Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Биохимические аспекты процессов, ведущих к интенсификации глюконеогенеза 12
1.2. Особенности обмена жирных кислот и гликогена у позвоночных животных 17
1.2.1. Биохимические сведения о трансформации жирных кислот в углеводы 23
1.2.2. Роль и регуляция активности глюконеогенетических ферментов при голодании 26
1.3. Роль глюконеогенеза в онтогенезе некоторых видов беспозвоночных.
1.4. Глиоксилатный цикл как промежуточный этап глюконеогенеза 33
1.4.1. Распространение глиоксилатного цикла у грибов бактерий и низших водорослей 34
1.4.2. Глиоксилатный цикл высших растений 38
1.4.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных 40
1.4.4. Индукция глиоксилатного цикла в патогенах 44
1.5. Характеристика ключевых ферментов глиоксилатного цикла... 47
1.5.1. Физико-химические свойства ИЦЛ 49
1.5.2. Кинетические и регуляториые характеристики ИЦЛ 52
1.5.3. Характеристика структуры гена и пространственной организации изоцитратлиазы и малатсинтазы 54
1.6. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла...62
1.7. Экспрессия и регуляция работы глиоксилатного цикла 68
Экспериментальная часть
2.1. Цель и задачи74
2.2. Объекты и методы исследования 74
2.2.1. Объекты исследования...74
2.2.2. Методы исследования...75
2.2.2.1. Создание условий пищевой депривации для крыс Rattus Rattus 75
2.2.2.2. Выращивание бабочки P.machaon L 75
2.2.2.3. Выращивание культур бактериальных клеток 75
2.2.2.4. Получение экстрактов различных тканей 76
2.2.2.5. Дифференциальное центрифугирование 76
2.2.2.6. Определение активности ферментов 76
2.2.2.7. Определение концентрации метаболитов углеводного обмена...78
2.2.2.8. Определение количества белка 79
2.2.2.9. Выделение и очистка ферментов 79
2.2.2.10. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония 80
2.2.2.11. Гель-фильтрация и ионообменная хроматография 80
2.2.2.12. Определение молекулярной массы нативного фермента 81
2.2.2.13. Электрофоретические исследования.. 81
2.2.2.14. Определение массы субъединиц фермента 82
2.2.2.15. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов 82
2.2.2.16. Экстракция суммарной РНК 83
2.2.2.17. Выделение ДНК 83
2.2.2.18. Проведение обратной транскрипции мРНК и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)... 84
2.2.2.19. Проведение Саузерн-дот-блоттинга 85
2.2.2.20. Определение количества РНК и ДНК 86
2.2.2.21. Анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей..86
2.2.2.22. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле... 86
2.2.2.23. Препаративный электрофорез ПЦР-продукта в агарозном геле..87
2.2.2.24. Эктракция ДНК из агарозного геля... 87
2.2.2.25. Клонирование ампликона в прокариотической системе...87
2.2.2.26. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia colu 88
2.2.2.27. Секвенированиє ДНК. 89
2.2.2.28. Статистическая обработка данных 89
2.3. Полученные результаты и их обсуждение 90
2.3.1. Динамика содержания основных субстратов и метаболитов в ходе онтогенеза у бабочки P.machaon и печени контрольных и голодающих крыс 90
2.3.1.1. Изменение концентрации некоторых метаболитов у бабочки махаона 90
2.3.1.2. Изменение концентрации некоторых метаболитов в печени контрольных и голодающих крыс 93
2.3.2. Динамика активности ферментов углеводного метаболизма в ходе онтогенеза у бабочки P.machaon и у крыс при пищевой депривации...96
2.3.2.1. Динамика активности ФЕПКК в ходе онтогенеза бабочки махаона и в печени и почках голодающих крыс 104
2.3.2.2. Сравнение активностей ИЦЛ у организмов различных таксономических груп... 107
2.3.3. Очистка ИЦЛ из куколок махаона и печени голодающих крыс 110
2.3.3.1. Очистка ИЦЛ из куколок бабочки P.machaon... 110
2.3.3.2. Очистка ИЦЛ из печени голодающих крыс 114
2.3.3.3. Очистка ФЕПКК из печени голодающих крыс 114
2.3.3.4. Изучение кинетических, физико-химических и регуляторных характеристик ИЦЛ из куколок бабочки P.machaon 118
2.3.3.5. Изучение кинетических, физико-химических и регуляторных характеристик ИЦЛ из печени голодающих крыс 128
2.3.3.6. Сравнение свойств ИЦЛ из бабочки махаона и печени крыс 138
2.3.4. Характеристика экспрессии ИЦЛ в куколках бабочки махаона и в печени голодающих крыс. ...138
2.3.4.1. Анализ нуклеотидных последовательностей и разработка праймеров для идентификации гена изоцитратлиазы и малатсинтазы...144
