску, но обогатить его натуральным белком животного происхождения и органическим железом, усвояемость которого достигает 25-90%, в то время как для неорганического железа ее значение не превышает 1-6% Помимо
этого, способность восстановленн
р.
то гомнна вторично соединяться с белками,
щ сил і
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ J БИБЛИОТЕКА і 3 СПетерб 09 К»'
например, с денатурированным глобином или желатиной (явление трансгемирования) дает основание предполагать, что данное свойство можно использовать для получения комплексной пищевой добавки гем - соевый белковый препарат, содержащей как полноценный белок, так и органическое желез. Исходя из вышеизложенного, представлялось целесообразным использовать описанные выше особенности пигмента крови при определении путей применения отечественного препарата гемоглобина, созданного по оригинальной технологии НПО «Росбиотех-Моби».
Цели и задачи исследования. Целью диссертации являлась разработка цветообразующих композиций на основе гемоглобина крови убойных животных.
Для реализации поставленной цели решали следующие задачи:
-
изучить состав и свойства отечественного препарата гемоглобина;
-
разработать состав комплексных красителей на основе препарата гемоглобина для мясопродуктов с различным уровнем содержания мышечной ткани и определить их физико-химические свойства;
-
оценить токсикологическую безопасность новых красящих композиций;
-
установить целесообразность применения для оценки уровня токсикологической безопасности пищевых красителей экспресс - методов биотестирования с использованием инфузорий в качестве тест - объектов;
-
изучить возможности создания комплекса гем - соевый белковый препарат с использованием реакции трансгемирования и определить физико-химические характеристики полученных соединений;
-
провести апробацию новых пищевых колорантов в производственных условиях;
-
разработать проект нормативной документации по применению новых пищевых красителей на основе гемоглобина в мясоперерабатывающей промышленности.
Научная новизна работы состоит в том, что:
разработан состав двух новых пищевых красителей на основе отечественного препарата гемоглобина, которые позволяют придать готовому продукту розово-красную окраску и обеспечивают стабильность спектральных характеристик в процессе хранения;;
впервые обоснована и доказана принципиальная возможность применения экспресс - методов биотестирования для оценки уровня токсикологической безопасности пищевых красителей;
получены экспериментальные данные, характеризующие токсикологическую безопасность 16 видов пищевых колорантов розово-красной гаммы, и проведено их ранжирование по уровню токсичности;
установлена возможность создания устойчивого окрашенного комплекса гем - соевый белковый препарат с использованием реакции трансгемирования. Практическая ценность работы. Оптимизированы параметры и условия применения двух новых пищевых красителей на базе отечественного препарата гемоглобина крови убойных животных при производстве эмульгированных мясопродуктов, различающихся по содержанию сырья, включающего основной пигмент мяса - миоглобин. Подготовлен проект ТИ по применению новых пищевых красителей на основе гемоглобина - Гемо-кол и Гемо-фор - в мясоперерабатывающей промышленности.
Апробация работы. Результаты выполненного исследования были представлены на следующих конференциях: международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2003г., Москва); международная научная конференция «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2004г., Москва).
Публикации. По материалам работы опубликовано 10 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов и объектов исследования, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, списка источников литературы и приложений.
Работа изложена на //^страницах машинописного текста, содержит S' таблиц, рисунков, библиография включает/^наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Приложения к диссертации представлены на страницах.
Использование препаратов на основе гемоглобина в качестве пищевого красителя
Гемоглобин, придающий красную окраску крови, является основной составной частью эритроцитов [73], в которых большая его часть (30-34%) [39] находится в виде подвижного, легко разрушаемого соединения со стромой.
Гемоглобин (также как и миоглобин) относится к хромопротеидам и является порфирином, производным тетрапиррольного соединения - порфина. Протопорфирин IX, который входит в их состав, содержит четыре метальные группы, две винильные группы и два остатка пропионовой кислоты. Хелатный комплекс протопорфирина с Fe (И) называется протогемом или просто гемом; аналогичный комплекс с Fe (III) - гемином или гематином [77]. Гем содержится в гемоглобине, оксигемоглобине, нитрозогемоглобине; гематин - в метгемоглобине и других окисленных пигментах [73].
