Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Современные представления о гликозаминогликанах 12
1.1.1 Классификация и структура гликозаминогликаное 12
1.1.2. Биосинтез и регуляция обмена гликозаминогликаное 18
1.1.3..Взаимодействие гликозаминогликаное с коллагеноеыми белками. 23
1.2. Изменения в обмене соединительной ткани при заживлении ран...25
1.2.1 .Фазы заживления ран 25
1.2.2.Исследоеания обмена соединительной ткани при травмах 27
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования 33
2.2. Методы исследования показателей обмена гликозаминогликанов...34
2.2.1. Определение содержания гликозаминогликаное в тканях и биологических жидкостях 34
2.2.2. Выделение и фракционирование гликозаминогликаное 35
2.2.3. Определение суммарных гексозаминсодержащих биополимеров в сыворотке крови и тканях 36
2.2.4. Определение гексозаминсинтетазной активности тканей 37
2.2.5. Метод исследования глюкуронатсинтетазной активности тканей 38
2.2.6. Определение гиалуронидазной активности сыворотки крови 38
2.3. Определение показателей обмена коллагена 39
2.4. Количественное определение кортизола в крови 41
2.5. Статистические методы ...42
Глава 3. Результаты исследования
3.1 Метаболизм биополимеров соединительной ткани при ранах брюшной стенки в экспериментальной модели у крыс 43
3.1.1. Изменение показателей обмена гликозаминогликанов в зависимости от травматюации при нанесении ран в эксперименте 43
3.1.1.1 Изменения в содержании гликозаминогликанов крови крыс при нанесении травмы 43
3.1.1.2. Активность гиалуронидазы в сыворотке крови крыс до и после нанесения ран брюшной стенки 45
3.1.1.3. Показатели обмена гликозаминогликанов кожи крыс при ранах разной степени травматизации 47
3.1.1.4. Динамика показателей обмена глизаминогликанов в гомогенате желудка крыс при проникающих и непроникающих ранах 49
3.1.1.5.Изменения показателей обмена гликозаминогликанов в гомогенатах тонкой кишки при травмировании брюшной стенки крыс 51
3.1.1.6. Изменения глюкуронатсинтетазнои активности в гомогенате стенки желудка при травмировании крыс 53
3.1.2. Обмен гексозаминсодержащих биополимеров при ранах брюшной стенки в эксперименте 56
3.1.2.1. Изменение гексозаминсодержащих биополимеров в сыворотке крови и стенке желудка при ранах брюшной стенки у крыс 56
3.1.2.2. Динамика гексозаминсинтетазнои активности в стенке желудка и тонкой кишки при травмировании брюшной стенки крыс 58
3.1.3. Изменение обмена коллагена при резаных ранах брюшной стенки в эксперименте 60
3.2 Особенности обмена биополимеров соединительной ткани в течение раневого процесса при лапароскопических и лапаротомных операциях 73
3.2.1. Динамика показателей обмена гликозаминогликанов у больных в клинике при лапаротомном и лапароскопическом варианте холецистэктомий 73
3.2.2. Изменение показателей обмена коллагена у пациентов после холецистэктомии в клинике 79
3.2.3. Влияние лапароскопических и лапаротомных методов оперативного вмешательства на уровень АКТГ и кортизола в крови 83
Глава 4. Обсуждение результатов исследования
4.1.Особенности динамики показателей обмена биополимеров соединительной ткани в условиях экспериментальной модели раневого процесса у крыс с разной степенью травматизации 86
4.2. Анализ динамики обмена соединительной ткани и уровня кортизола и АКТГ в крови у больных после холецистэктомии 99
Выводы 106
Список литературы 109
- Классификация и структура гликозаминогликаное
- Определение показателей обмена коллагена
- Активность гиалуронидазы в сыворотке крови крыс до и после нанесения ран брюшной стенки
- Анализ динамики обмена соединительной ткани и уровня кортизола и АКТГ в крови у больных после холецистэктомии
Введение к работе
Актуальность. В процессах адаптации организма к стрессогенньш условиям любого оперативного вмешательства, важная роль принадлежит соединительной ткани, выполняющей опорную, трофическую, защитную, структурообразующую и репаративную функции [74, 76, 167]. Соединительная ткань занимает в организме особое место. Она распределена по всему телу, входит в состав хрящей, сухожилий, связок, матрикса костей, служит для фиксации кровеносных сосудов; она же составляет основу межклеточного связывающего вещества в паренхиматозных органах. В последние годы методы биохимии позволили получить принципиально новые сведения о закономерностях биосинтеза, структуры и катаболизма составных элементов соединительной ткани, особенно ее межклеточных компонентов [10, 175, 186]. Сформировались новые представления о ней, как высоко реактивной, динамичной, с широким спектром физиологических функций ткани. В функционировании соединительной ткани, наряду с коллагеном и эластином, важную роль играют гликозаминогликаны (ГАГ). ГАГ существенно влияют на процессы пролиферации клеток, формирования волокнистых структур и грануляционной ткани [48, 75, 154, 190, 202]. Кроме того, ГАГ и их производные обладают иммуномодулирующей активностью [200].