2.3.4.2. Оптимизация условий и проведение ПЦР для обнаружения генов МС и ИЦЛ в геномах различных таксономических групп 146
2.3.4.3. Подбор условий и оптимизация метода Саузерн-блоттинг для характеристики экспрессии ИЦЛ в куколках бабочки P.machaon 153
2.3.4.4. Клонирование и сиквеис участка гена ИЦЛ из бабочки P.machaon 155
Заключение 158
Выводы. 164
Литература 166
- Биохимические аспекты процессов, ведущих к интенсификации глюконеогенеза
- Характеристика структуры гена и пространственной организации изоцитратлиазы и малатсинтазы
- Изменение концентрации некоторых метаболитов у бабочки махаона
- Изучение кинетических, физико-химических и регуляторных характеристик ИЦЛ из печени голодающих крыс
Биохимические аспекты процессов, ведущих к интенсификации глюконеогенеза
Жировые запасы мобилизируются животными всякий раз, когда окислительные процессы в клетках тканей начинают испытывать недостаток в питательных субстратах. Такая ситуация наблюдается не только при голодании и диабете, но и при любом повышении скоростей обмена веществ, как, например, при движении и мышечной работе, эмоциональных стрессах (Bogdonoff et al., 1975), действии холода (Козырева, 1997; Майланов, 1997) и др. В таких условиях способность организма животных к мобилизации жиров имеет жизненно важное значение. Известно, что мыши с гипергликемией и наследственным ожирением из-за дефекта в метаболизме жировой ткани не могут использовать свои огромные жировые запасы и быстро погибают при понижении температуры окружающей среды (Шустов и др., 1998). Зимоспящие животные путём резкого снижения скоростей обмена веществ продлевают утилизацию жировых запасов на весь период зимы. По мнению Н.И. Калабухова, способность впадать в зимнюю спячку является относительно новой и, безусловно, прогрессивной ступенью в развитии животного мира. (Калабухов ,1975)
Голодание - распространённое явление в жизненном цикле многих организмов, стоящих на различных ступенях филогенетической лестницы (например, нерестовые миграции рыб, зимовка и имагинальная афагия беспозвоночных, спячка позвоночных животных, перелёты птиц, переживание неблмгоприятных условий у микроорганизмов и др.). В процессе полного голодания, которое у рыб может продолжаться от нескольких месяцев до 2-3 лет (угри), изменяется как масса тела, так и биохимические показатели. Так, скорпена, проголодавшая 5 месяцев теряет до 30% массы тела (Муравская и др., 1982), лососи во время нерестовых миграций - до 50% массы тела, при этом до 90% приходится на долю липидов и 72% белков (Лав, 1976). У угрей содержание лактата, глюкозы, гликогена в мышцах незначительно изменялось в течение 5 месяцев голодания. При этом скорость биосинтеза глюкозы в гликоген в их выделенных гепатоцитах и экзогенного лактата значительно (в 5-13 раз) превышала скорость глюконеогенеза в клетках печени нормальных угрей. Основным источником углерода при глюконеогенезе в печени голодающих угрей, по мнению других авторов, является лактат (Renaud et al., 1980). У радужной форели, созревающие яйцеклетки резорбируются в период голодания. Белок при истощении расходуется после того, как кончаются запасы гликогена, причём этот процесс усиливается после истощения запасных липидов (Муравская, 1982). Также у радужной форели при высокобелковом рационе и при голодании снижалась активность пируваткиназы (ПК), фосфофруктокиназы и гексокиназы (ГК) (Fideu et, al., 1983). Гепатоциты, выделенные из печени форели, акклиматизированной к 10 и 20 С0, незначительно отличались по содержанию гликогена и скорости образования глюкозы из эндогенных субстратов. Проведённые исследования показали, что основным источником глюкозы, высвобождающейся из клеток, при низкой температуре является глюконеогенез, а при высокой - гликогенолиз (Seibert et al., 1985). В течение второго месяца голодания радужной форели в печени и почках обнаруживалось общее повышение активности ферментов глюконеогенеза, тогда как: в течение первого месяца потребность в глюконеогенезе у рыб невелика, вследствие использования гликогена печени в качестве источника глюкозы крови (Morata, 1982). При 142-дневном голодании змееголова концентрация гликогена в печени резко уменьшалась, а в мышцах не изменялась (Woo et al., 1980).