Молекула гемоглобина в целом образуется из четырех субъединиц (2 а-цепи и 2 р-цепи), каждая из которых представляет собой единичную полипептидную цепь с присоединенным гемом и определяет четвертичную структуру молекулы гемоглобина. [71] Отличие ос-цепей от р-цепей состоит в разной последовательности N-терминальных (концевых) аминокислот: сс-цепь -валин - лейцин; р-цепь - валин - гистидин.
В состав а-цепи входит 141 аминокислотный остаток: лизц, гисш, арг3, аспі2, тре9, серп, глу5, про7, гли7, ала2і, цись валіз, мет2, лейі8, тирз, фен7,триь
В состав Р-цепи входит 146 аминокислотных остатков: лизц, гис9, арг3, аспв, тре7, сер5, глуп, про7, глип, алаі5, цис2, валі8, меть лей is, тирз, фен8, три2. [71]
Особое значение приписывают гистидину, как аминокислоте, усиливающей буферные свойства гемоглобина, который является важнейшим буферным веществом цельной крови, т.к., благодаря кислотным свойствам, может связывать основания и образовывать соли, например, Na-гемоглобин, а также определяющей возможность связывания гема. [71]
В геме четыре лигандные группы порфирина образуют комплекс с железом, имеющий плоское строение, а оставшиеся пятая и шестая координационные связи железа расположены перпендикулярно плоскости порфиринового кольца. В гемосодержащих белках (миоглобине и гемоглобине) пятое положение занято имидазольной группой гистидинового остатка, а шестое положение либо остается незамещенными (дезоксигемоглобин и дезоксимиоглобин), либо замещается кислородом (оксигемоглобин и оксимиоглобин) или другими лигандами (окисью углерода, цианидом и т.д.) [77].
Нужно отметить, что железо, входящее в состав порфирина, не только качественно меняет его, но и само приобретает новые свойства (Михлин, 1960). По сравнению с железом, входящим в состав неорганических соединений оно в 1000 раз активнее, становясь катализатором окислительных процессов, или непосредственно участвуя в них. Известно также, что усвояемость гемового железа достигает 25-90% [170], в то время как для неорганического она равна 1-6% [101]. Установлено, что активность железопорфиринового комплекса еще более возрастает в случае присоединения к нему азотистого соединения (Браунштейн, 1940). [71]
В каждой субъединице гемоглобина в образовании контактов с гемом (число которых доходит до 75) участвуют около 30 атомов из 16 аминокислотных остатков. Почти все они неполярные [132]. Эта локализация гема в своеобразной щели («гемовом или гидрофобном кармане») является примечательной: неиолярные винильные группы гема погружены во внутреннею гидрофобную часть кармана, а гидрофильные пропионатные боковые цепи выступают из кармана в направлении поверхности. Большое число алифатических и ароматических R-групп выстилают карман и осуществляют гидрофобные контакты с пиррольными кольцами гема. Связь гема с глобином осуществляется также координационной связью между атомом железа и атомом азота Hisp92 (F8) или Hisa87 (F8) - так называемых проксимальных гистидиновых остатков [138]. Обратимое связывание кислорода с образованием стабильного комплекса оказывается возможным, поскольку в «гидрофобном гемовом кармане» вытесняется вода и для гема создается среда с низкой диэлектрической постоянной, а в растворах с высокой диэлектрической проницаемостью реакция кислорода с феррогемом идет с окислением железа и приводит к образованию ферригема и супероксидного иона (02"). [138]
Переход двухвалентного железа при окислении гема в трехвалентную форму (гематин) приводит не только к изменению окраски растворов гемоглобина от красного до коричневого, что не желательно при получении колорантов на его основе [71], но и к снижению его пищевой ценности, т.к. в желудочно-кишечном тракте всасывается только двухвалентное железо [136].
Токсикологическая оценка безопасности пищевых добавок
Пищевые добавки в настоящее время являются наиболее распространенными контаминантами, воздействию которых подвергается население всех стран. При поступлении в организм, особенно в комбинации с другими подобными соединениями даже в относительно небольшом количестве, они могут оказывать неблагоприятное воздействие на здоровье человека, которое проявляется в виде острого или хронического отравления, а также мутагенного или канцерогенного эффекта.