Рана, или нарушение целостности наружного покрова (кожи, слизистой оболочки), повреждение внутренних органов влечет за собой изменение в обменных процессах соединительной ткани, что отражается на динамике ГАГ [56, 68, 180, 183]. К сожалению, при большом количестве экспериментальных и клинических исследований, посвященных изучению различных аспектов раневого процесса [7, 16, 144, 174], механизмы нарушения обмена биополимеров соединительной ткани изучены недостаточно. В настоящее время мало доступной информации, посвященной отношению результатов, полученных при хирургических ранах на людях в условиях клиники и в условиях экспериментальной модели [146, 147]. * Отсутствуют сравнительные исследования изменений содержания ГАГ в тканях, в зависимости от степени травматизации при резаных ранах в эксперименте и во время оперативных вмешательств в хирургии. В то же время тесная взаимосвязь обмена ГАГ с другими компонентами соединительной ткани, таких как гексозаминсодержащие белки и коллаген, предполагает комплексное изучение этих биополимеров.
Представляет практический интерес изучение обменных процессов в соединительной ткани при хирургических операциях в клинике. Особенно актуально это в настоящее время, когда в практической медицине на смену традиционным, лапаротомным методам операций приходят эндоскопические методы. Все чаще лапароскопический метод используется хирургами при оперативном лечении желчнокаменной болезни [47, 70, 174]. ( Лапароскопические операции, выполняемые с использованием эндоскопического оборудования, - это малоинвазивные технологии, при которых отмечается минимальная травма брюшной стенки, поскольку все манипуляции выполняются инструментами, вводимыми в брюшную полость путем пункции, операция проходит в условиях не «открытого поля» [32]. Это предъявляет более высокие требования к лабораторной диагностике, поиску и использованию информативных показателей раневого процесса, степени травмирования с целью снижения интра- и послеоперационных осложнений, сокращения пребывания больного в стационаре и длительности временной нетрудоспособности, уменьшения послеоперационной летальности [67, 164]. В настоящее время для характеристики течения послеоперационного раневого процесса используются, главным образом, методы, дающие у информацию о возникновении гнойно-воспалительных осложнений: бактериологический контроль, исследование электролитов, активности различных ферментов в раневом секрете, определение фагоцитоза, иммунных факторов защиты. Поэтому, важным дополнением к этим методам могут быть методы определения показателей обмена соединительной ткани, которые позволят не только оценить степень травмирования, но и * осуществлять мониторинг заживления раны. В то же время показатели обмена биополимеров соединительной ткани при оперативных вмешательствах не нашли пока еще широкого применения в практике ввиду того, что, во-первых, недостаточно изучены, и во-вторых, не в полной мере определена их диагностическая ценность. В этом плане представляет интерес проведение сравнительного исследования показателей обмена биополимеров соединительной ткани при хирургических операциях по поводу холецистита, в эндоскопическом и традиционном, лапаротомном варианте.
Исследования в клинике существенно ограничены отсутствием возможности контролировать многие параметры. Этих ограничений значительно меньше в условиях экспериментальной модели на животных.
, Цель исследования:
Изучить особенности обмена гликозаминогликанов при резаных ранах брюшной стенки в зависимости от степени травматизации в эксперименте и клинике (холецистэктомия лапаротомным и лапароскопическим методами).
Задачи:
Исследовать обмен ГАГ у крыс с проникающей и непроникающей резаной раной брюшной стенки в динамике заживления.
Исследовать изменения показателей обмена гексозаминсодержащих биополимеров и коллагена при ранах брюшной стенки в эксперименте.
Исследовать показатели обмена ГАГ в биологических жидкостях больных, прооперированных по поводу холецистита лапаротомным и f' лапароскопическим методами.
4. Провести сравнительный анализ показателей обмена ГАГ при разной степени травматизации (нанесения раны) в эксперименте и в условиях клиники.
Научная новизна. В работе впервые получены сравнительные данные о динамике изменений состояния обмена ГАГ при проникающих и непроникающих резаных ранах брюшной стенки в условиях экспериментальной модели у крыс.
Обнаружена зависимость характера изменений показателей обмена ГАГ и коллагена от степени травмирования при нанесении резаной раны.
Впервые проведен сравнительный анализ динамики показателей биополимеров соединительной ткани в течение раневого процесса после лапароскопических и лапаротомных операций.