При изучении углеводного обмена у птиц при голодании (Garcia et al., І 987) было показано что, у цыплят пищевая депривация в течение 48 часов приводило к 10-кратному снижению гликогена в печени, накоплению ацетоацетата и 3-оксибутирата и снижению концентраций лактата и малата при этом гомеостаз глюкозы практически не изменялся. При этом наблюдали активацию лактатдегидрогеназы (ЛДГ), аконитатгидратазы (АГ) и малатдегидрогеназы (МДГ). При голодании у перепёлок изменений в содержании глюкозы в крови не обнаружено, но уменьшалось содержание триглицеридов (Didier, 1983). У мигрирующего скворца наблюдались суточные и сезонные вариации содержания гликогена и жира в печени (Pilio et al., 1983). В литературе приводятся также данные о нормальном уровне глюкозы в крови и гликогена в печени и мышцах лягушек, об их изменениях при голодании, о наличии сезонных изменений этих показателей (Farrar et al., 1979).
Сравнение концентраций лактата, пирувата, жирных кислот, глицерина и отношения инсулин/глюкагон позволяет считать, что голодание новорожденных поросят приводит к нарушению глюконеогенеза, которое может быть вызвано низким содержанием глюкагона в плазме и/или пониженной доступностью неэстерифицированных жирных кислот (Pegorier et al., 1981). При голодании, а также при индукции кетонемии и глюкозурии концентрация глюкозы в крови быков снижалась на 20%, а свободных жирных кислот увеличивалась в 2,5-6 раз (Lyle et al., 1984).
Гипотермия у крыс и сусликов вызывала снижение содержания гликогена в 2 раза в трапециевидной мышце. Снижение гликогена наблюдалось при самосогревании животных и пробуждении сусликов от спячки (Львова, 1983).
Любой патологический процесс или чрезмерное функциональное напряжение организма сопровождается мобилизацией энергетических резервов клеток. Прежде всего, расходуются запасы гликогена, причем наиболее интенсивная его утилизация происходит в клетках миокарда. В то же время при ряде патологических состояний, не относящихся к болезням накопления, наблюдается аккумуляция гликогена в кардиомиоцитах, причины этого остаются неясными. Изучая ультраструктуру миокарда собак через месяц после воспроизведения у них сахарного диабета, ряд исследователей обратили внимание на значительное скопление гликогена в кардиомиоцитах,. клетках почек, поджелудочной железы, нервной ткани, печени (Догаева и др., I960; Быковская, 1981; Лебкова, 1981).
Характеристика структуры гена и пространственной организации изоцитратлиазы и малатсинтазы
Как правило, для проявления активности ИЦЛ из различных источников необходимы ионы Mg2 . Так, для ИЦЛ, выделенной из семядолей проростка Lupinus, необходимо присутствие Mg в концентрации 5мМ, при этом достигается максимальная активация ИЦЛ. Величина Км для изоцитрата составила 1мМ при определении в фосфатном буфере, причём данная характеристика снижается до 0,1-0,2 мМ при определении в органических буферах. Авторами было изучено влияние различных, метаболитов на активность ИЦЛ Lupinus. Показано, что оксалоацетат, фосфоенолпируват, сукцинат - наиболее мощные ингибиторы. На основании данных по ИК-спектрометрии изоцитратлиазы, лиофильно высушенной в присутствии CsBry предполагается, что её основной структурой является а-спирализированная конформация (Vinccenzini et al., 1986).
Показано, что активность очищенной ИЦЛ из семядолей сои Glycine max конкурентно ингибировалась 3-фосфоглицератом, сукцинатом и глюкозой (Kj 2,7 и 34мМ соответственно), неконкурентно - D-малатом (Kj 15мМ) и по смешанному типу глюкозо-6-фосфатом (К; 50мМ). ФЕП оказался активатором ИЦЛ (активация на 59 % при концентрации 5 мМ ), а L-малат активировал ИЦЛ в низких концентрациях (0,5мМ), а в высоких - являлся ингибитором (Fargeix, 2004).