Вопросы решения проблем, связанных с острыми отравлениями, относительно просты как в научном, так и в практическом плане, так как эти случаи привлекают внимание из-за выраженной клинической картины, в результате чего, как правило, быстро устанавливается причина отравления и принимаются оперативные меры по его ликвидации. Хронические же отравления наносят несравненно более серьезный ущерб здоровью, так как их симптомы нередко неопределенны, развиваются медленно. К факторам, способствующим развитию хронического отравления относится также способность ряда веществ к кумуляции, или суммированию их воздействия. В ряде случаев малые дозы при их более частой повторяемости могут оказаться значительно более опасными для организма, чем большие, но при относительно редком их поступлении. Такое явление наблюдалось на примере пищевого красителя нафтола желтого S, который до 1961 года широко применяли во многих странах мира и который, как оказалось, является потенциально опасным в канцерогенном отношении веществом [27].
Таким образом, проблема безопасности пищевых добавок сложна и многообразна, и для органов здравоохранения многих стран остается чрезвычайно актуальной.
В настоящее время в мире вопросами применения пищевых добавок занимается специализированная международная организация - Объединенный комитет экспертов ФЛО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам - JECF. Комитет выполняет важную функцию в создании действенного международного механизма для идентификации и оценки безопасности воздействия химических веществ в продуктах питания, включая пищевые добавки, контаминанты, остаточные количества лекарственных средств, применяемых в ветеринарии, и т.п.
В рамках Европейского Сообщества действует аналогичная комиссия; в России и других странах СНГ решение вопроса о применении пищевой добавки является прерогативой Министерств здравоохранения и Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора.
В результате работы Комитета помимо нафтола желтого S к потенциально опасным в канцерогенном отношении были также отнесены красители - судан III и амарант (Е 123), которые в настоящее время исключены из списка разрешенных пищевых добавок [27].
Условно весь ход исследований по нормированию пищевых добавок в пищевом продукте и рационе можно разделить на 4 этапа: - оценка стойкости пищевой добавки и ее способности к трансформации, может сопровождаться острым токсикологическим экспериментом с определением коэффициента кумуляции; - изучение токсикодинамики препарата, выявление органов-мишеней и определение максимально недействующей дозы и порога вредного действия пищевой добавки; - обобщение полученных данных и определение на их основе допустимого суточного потребления (ДСП) и предельно допустимой концентрации (ПДК) в пищевых продуктах изучаемого соединения; - наблюдение за пищевой добавкой, чтобы подтвердить безопасность использования и, если требуется, внести поправку в гигиенические нормативы [27].
Данные, полученные в ходе исследований, издаются в виде докладов, монографий и выпусков химических спецификаций Объединенного комитета экспертов ФЛО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам, которые дают возможность национальным органам по регламентированию продуктов питания и Комиссии по Codex Alimentarius принимать наиболее обоснованные решения по рациональному использованию химических веществ в продуктах питания.
Среди всего спектра применяемых колорантов с гигиенической точки зрения, в первую очередь, заслуживают особого внимания синтетические красители, многие из которых оказались не безразличны для организма, как в токсикологическом, так и в канцерогенном отношении.
Данные колоранты не отличаются острой токсичностью, но многие из них являются канцерогенами, мутагенами или аллергенами. Так, например, синтетические красители кармуазин (Е 122) и тартразин (Е 102) могут вызывать сильные аллергические реакции у людей чувствительных к аспирину [5, 173]. Помимо этого, последний из них вызывает падение в крови у человека иммуноглобулинов, головокружение, общую слабость и может провоцировать бронхиальную астму, крапивницу, различные сыпи и отеки Квинке [5, 177], Понсо 4R (Е 124) при высоких концентрациях способствует образованию злокачественных опухолей у животных [163].