Теоретическое значение. Результаты исследования расширяют представления о патохимии процессов заживления проникающих и непроникающих ран. Они позволяют глубже изучить причинно-следственные связи нарушения обмена ГАГ и коллагена, участвующих не только в репаративных процессах или процессах заживления, но и общем восстановлении организма после стресса, получаемого при хирургическом вмешательстве.
Практическая значимость. Полученные данные позволят более целенаправленно подходить к выбору метода оперативного лечения холецистита и прогнозировать интенсивность воспалительного процесса в послеоперационный период.
На основе комплексного клинико-функционального исследования больных в приемном покое хирургического отделения МУЗ МСЧ № 3 г. Ижевска определены условия для проведения лапароскопических хирургических вмешательств, проводится лабораторная диагностика послеоперационного состояния пациентов. В качестве дополнительного теста в оценке состояния больных используются модифицированные лабораторные методы исследования обмена ГАГ и других биополимеров соединительной ткани. В лечебно-профилактических учреждениях г. Ижевска (ГУЗ РКБ № 1, МУЗ МСЧ № 1, МУЗ МСЧ № 3) врачи клинической лабораторной диагностики используют в своей работе рекомендации информационных писем «Методы лабораторных исследований гликозаминогликанов (кислых мукополисахаридов) в биологических жидкостях» (Ижевск, 2001), «Методы лабораторных исследований показателей обмена коллагенов в биологических жидкостях» (Ижевск, 2003). Клинико-диагностическим лабораториям ЛПУ Удмуртской Республики рекомендовано к внедрению рационализаторское предложение «Тест для определения гликозаминогликанов в сыворотке крови» (2002, №10.02).
Основные положения, выносимые на защиту і
Динамика обмена ГАГ в организме при нанесении раны имеет двухфазный характер. Выраженность изменений показателей обмена ГАГ при оперативном вмешательстве на брюшной стенке в эксперименте зависит от степени травматизации.
Изменения показателей обмена ГАГ и других биополимеров соединительной ткани при проникающей ране, в отличие от непроникающей, имеют системный характер.
Определение показателей обмена ГАГ и других биополимеров соединительной ткани при проведении хирургических операций в брюшной полости позволяет оценить тяжесть оперативного вмешательства и прогнозировать сроки реабилитации.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ.
Апробация работы. Основные положения доложены на конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири (Челябинск, 1999), на научно-практической конференции «Молодые ученые на рубеже веков» (Ижевск, 2000), на научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2001)
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах, содержит 23 таблицы, 16 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 202 источника, из которых 95 отечественных и 107 иностранных авторов.
Классификация и структура гликозаминогликаное
Следующим сульфатированным ГАГ является гепарин - известный антикоагулянт, молекулярная масса его находится в пределах 15000-20000 Да. Он обнаружен в крови, сосудистой стенке, легких и других органах. Гепарин синтезируется тучными клетками, В составе молекулы гепарина найдены остатки D-глюкуроновой и L-идуроновой кислот, D-глюкозамина и N-ацетил-О-глюкозамина, которые могут быть сульфатированы в положении 2 и 6 [44, 65].
Гепарансульфат впервые был получен из печени и легких. Этот биополимер оказался наиболее распостраненным в организме животных из всех сульфатированных ГАГ. По составу структурных элементов он близок к гепарину, состоит из остатков D-глюкозамина, D-глюкуроновой и L-идуроновой кислот [8].
Восьмым представителем ГАГ является кератансульфат, впервые был выделен из роговицы глаз, где содержание его составляет почти 50% общего количества ГАГ. В настоящее время кератансульфат обнаружен в различных видах соединительной ткани, кроме аорты и кожи [1, 107, 123, 191]. Полисахаридная цепочка его построена из чередующихся остатков D-галактозы и Ы-ацетил-О-глюкозамина, сульфатированного в положении 6 . Как видно, в составе кератансульфата присутствуют остатки гексуроновых кислот (глю-куроновой и идуроновой кислот) [106]. Уровень ГАГ в тканях сравнительно невысок. Так, суммарное количество ГАГ в среднем равно в стенке аорты 14,4 - 18,5, в коже 8,2 и печени 0,77 ммолям гексуроновых кислот на 1 кг сухой обезжиренной ткани [86, 90]. Хомуло П.С. и Коннова Л.А. [87] фракционировали ГАГ стенки аорты после папаинового протеолиза и показали, что в ней содержание суммарных ГАГ, ГК, хондроитин-4- и хондроитин-6-сульфатов, дерматансульфата и ге-парансульфата равно 20,15; 6,96; 0,96; 4,44; 1,64 и 6,15 ммолям гексуроновых кислот на 1 кг сухой обезжиренной ткани соответственно. В ткани желудка крыс суммарных ГАГ содержится 2,83, в ткани 12-перстной кишки -2,52 ммоль гексуроновых кислот на 1 кг сухой обезжиренной ткани [28].