Для оптимальной активности ИЦЛ, выделенной из Pinuspinea (Pinzauti et al., 1982), необходимо 6мМ Mg , а ионы Са , Ва , Ni , Co , Mn , Zn и Cd оказывали ингибирующее действие на ИЦЛ. Интересно отметить, что термоинактивация ИЦЛ, выделенной из эндосперма клещевины, является двухфазным процессом и авторы объясняют это явление существованием двух стадий инактивации - переход в частично инактивированное состояние и в полностью неактивное. Причём удаление ионов металлов при диализе против ЭДТА приводит к полной инактивации ИЦЛ, активность которой восстанавливается при добавлении 5мМ Mg2+ и частично - после добавления Ва2+ или Mn2+ (Pinzauti et al., 1982). В результате эксперимента установлено, что комплекс Mg с изоцитратом является истинным субстратом И1ДЛ, выделенной из Pinus pinea. Mg2+ служит активатором, причем как неактивированная и активированная формы ИЦЛ обладают каталитической активностью. Авторами была предложена модель функционирования ИЦЛ, согласно которой молекула содержит активаторный центр связывания; Mg + (с высоким сродством) и каталитический центр (низкое сродство к Mg2+), Причём сродство ИЦЛ к свободному изоцитрату очень низко и свободный изоцитрат не связывается с активированной ИЦЛ. Кроме того, эти центры находятся в состоянии анти кооперативного взаимодействия (Firenzuoli etal., 1968).
Для ИЦЛ, выделенной из Е. coli, величины Км для изоцитрата при рН 6,8 и 7,3 составили 0,018 и 0,062 мМ соответственно. NaCl и КО конкурентно ингибировали активность ИЦЛ, предположительно вследствие связывания С1-с ее активным центром. Ингибирующе действие ФЕП на активность ИЦЛ зависело от рН (при: рН 7,3 и 6,8 величины Кі были 1,01 и ОД мМ соответственно). Это предполагает взаимодействие ФЕП с участком ИЦЛ, на котором связывается сукцинат. Считают, что ФЕП не является физиологически важным эффектором при регуляции ИЦЛ (Phue et aL, 2004).
ИЦЛ, выделенная из клеток дрожжей Candida brassicae также активируется Mg , оптимум активации: составляет 8мМ, причём активация наблюдается также и в случае добавления ионов Ва и Мп .Стимуляция активности фермента наблюдается при использовании восстановителей. Км по изоцитрату составила 1,5 мМ в фосфатном буфере и 0,62 мМ в имидазольном буфере (Kazuo et al., 1989).
Интересно отметить, что аналоги глиоксилата - оксалат и малонат по отношению к изоцитрату конкурентно ингибируют активность очищенного препарата ИЦЛ из E.coli: Kj для оксалата и малоната составили 5,1 и 580 мкМ соответственно. Продукт катализируемой исследуемым ферментом реакции -сукцинат является неконкурентным ингибитором по отношению к изоцитрату со значением К; 5,3 мкМ. Фермент характеризуется специфичностью в отношении двухвалентных катионов и максимальная скорость утилизации изоцитрата наблюдается в присутствии 5 мМ MgC . Авторы подчеркивают, что по специфичности в отношении ингибиторов и двухвалентных катионов, а также по аминокислотному составу ИЦЛ из Е. colt мало отличается от фермента из других источников (Phue et al., 2004).
Для проявления активности ИЦЛ, выделенной из развивающихся эмбрионов клещей Hyalomma dromedarii, необходимы ионы Mg T и SH-соединения. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации MgClj и меркаптоэтанола в двойных обратных координатах имеет линейный вид и характеризуется кажущимися Км 2,27 и 2,7 мМ соответственно. Км для изоцитрата составила 2,4 мМ. При изучении влияния; рН на Км выявлено наличие по крайей мере трех ионогенных групп с рк 5,8; 6,8;7,4, влияющих на катализ ИЦЛ. Кроме того, изоцитратлиаза конкурентно ингибируется оксалоацетатом (К\ 0,7мМ) и пируватом (Kj 0,63 мМ) и неконкурентно ингибируется ацетил-КоА (К; 1,6мМ) и сукцинатом (К; 1,35мМ). Ингибирование ИЦЛ фосфоенолпируватом зависит от рН и является неконкурентным при рН 4,4 (Kt 1,ЗЗмМ); рН 5,6 (К; 1,7мМ); рН 8 (Kj 1,36мМ) и конкурентным при рН 6,5 (К; 1,58мМ) и рН 6,8 (К; 3,0мМ) (Kamel et al., 1982).