Отмечается, что канцерогенов больше среди жирорастворимых красителей синтетической природы. По мнению ученых, азосоединения имеют в своем составе сульфо, гидрокси- или карбоксильную группы, что свидетельствует об их водорастворимости, следовательно, они могут быть допущены к использованию в качестве колорантов в пищевых продуктов. Красители щелочного характера и жирорастворимые не должны использоваться в качестве пищевых добавок [27]
Методы исследований
1. Определение «общего гемоглобина» - по спектрофотометрическому гемиглобинцианидному методу Д. Драбкина [68], рекомендованому Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ). Метод основан на том, что все формы гемоглобина преобразуются в одну - гемиглобинцианид (цианметгемоглобин или цианферригемоглобин), для которого установлен миллимолярный коэффициент экстинкции, равный 11,0 при длине волны 540 нм. В ходе исследований использовались реагенты для гемоглобинометрии НПО «Ренам». 2. определение растворимости - путем высушивания осадка, полученного после центрифугирования 1 %-ых растворов препарата, и расчета массовой доли веществ, перешедших в раствор, по формуле [55]: X = (т0 - (ті - т2)) 100%, где то - масса образца препарата, мг; mi - масса препарата, отделившегося при центрифугировании, до высушивания, мг; ніг - масса осадка после высушивания, мг. 3. определение рН - потенциометрическим методом на 1 %-ных растворах препарата при 20 ± 2 С. [55] 4. буферную емкость - путем титрования 1 %-ого раствора исследуемого препарата 1 Н растворами гидроксида натрия и аскорбиновой кислоты и рассчитывали по формуле[2, 55]: Р = AV / АрН, где AV - количество щелочи (кислоты) в г - экв/л, вызывающее изменение рН исследуемого раствора на величину АрН. 5. оценка цветовых характеристик - методом определения координат цвета в цветовом пространстве, рекомендованным Международной комиссией освещения с использованием программно-технического комплекса на базе спектроколориметра "Спектротон", путем регистрации таких параметров, как светлота, тон, насыщенность, описываемыми координатами: L - светлота, arctg b/a — тон, S= va2 + b2 — насыщенность [4], на базе ВНИМПа и «Аромарос-М». 6. органолептическую оценку проводили в соответствии с ГОСТ 9959-91. 7. оценку уровня токсикологической безопасности красителей осуществляли с помощью двух экспресс - методов биотестирования: 7.1.метод ускоренной биологической оценки кормов, продуктов животноводства и других объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля, разработанный в ВНИИВСГЭ [87, 89, 90], основанный на внесении в среду обитания инфузорий Tetrahymena pyriformis исследуемого вещества и регистрации максимальной концентрации, при которой исследуемое вещество не оказывает влияния на жизнедеятельность инфузорий - 1Со; концентрации, провоцирующую гибель 50% тест-объектов - IC50 и концентрации, вызывающей смерть всех инфузорий - ICioo- 7.2.метод биологической оценки с помощью прибора «БиоЛат»[112], разработанный на кафедре «Биохимия» МГУПБ, основанный на внесении в среду обитания инфузорий Paramecium caudatum и Stylonychia mytilus исследуемого вещества и регистрации ICo, IC50 и 1С j оо- 8. вылеленния гемина из гемоглобина эритроцитарной массы бычьей крови -ацетоновым методом [160], модифицированным по Т. Asakura и М. Yonagama [156] и М.М. Рудашевской [115]. В стеклянную колбу с мешалкой заливалось 1 л ацетона и 10 мл концентрированной соляной кислоты (уд. вес 1,19) затем тонкой струей при энергичном перемешивании подавалось 250 мл эритроцитарной массы. При этом глобин выпадал в виде мелкодисперсного осадка. Смесь фильтровалась на матерчатом фильтре, осадок дважды промывался холодным ацетоном на фильтре. К фильтрату добавлялось 250 мл ледяной уксусной кислоты, затем 4,8 г NaOH, растворенных в 250 мл дистиллированной воды. Кристаллы гемина, выпавшие после охлаждения раствора, центрифугировались, промывались 15-ным раствором уксусной кислоты и высушивались под вакуумом. 9. трансгемирование проводилось в следующей последовательности: к раствору белков добавлялись гемин (0,003 %) и восстановители, после чего рН раствора поднимался до 7,8 путем добавления раствора NaOH. Реакционная смесь инкубировалась при температуре 45С в течение 12 часов. Далее рН раствора снижался до 6 - 7 с использованием аскорбиновой и лимонной кислот. После этого раствор вновь помещался в термостат и инкубировался при 38С в течение 8 - 10 часов. По окончании инкубирования раствор центрифугировался на лабораторной центрифуге ОПН-8 (8000 обУмин., 20 мин.) для удаления нерастворившегося гемина. Затем растворы сублимационно высушивались на лабораторной лиофильной сушилке «Иней-3» [18].