В плазме крови человека и различных животных уровень ГАГ находится в пределах от 16,4 до 51,2 мкмоль гексуроновых кислот на 1 л [31, 62, 71, 195].
Наличие остатков сульфатных или карбоксильных групп придает ГАГ большой отрицательный заряд. Такая полианионная структура ГАГ во многом определяет выполняемые ими функции. Полисахаридные цепи недостаточно гибки, чтобы сворачиваться в компактные глобулы, как это происходит с полипептидными цепями. В то же время благодаря своей высокой полианионной плотности молекулы ГАГ притягивают множество осмотически активных ионов, таких, например, как Na+, К+ и др. Ввиду этого молекулы ГАГ становятся в высокой степени гидрофильны. Это приводит к присасыванию в матрикс большого количества воды. Поэтому ГАГ стремятся принять конформацию очень рыхлого, неупорядочного клубка, который будет занимать огромный для своей массы объем, а также образовывать гели. Благодаря присасыванию в матрикс воды создается давление набухания (тур-гор), позволяющее матриксу противостоять сжимающим силам [1, 176]. Здесь проявляется кооперативность между различными компонентами соединительной ткани, т.к. матрикс противостоит сжатию, а волокна коллагена, наоборот, противодействуют растяжению [112, 136, 192]. Почти все виды ГАГ в тканях ковалентно соединены со специфическими белковыми компонентами. Гиалуронат-протеин, выделенный из синовиальной жидкости, содержит 2,0-2,3% ковалентно связанного белка. По данным Rosenberg L. [183] хондр оитинсульфаты хряща содержат 5-10% белка, связанного ковалентно. Структура таких комплексов изучена элек-тронно-микроскопически [183] и представлена на рисунке 1. 2.
Протеогликановая субъединица содержит олигосахаридные цепи кератан-сульфата и хондроитинсульфата, ковалентно связанные с полипептидным остовом (коровый белок) субъединицы. Субъединицы нековалентно связаны с длинной нитевидной молекулой гиалуроновой кислоты с помощью связывающих белков [80].
ГАГ способны взаимодействовать с белками плазмы крови. Большая часть сывороточных белков и фибриноген реагируют с ГК и гепарином. Некоторые виды ГАГ реагируют с сывороточными иммуноглобулинами [26, 69, 190]. В ряде работ уже доказано, что некоторые ГАГ, в частности гепарин, способны связываться с липопротеинлипазой (ЛПЛ). Гепарин, связанный с липопротеинлипазой и называемый высокоактивным, способен связываться и с липопротеинами низкой плотности (ЛПНП), что имеет значение при развитиии атеросклероза [42, 50, 115, 129]. Такое связывание гепарина с ЛПНП происходит в присутствии ионов Са. Взаимодействие ГАГ с липопротеинлипазой (ЛПЛ) происходит между положительно заряженными группами ЛПЛ и отрицательно заряженными группами углеводных цепей ГАГ [66]. Данный комплекс (ЛПЛ - гепарин) участвует в накоплении эфиров холестерина в тканях и клетках. СГАГ участвуют в процессе аккумуляции свободного холестерина и других частей липо протеидов, синтезируемых печенью [43, 69, 128]. В опытах на крысах было показано, что длительная гиперхолестеринемия сопровождается тотальной холестеринизацией мембран и накоплением внеклеточных отложений холестерина. Одновременно с этим процессом на поверхности клеток возрастает доля ГАГ. При изучении мембран выяснилось, что холестеринизация происходила только у тех клеток, на поверхности которых имелся отчетливо выраженный слой ГАГ [133]. Находясь на клеточных мембранах ГАГ, помимо описанных выше эффектов, способны влиять на рост клеток и тканей, участвовать в регуляции взаимодействия между клетками и внеклеточной средой [13, 23, 99, 184].
До последнего времени считалось, что ГАГ и ПГл - регулярные структуры, то есть состоят из определенных повторяющихся участков, и эта структура стабильна. В свете последних работ показано, что ГАГ и ПГ мик-рогетерогенны, то есть являются по сути нерегулярными структурами. Эта микрогетерогенность молекул ГАГ позволяет им служить информационными молекулами [172]. В хондроитинсульфатах обнаружено 13 структурных вариантов дисахаридов. В каждой отдельной цепи хондроитинсульфата может одновременно присутствовать несколько типов дисахаридов, что обеспечивает химическую микрогетерогенность цепей ГАГ. Интересно, что расчет информационных возможностей молекул гепарина дал результат 10 различных типов молекул, и есть предположение, что весь этот потенциал реализуется клеткой. Информативность молекул ПГ может служить химической основой для выполнения ими достаточно сложных, высокоспецифических функций в жизни клеток [101, 196].