Очень интересный опыт был проведён итальянскими исследователями при поддержке Европейского Космического Агенства (Ranaldi et al., 2003). Было показано, что некоторые характеристики биохимических процессов в невесомости могут изменяться. Однако, как в условиях невесомости, так и при действии микрогравитации основные кинетические характеристики ИЦЛ были постоянны. Кроме того, не происходило смещения химического равновесия.
Изменение концентрации некоторых метаболитов у бабочки махаона
Реакция животного организма на потребность в углеводах в различной степени зависит от степени включённости различных метаболических процессов, в частности, мобилизации запасного пула активных эндогенных веществ. Временное прекращение развития, известное под названием диапаузы,, играет важную роль в биологии насекомых. Диапауза чаще всего наблюдается на стадии яйца или куколки и обычно совпадает с периодом неблагоприятных внешних условий (Гилмур, 1968). В своём развитии насекомые проходят через несколько линек, во время которых их экзоскелет целиком перестраивается. Естественно, что пути углеводного обмена, ведущие к синтезу хитина, должны быть очень активны у насекомых, особенно на стадиях метаморфоза, ведущих к имаго. Следует отметить, что особенность глюконеогенетической трансформации у насекомых заключается в мобилизации запасных триацилглицеролов, откладываемых в больших количествах в жировом теле. Жироваое тело - аналог печени млекопитающих, но не место пассивных отложений жира (Захваткин, 1986). Кроме того жировое тело единственный поставщик трегалозы содержащейся в гемолимфе. Особенностью глюконеогенеза насекомых является образование конечного углевода -трегалозы, выполняющей в гемолимфе ту же роль, по мнению многих авторов, что и глюкоза крови млекопитающих (Тыщенко, 1986).
Процесс метаморфорза у насекомых связан с перестройкой органов и, в частности, с синтезом, хитинового скелета. Хитин является полимером ацилмураминовой кислоты, которая синтезируется из фруктозо-6-фосфата (Тыщенко, 1986). Для синтеза хитина могут использоваться продукты деградации тканей куколки, запасы гликогена, но, по-видимому, основным источником углерода при метаморфозе является жировое тело, содержащее нейтральные триацилглицеролы.
Результаты проведённых нами исследований свидетельствуют о том, что на стадии гусеницы метаболизм направлен на запасание нейтральных триацилглицеролов, в то время как у куколок происходит интенсификация глюконеогенетических процессов. Направление метаболических превращений в жировом теле насекомых регулируется гормональным путём. Экдизон вызывает усиленный синтез трегалозы, а в отсутствии этого гормона глюкоза превращается в гликоген. В период линьки и на последеней стадии диапаузы, когда эпидермальные клетки нуждаются в глюкозе, прекращается отложение гликогена и стимулируется образование транспортного сахара (Ахрем, 1973). Так, у куколки махаона (табл. 1) по сравнению с гусеницей происходит снижение количества гликолитических интермедиатов лактата, фосфоенолпирувата (ФЕП), пирувата. Концентрация глюкозы увеличивается почти в 2 раза, что, по-видимому, достигается интенсификацией глюконеогенеза за счёт мобилизации жирных кислот (Филлипович и др., 1983). Так, в частности, об этом свидетельствует увеличение концентрации о глицерофосфата, ацетоацетата и НАДН (табл. 1). Ацетил-КоА является одним из активаторов процесса глюконеогенеза. Например, у крыс добавление радиоактивно меченого ацетата увеличивало глюконеогенез в печени более чем на 89 % (Consoli et al., 1989). Увеличение трансформации жирных кислот в ацетил-КоА в митохондриях повышают величины отношений ацетил-КоА/КоА и НАДН/НАД, что, верятно, и у бабочек приводит к активации киназы пируватдегидрогеназы. Это, в свою очередь, вызывает фосфорилирование пируватдегидрогеназного комплекса (по трём остаткам серина) и переводит его в неактивное состояние (Коэн, 1986). О интенсификации глюконеогенетических процессов у куколок махаона свидетельствует увеличение концентрации глюкозы более чем в 2 раза, которое прямо коррелирует с увеличением содержания продуктов окисления жирных кислот.