Разработка состава колорантов для мясопродуктов с различным уровнем содержания мышечной ткани
Основываясь на результатах изучения состава и основных физико-химических характеристик препарата гемоглобина (НПО «Росбиотех»), которые показали принципиальную возможность его использования в качестве базы для создания группы многокомпонентных пищевых колорантов, было проведено моделирование, целью которого являлось определение условий среды, оптимальных для проявления его окрашивающего эффекта в спектре, отвечающем представлениям потребителя об окраске эмульгированных мясопродуктов.
Принимая во внимание, что в состав молекулы миоглобина и гемоглобина в качестве простетической группы входит протопорфирин IV процесс образования ярко - красных нитрозопроизводных у них протекает одинаково. Миоглобин переходит в соединение красного цвета при взаимодействии с окислами азота, а скорость этой реакции и массовая доля образующегося пигмента зависят от количества миоглобина, содержания мет-формы и окислительно-восстановительного потенциала системы. В связи с этим, были проведены аналитико-экспериментальные выбор и обоснование концентраций нитрита натрия и редуцирующих веществ в составе многокомпонентного колоранта.
Известно, что образующаяся в результате гидролизе нитрита натрия азотистая кислота при одновременном отсутствии в среде и восстановителей, и окислителей распадается на оксид и диоксид азота, благодаря чему наряду с нитрозопигментами появляются и метпигменты [130]. В качестве восстановителей использовали пищевые добавки, традиционно применяемые для стабилизации цвета мясного сырья: пищевые кислоты и их соли (аскорбиновая кислота, аскорбинат натрия, эриторбат натрия, лихмонная кислота) и сахара (декстроза, мальтоза, глюкоза, фруктоза, ксилоза, манит), которые способны ускорять процесс цветообразования за счет участия в процессе разложения азотистой кислоты. В качестве максимальных концентраций этих компонентов были взяты нормы их закладки при использовании нитритного посола (нитрит натрия - 5 мг%, пищевые кислоты - 5%, сахара - 1,5%) [130], которые постепенно снижались с целью определения оптимальных условий для протекания реакции образования нитрозопигментов с максимальным вовлечением гемоглобина. В ходе исследования варьировали виды и соотношения восстановителей в системе.
При оценке эффективности создаваемых композиций в качестве модельных систем использовали термообработанные гели и эмульсии на основе белковых препаратов как растительного (Unisol), так и животного происхождения (Типро 800 и Типро 600). Оценку получаемого цвета на первом этапе проводили визуально.
Результаты первичных исследований, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что наиболее приемлемый цвет наблюдается при внесении 0,3 - 0,4% препарата гемоглобина в присутствии нитрита натрия (0,001 - 0,006%). Оптимальным соотношением препарат гемоглобина : нитрит натрия является 1 : 0,01. При дальнейшем увеличении концентрации препарата до 0,6% цвет модельных систем приобретал коричнево-бурую окраску, несмотря на сохранение найденного соотношения с нитритом натрия.
Введение в систему препарат гемоглобина - нитрит натрия аскорбиновой кислоты придавало гелям розовый цвет. При этом достаточным оказалось внесение 0,1 части кислоты на 1 часть препарата гемоглобина и на 0,01 нитрита натрия.
Замена аскорбиновой кислоты на лимонную и эриторбиновую в тех же концентрациях не дала положительных результатов. Это явление может быть объяснено тем, что аскорбиновая кислота способна восстанавливать мет -пигменты, в том числе денатурированные [130].
Согласно данным научно-технической литературы роль Сахаров в ускорении, улучшении и повышении стабильности окраски мясопродуктов оценивается положительно [130]. Однако, в модельных опытах добавление моно- и дисахаридов (0,1 - 0,001%) к препарату гемоглобина и нитриту натрия привело к появлению в цвете геля неприемлемого серого оттенка.
Похожие диссертации на Разработка цветообразующих композиций на основе препарата гемоглобина