Определение показателей обмена коллагена
Эксперименты проводились на 463 растущих крысах-самцах массой 110-140 г. Животные содержались на обычном рационе вивария, составленного для взрослых крыс по рекомендациям И.П. Западнюка и соавт. [22]. Все опыты проводились в осенне-зимнее время. Подопытные животные были разделены на две основные группы. Животным первой группы (192 крысы) натощак под кратковременным эфирным наркозом в асептических условиях проводили прямой разрез кожи с подкожной клетчаткой от края реберной дуги длиной 5 см. Разрез проводили на 1 см справа от средней линии брюшной стенки. На рану накладывали 5 швов послойно.
Животным другой группы (182 крысы) моделировали проникающую рану в брюшную полость через все слои длиной 5 см, при этом кончиком шпателя без больших физических усилий надавливали на желудок, тонкую кишку и печень в области желчного протока. На рану накладывали швы послойно. В число опытных крыс включали только тех животных, у которых не было послеоперационных осложнений в виде перитонита и нагноения ран. Контролем служили 89 крыс-самцов массой 110-140 г.
Животных забивали под кратковременным эфирным наркозом. При этом опытных крыс забивали через 2 ч, через 5 дней и 10 дней после операции. Контрольным и подопытным животным вскрывали брюшную полость. Для биохимического анализа использовали плазму крови, а также гомогенаты тканей кожи, стенки желудка (все слои) и проксимального отдела тонкого кишечника (все слои). Операции по выделению материала проводили на холоде. Число контрольных и подопытных животных в каждой серии опытов представлены в главах собственных данных.
Отдельно проводились исследования в условиях клиники. С этой целью наблюдались пациенты, прооперированные с диагнозом хронического калькулезного холецистита. Первой группе, состоящей из 18 человек (14 женщин и 4 мужчин в возрасте 36-60 лет), была проведена холецистэктомия традиционным (лапаротомным) методом. Больные второй группы (16 женщин в возрасте 35-56 лет) прооперированы эндоскопическим методом. Отбор больных и их лечение осуществлялось в хирургическом отделении МУЗ МСЧ №3 г. Ижевска под руководством доктора медицинских наук, профессора Мальчикова А.Я.
Для плановых лабораторных исследований кровь и моча забирались утром, натощак до операции, на следующий день после операции, затем на 5-й, 7-й и 12-й дни после операции. Специальные биохимические показатели для исследовательской работы определяли в оставшейся части сыворотки крови и мочи после плановых лабораторных анализов.
Суммарные ГАГ в сыворотке крови, моче и гомогенатах тканей определяли по уровню гексуроновых кислот [76, 88, 94].
Ход определения. ГАГ из 1 мл плазмы крови (с цитратом) или 0,5 мл мочи осаждали 4-х кратным объемом 2 мл охлажденного до 1-5С этанола (94-95%), содержащего 0,1М уксуснокислого калия и 0,15М уксусной кислоты. Пробу перемешивали, через 5-6 мин. центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 15 мин. Осадок эмульгировали в 3 мл 0,ЗМ трихлоруксуснои кислоте и полученную смесь гидролизовали в кипящей водяной бане в течение 30 мин., пользуясь каплеуловителем. Затем пробу охлаждали до 18-22С и центрифугировали (3000 об/мин., 10 мин.). К 1 мл надосадка добавляли (при охлаждении в воде со льдом) 5 мл концентрированной серной кислоты, содержащей 0,025М (9,5 г/л) кристаллического тетраборнокислого натрия. После перемешивания пробу нагревали 10 мин. в кипящей водяной бане и снова охлаждали. Прибавляли 0,2 мл ОД25% раствора карбазола в абсолютном этаноле и смесь перемешивали. В контрольную пробу вместо раствора карбазола добавляли 0,2 мл этанола. Пробы нагревали в кипящей бане в течение 15 мин., пользуясь каплеуловителем. Экстинцию окрашенных растворов измеряли при длине волны 530 нм. Количество гексуроновых кислот в пробах находили по калибровочной кривой, построенной со стандартными растворами глюкуроновой кислоты (Fluka A.G., Buchs, Швейцария; мол. масса -194). Содержание ГАГ в плазме крови и моче выражали в мкмолях гексуроновых кислот на 1 л биологической жидкости.
Для определения суммарных ГАГ в гомогенатах тканей желудка, тонкой кишки и кожи брали по 20 мг сухой обезжиренной ткани и гомогенизировали их в 0,5 мл дистиллированной воды. ГАГ из гомогенатов осаждали и в осадках определяли содержание гексуроновых кислот в той же последовательности, как описано выше. Исследуемые биополимеры выражали в мкмолях на кг сухой обезжиренной ткани.
Выделение и фракционирование ГАГ из тканей желудка (все слои), тонкой кишки (все слои) и кожи проводили по методу Schiller S, с дополнениями [28, 37], которые описаны ниже.