Влияние пищевой депривации не может не отразиться на мобилизации запасного пула активных эндогенных веществ. Особую роль с точки зрения решения данной проблемы выполняет печень, так как в ней синтезируются многие органические вещества «на экспорт», используемые другими органамии и тканями. Например, в мозге нет запасов энергетически богатых. веществ (Страйер, 1985), а жирные кислоты не могут служить источником энергии для этого органа, так как они связаны с альбумином и не способны проникнуть через гематоэнцефалический барьер (Панин, 1983). В печени же протекают глюконеогенетические процессы, формируются кетоновые тела, а также активная транспортная форма жира, то есть важнейшие энергетические субстраты для организма крыс (Лебкова, 2000).
Результаты проведённых нами исследований свидетельствуют о том, что неизбежные изменения в функционировании органов при голодании вызывают адекватную перестройку метаболизма клеток печени. Наиболее ранний ответ организма голодающего животного - мобилизация печёночного гликогена как результат снижения концентрации глюкозы в крови.
В ходе проведённых нами экспериментов выявлено, что к 48 часам голодания содержание гликогена почти полностью иссякает и составляет 14,4±0,4 мкмоль в расчёте на глюкозу по сравнению с контрольным значением -285,0±4,6 (табл.2).
Кроме того, продолжительное голодание приводит к небольшому снижению количества гликолитических интермедиатов - лактата, фосфоенолпирувата, пирувата. Тем не менее, гомеостаз глюкозы у голодающих крыс практически не изменяется (уменьшается на 5,8%), что достигается включением на первых этапах пищевой депривации реакций дезаминирования, декарбоксилирования, переаминирования свободного пула аминокислот печени и свободных амнокислот мышц (Issad et al., 1987).
Изучение кинетических, физико-химических и регуляторных характеристик ИЦЛ из печени голодающих крыс
Влияние рН на активность ИЦЛ определяли путём проведения серии измерений скорости ферментаивной реакции при различных значениях рН. Для изучения рН оптимума исследуемого фермента использовали разные буферные системы: Tris-HCl, Hepes-KOH, NaH2P04 - Na2HP04. Наибольшую активность ИЦЛ проявляла в интервале рН 7,4-7,7. Самая высокая активность фермента наблюдалась при использовании Tris-HCl- буфера с рН 7,5 (рис. 12).
Анализ полученных данных показывает, что у куколок бабочки махаона сродство исследуемого фермента к изоцитрату сопоставимо с таковым из других объектов (Землянухин, 1986). В целом значения Км по изоцитрату для ИЦЛ различного происхождения варьируют в широких пределах концетрации метаболита.
Известно, что активность ферментов изменяется в присутствии ингибирующих веществ. Метаболиты, принадлежащие к классу конкурентных ингибиторов, по строению подобны субстрату и конкурируют с ним за активный центр фермента. Вопрос об ингибировании ИЦЛ органическими кислотами представляет большой интересе связи с проблемой регуляции глиоксилатного цикла в процессе глюконеогенеза. Поскольку продукт изоцитратлиазноц реакции — сукцинат. — является связующим звеном между глиоксилатным циклом и глюконеогенезом, а также, возможно, между другими метаболическими процессами, именно ИЦЛ может быть основным ферментом: цикла, через котрый осуществляется регуляция всего ГЦ. Это предположение подтверждается многочисленными исследованиями влияния интермедиатов глиоксилатного цикла и цикла трикарбоновых кислот, а также другиз путей, на активность ИЦЛ.
Исследование влияния интермедиатов клеточного метаболизма на активность изоцитратлиазы из куколок P.machaon позволило обнаружить ингибирование манатом и сукцинатом данного фермента по конкурентному типу. Расчитанные по методу Диксона (Диксон, 1982) значения констант ингибирования (К;) составили для глюкозо-6-фосфата - 0,3 мМ, для фруктозо-6-фосфата 60 мкм, а для сукцината и маната — 1,8 мМ и 1 мМ соответственно (рис. 15). Следует отметить, что малат практически не ингибировал (К; 4,2 мМ) ИЦЛ, выделенную из печени голодающих крыс. В тоже время фумарат практически не оказывал ингибирующего влияния на ИЦЛ из обоих объектов исследования (Kj ИЦЛ у махаона 4,5 мМ, IQ ИЦЛ у крысы 4,6 мМ).