Ход определения. Кусочки свежевыделенной ткани тщательно измельчали, обезжиривали этанолом, диэтиловым эфиром, ацетоном и высушивали до постоянного веса на воздухе, над хлористым кальцием и стружками парафина. Высушенную и измельченную ткань желудка подвергали протеолизу папаином при 65С в течение 48 ч. При этом состав инкубационной смеси включал: 1 мл ацетатного буфера (0,05М; рН 6,5); 40 мг сухого порошка ткани; 0,2 мл 1,2% раствора папаина (КФ 3.4.22.7; Merck, Германия) в вышеуказанном ацетатном буфере, содержащего 0,005 М ЭДТА и 0,05 М солянокислого цистеина. В конце инкубации рН смеси доводили до pH = 5,0 раствором 2н соляной кислоты, добавляли 2 мл 2,5% раствора ацетилтриметил аммоний бромида, тщательно перемешивали и оставляли на 12 ч. при 4-5С. Осадок ГАГ получали центрифугированием при 3000 об/мин. в течение 10 мин. Препарат ГАГ трижды промывали 94-96% этанолом, насыщенным хлористым натрием.
К препарату ГАГ добавляли 2 мл 0,25М раствора хлористого натрия и полученную гомогенную смесь наносили на колонку (1x40см) хлоридной формы дауэкса 1x2 (200-400 меш.), уравновешенной 0,25М раствором хлористого натрия. ГК и СГАГ (хондроитин-4- и хондроитин-6-сульфаты, дерматан сульфат и кератан сульфат) из колонки элюировали соответственно 0,5М и 3,0М растворами хлористого натрия. Элюат собирали по 2 мл со скоростью 10 мл/час. Для калибровки колонки и учета выхода отдельных фракций ГАГ использовали известные количества чистых образцов ГАГ (Koch LTD, Великобритания). Количественный анализ фракций проводили путем определения гексуроновых кислот по указанному выше методу (п.2.2.1). Содержание отдельных фракций ГАГ выражали в мкмолях гексуроновых кислот на кг сухой обезжиренной ткани.
Активность гиалуронидазы в сыворотке крови крыс до и после нанесения ран брюшной стенки
Интересным представляется обнаруженный факт различия в изменении уровня ГСБ в крови и желудке, направленность которых была противоположной (рис. 4.2). Через 2 часа после операции уровень ГСБ существенно возрастает в крови, тогда как в стенке желудка их уровень значительно снижается. На 5-й день, наоборот, отмечается рост ГСБ в желудке и их существенное падение в крови. К 10-му дню эксперимента уровень ГСБ как в крови, так и в желудке приближается к исходным значениям. При этом динамика ГСБ в желудке отражает изменение активности гексозаминсинтетазы в желудке (г = 0,96, р 0,05 у животных с проникающей раной) (рис.3.5). Изменения ГСБ в тонком кишечнике были такими же, как и в желудке. Обращает на себя внимание отсутствие различий в активности ГАС А между экспериментами с проникающей и непроникающей раной.
Таким образом, обнаруженные особенности изменения обмена ГСБ при нанесении раны заключаются в том, что с одной стороны этот показатель высоко чувствителен к травме, с другой, одинаково высокая реакция наблюдается как при проникающей, так и непроникающей ране. Так же, как и в случае обмена ГАГ, наблюдается четко выраженный двухфазный характер изменения исследуемых показателей. При этом динамика этих изменений в крови и в исследуемых органах брюшной полости была противоположной.
Процесс заживления раны - нелинейный, сложно организованный процесс, инициируемый повреждением целостности органа или ткани. Отдельным этапам этого процесса свойственны свои закономерности [25, 70, 74, 146].
Анализ динамики изменения обмена ГАГ и ферментов, детерминирующих его основные параметры, после нанесения травмы показал, что она состоит из двух четко выраженных этапов. Первый этап характеризуется значениями определяемых нами показателей через 2 часа после операции. Этот этап можно определить, как фаза катаболических реакций, которая разворачивается в своих процессах, как стресс-реакция. Это проявляется в усиленном распаде биополимеров соединительной ткани, активации гидролизующих ферментов и снижения активности ферментов синтеза. Данный этап, протекающий локально или системно, возможно, является одновременно механизмом усиления сигналов раневого повреждения органов и тканей.
Рост продуктов распада соединительной ткани может по механизму обратной связи усилить синтетические процессы, и тем самым, обмен в целом. Так в работе Ikeda К., Yamauchi D., Osamura N. [143] при наблюдении на кролике за восстановлением тканей после экспериментально вызванного неиролизиса было показано, что обработка области поражения гиалуроновой кислотой в начале оперативного вмешательства привела к существенному уменьшению образования рубца. Это свидетельствует о том, что уже на первых этапах заживления раны, ГАГ и их метаболиты являются фактором, обеспечивающим более качественное восстановление поврежденных тканей. Регуляция по механизму обратной связи, является классическим примером регуляции многих метаболических процессов в организме. Кроме того, накопление продуктов распада может быть фактором субстратного обеспечения следующей фазы раневого процесса — синтетической.
Значения исследуемых показателей на 5-й день экспериментальных наблюдений отражают совершенно иные процессы, их изменения имеют другую направленность. Этот этап можно определить как синтетический, он характеризуется высокой активностью синтетических ферментов и соответствующим изменением показателей обмена ГАГ. Высокий уровень общих ГАГ в крови на 5-10-й дни после нанесения раны отражает, по-видимому, интенсивно идущие процессы регенерации, фиброплазию, формирование межклеточного матрикса и эпителизацию тканей. На это указывает повышение концентрации СГАГ на 5-й день после операции. Основанием этому служат результаты исследования, полученные Zou Х.Н., Foong W.C., Сао Т. et. all., (2004 г.), в которых показано, что хондроитин сульфат является фактором регуляции процесса грануляции ткани в течение заживления раны. А именно, в экспериментальной модели раневого процесса на кролике наблюдали, что лечение хондроитинсульфатом привело к дозозависимому увеличению клеточной адгезии и клеточной пролиферации фибробластов, тогда как противоположный эффект наблюдали после деградации хондроитина под действием хондроитиназы. Ингибирование сульфатирования гликозаминогликанов обработкой хлоратами приводило к снижению клеточной адгезии и клеточной пролиферации и медленному закрытию раны in vitro. Кроме того, экспозиция хондроитин-4 сульфата приводит к дозозависимому снижению клеточной адгезии. Эти результаты свидетельствуют о том, что хондроитинсульфат вовлечен в процессы заживления раны [202]. В другой работе убедительно показано, что, химически поперечносшитыи гликозоаминогликановьш гидрогель ускоряет заживление раны при увеличении ее ре-эпителизации [151].
Таким образом, полученные нами экспериментальные данные подтверждают исключительную роль ГАГ в процессах заживления раны. При этом раневой процесс, все его этапы, согласно нашим данным и данным литературы, являются весьма чувствительными к этому показателю.
Анализ изменения показателей обмена коллагена в крови после нанесения раны показал, что их динамика имеет сходный характер с изменением обмена ГАГ (у животных с проникающей раной ГАГ и СГОП в крови: г = 0, 79, р 0,05; в желудке: г = 0,95, р 0,001; в тонком кишечнике: г = 0,84, р 0,05). Так же практически не наблюдались изменения этих показателей в крови при непроникающей ране и носили ярко выраженный характер при проникающей ране (табл. ЗЛО., 3.11., 3.18., 3.20). Это нашло отражение в изменении таких показателей как СГОП, ПСГОП, и активность коллагеназы. При этом пик активности коллагеназы в тканях желудка и тонкой кишки крыс, наблюдался в первые часы только при проникающей ране, тогда как изменение активности коллагеназы в крови происходило в обоих случаях (табл. 3.14., 3.15., 3.16., 3.17). Такую же реакцию наблюдали и по обмену ГАГ, как было описано выше. Это так же свидетельствует в пользу того, что при проникающем ранении, в отличие от непроникающего, реакция обмена коллагена носит системный характер.
Анализ динамики обмена соединительной ткани и уровня кортизола и АКТГ в крови у больных после холецистэктомии
Оценка степени травматичности хирургического вмешательства, мониторинг заживления раны являются факторами, определяющими выбор адекватной терапии как в интраоперационный, так и послеоперационный период. Поэтому своевременная и достоверная оценка характера течения раневого процесса, особенно в послеоперационный период, является важной задачей современной клинической лабораторной диагностики. Показатели обмена соединительной ткани являются достаточно чувствительными к повреждению и воспалению в организме, что было показано в ряде работ [4, 20, 28, 47, 202]. Это обусловливает их информативностью в определении характера многих процессов, участвующих в заживлении раны. В то же время исследование обмена соединительной ткани еще не нашло широкого применения в клинической практике. Одной из причин этого является недостаточная изученность этого вопроса, вследствие чего до сих пор не определена диагностическая ценность многих показателей обмена соединительной ткани. Особенно ценными эти показатели могут быть в определении степени травмирования органа или ткани у оперированных больных, в контроле заживления раны, а так же имеющихся и вновь возникающих воспалительных процессов. Поэтому предметом настоящего исследования был обмен биополимеров соединительной ткани в клинике после лапароскопических и лапаротомных холецистэктомии. Одной из практических задач данного исследования была оценка чувствительности показателей обмена соединительной ткани в зависимости от степени травмирования в условиях двух методов холецистэктомии.