Из регуляторных аспектов наибольший интерес представляет тот факт, что ингибитором ИЦЛ служит предшественник трегалозы — глюкозо-6-фосфат.
Это в определённой степени подтверждает физиологический смысл глиоксилатного цикла, заключающийся в обеспечении утилизации жирных кислот для поддержания достаточного уровня углеводов и энергетического баланса в клетках. По-видимому, в жировом теле существуют конкурентные взаимоотношения между синтезом трегалозы и гликогена. В присутствии избыточных количеств глюкозо-6-фосфата усиливается синтез трегалозы,. но подавляется синтез гликогена. И в том и в другом случае в отсутствии источников питания необходима мобилизация запасного пула жирных кислот. Что касается сукцината, то данные по его действию на ИЦД носят противоречивый характер. Тем не менее, большинство исследователей говорят о ингибировании ИЦЛ сукцинатом по неконкурентному типу. В наших исследованиях сукцинат ингибировал ИЦД по конкурентному типу. По всей видимости, ингибирование ИЦД сукцинатом должно иметь определённое значение в регуляции всего ГЦ и процесса глюконегенеза, первым субстратом которого и является сукцинат.
В литературе нет данных о реализации механизма регуляции глюконеогенеза по принципу обратной связи (McKinney, 2000). Кроме того, регуляция может происходить вследствие уменьшения проницаемости клеточной мембраны для субстрата-индуктора (Сг-соединения) под воздействием корепрессора (например, глюкозы). Однако эти механизмы тоже не выявлены при изучении регуляции ИЦД. Очевидно, в данном случае контроль активности фнрмента происходит на самом низком уровне -транскрипционном.
В ходе исследований нами были разработаны условия длительного хранения изоцитратлиазы. Активность гомогенного ферментного препарата ИЦЛ при 4 снижалась за первые сутки на 10-15%, а в дальнейшем на 10% каждые сутки. Оптимальными для ИЦЛ являются следующие условия: среда, содержащая 0,1 М Tris-HCl-буфер, рН 7,5, ЗмМ Р-меркаптоэтанол или 6 мМ дитиотрейтол, 5мМ MgC , 25%-ный глицерин. В данных условиях в течение первых 5 суток сохранялось 90% исходной активности, а через 30 дней 25%. Такая же среда использовалась для хранения ИЦЛ, выделенной из печени голодающих крыс.
Инкубация фермента ИЦЛ с аминокислотами, такими как серии, глицин, аспарагиновая и глутаминовая, не вызвала существенного изменения ферментативной активности. В ходе исследования показано, что инкубация ИЦЛ с катионами двухвалентных металлов, такими как Со , Pb , Fe , Си , Cd в концентрациях 5, 15 и 30 мМ, в течение 15, 30, 60 минут не приводила к изменению активности исследуемого фермента.. Ионы Na+, К+, СГ также не влияют на активность изоцитратлиазы из. куколок бабочек P. machaon и из печени голодающих крыс.
Из восстанавливающих агентов наиболее эффективным для проявления активности ИЦЛ является цистеин. Иногда он может быть замещён ЭДТА, однако при добавлении к хранившимся некоторое время препаратам этот агент не восстанавливает активность фермента в отличие от цистеина, глутатиона, дитиотрейтола. Сообщаолсь о действии ЭДТА как конкурентного ингибитора ИЦЛ из клещевины (Malhotra et ah, 1982). Для подсолнечника влияние ЭДТА показано не было (Землянухин и др., 1984). Обычно в среде выделения присутствует ЭДТА и один из восстанавливающих агентов; — глутатион, дитиоэритритол, тиогликолат или другие (Vanni et al., 1979). Необходимость восстанавливающих агентов для проявления активности ИЦЛ объясняется тем, что они поддерживают тиольные группы фермента в восстановленом состоянии (Vanni et al., 1979; Spector et al., 1972). ЭДТА играет роль в удалении ионов тяжёлых металлов, ингибирующих фермент.