Уровень суммарных ГАГ в крови и моче у больных до операции был выше, чем в контрольной группе, как у пациентов, прооперированных лапаротомным, так и лапароскопическим методом. Это говорит о том, что процесс воспаления, сопровождающийся изменениями в обмене ГАГ, наблюдался еще до хирургического вмешательства. ЛапаротомныЙ метод привел к большим сдвигам в показателях ГАГ, что отражает степень травмирования при проведении этой хирургической операции.
Динамика изменения суммарных ГАГ была одинаковой как при ЛХЭ, так и при ТХЭ, с максимумом повышения концентрации исследуемого показателя в крови и моче на 5-й день после операции. Отношение ГАГ крови к их уровню в моче практически не изменялось, что указывает на то, что изменение ГАГ в крови не связано с изменением их экскреции с мочой (у пациентов патологических нарушений функции почек не наблюдалось).
С учетом того, что до операции обе группы практически не отличались по показателям ГАГ в крови и моче, лапароскопический метод был менее травматичным по сравнению с традиционным. В первом случае, уровень ГАГ в крови к 12-му дню практически не отличался от уровня ГАГ в крови здоровых людей, тогда как при ТХЭ в эти же сроки уровень ГАГ оставался все еще высоким.
Анализ динамики фракций ГАГ показал, что изменение суммарных ГАГ происходило за счет изменения ГК, так как содержание СГАГ практически не изменялось в обоих случаях. Активность гиалуронидазы в крови у больных до операции была выше, чем у здоровых людей. Уровень ГА у больных, направленных на лапаротомию был значительно выше, чем у больных, которым осуществлялась лапароскопия. Выбор вида оперативного вмешательства определялся тяжестью заболевания. Как и в экспериментах на крысах, максимум активности этого фермента отмечался на следующий день после операции, и в последующем, его активность снижалась, приближаясь к значениям нормы при ЛХЭ к 12-му дню, и оставалась достаточно высокой при ТХЭ. Однако, если учитывать высокий уровень ГА у больных, прооперированных ТХЭ, до операции, то рост ГА и в том, и в другом случае можно считать одинаковым (таб. 3.20, рис. 3.6). уровня СГОП в 1,4 раза, ПСГОП - в 1,3 раза. Начиная с 5-го дня эти показатели снижались и к концу второй недели были ниже дооперационных. Степень изменения этих показателей у больных после ЛХЭ была менее 102 значительной: на следующий день после операции СГОП и ПСГОП возросли в 1,3 по сравнению с исходными значениями. Дальнейшие изменения этих показателей повторяло динамику у пациентов первой группы. Отношение ПСГОП/СГОП у здоровых людей и пациентов на различных сроках после операции представлено в рис. 4.7. Известно, что обмен компонентов межклеточного вещества и белков соединительной ткани является высоко динамичным процессом, составляющие которого -распад и синтез de novo. Поэтому данный показатель наиболее полно может отражать изменения, происходящие в обмене СТ. Динамика этого показателя такова, что после ТХЭ он снижается относительно значений в контрольной группе, и относительно его значений до операции. Снижение происходит уже на первый день и до 5-го дня остается ниже значений этого показателя до операции. Снижение отношения ПСГОП/СГОП указывает на превалирование скорости распада коллагена над процессом синтеза. В этом достаточно ярко проявляется катаболический эффект от травмы, нанесенной при хирургическом вмешательстве. К 7-му дню отношение ПСГОП/СГОП увеличивается, а к 12-му дню уже существенно превышает уровень контроля и значения данного показателя до операции. Это свидетельствует о том, что к 7-12-му дню в обмене превалирует синтетическая составляющая обмена СТ, характеризующая процесс заживления раны. Учитывая равные «условия» (одинаковые значения отношения ПСГОП/СГОП до операции) по этому показателю у больных, прооперированных как лапаротомным, так и лапароскопическим методами до операции, в условиях последнего метода практически не наблюдается катаболическая фаза обмена коллагена после хирургического вмешательства. Увеличение в крови как СГОП, так и ПСГОП, в том и другом случае указывает на усиление обмена (оборота) коллагена. Это хорошо согласуется с данными, полученными нами на экспериментальных животных. У крыс при нанесении непроникающей раны брюшной стенки практически отсутствует катаболическая фаза реакции и уже с первых часов после операции отмечается увеличение отношения ПСГОП/СГОП. Это, как уже отмечалось выше, хорошо согласуется с результатами исследования Renvall S. et al. [182].
Обнаруженное различие в значении ПСГОП/СГОП у групп исследуемых указывает на достаточно высокую чувствительность этого показателя от степени наносимой организму травмы при хирургических операциях. Необходимо отметить, что даже на 12-й день после операции в обоих случаях этот показатель остается выше контрольных значений. По-видимому, к этому времени процесс восстановления обмена СТ еще не завершен.
Похожие диссертации на Обмен гликозаминогликанов при резаных ранах брюшной стенки
