Введение к работе
Актуальность исследования. Регуляция иммунного ответа на пищевые белки является актуальной проблемой иммунофизиологии. Иммунный ответ на антигены пищи зависит от барьерной функции кишечника, которая является важнейшим механизмом, препятствующим проникновению в кровь макромолекул пищевых белков (Kraehenbuhl et al., 1997). В последние десятилетия получены данные, свидетельствующие о том, что небольшие количества белков проникают из просвета кишки в кровь в непереваренном виде путем эндоцитоза (Udall et al., 1981; Bendayan et al., 1990; Ziv, Banyana, 2000; Braneau et al., 2003; Cloutier et al., 2006; Cammisotto et al., 2007). Показано, что проникновение в кровь овальбумина (OVA) в высокомолекулярном виде в количестве, составляющем 0.001 - 0.01% от введенного белка, не препятствует развитию оральной толерантности к этому белку (Brace, Ferguson, 1986; Friedman, 1996). Известно, что повышение проникновения белковых антигенов в кровь стимулирует иммунный ответ на эти антигены. Так, адъювантное действие бактериальных токсинов обусловлено увеличением транспорта антигенов в кровь (Kosecka et al., 1994; Rappuoli et al., 1999), a аллергические реакции на сою связывают с повышением проникновения белков соевого боба в кровоток (Weangsripanavaly et al., 2005). Повышение проницаемости кишечной стенки наблюдается при различных патологических состояниях (Hollander et al., 1986; Benard et al., 1996; Kiliaan et al., 1998; Jlycc, 2003). При этом модулировать кишечную проницаемость могут медиаторы воспаления, выделяемые активированной тучной клеткой (гистамин, брадикинин) (Stein et al., 1998), цитокины (фактор некроза опухоли а - ФНО-а, у интерферон -ИФН-у, интерлейкины ір и 4 - ИЛ-ір и ИЛ-4) (Berin et al., 1999; Perdue 1999; Ma et al., 2004; Al-Sadi, Ma, 2007).
Однако в литературе отсутствуют данные об изменении проницаемости кишечной стенки и иммунного ответа на пищевые белки при их совместном поступлении с компонентами питания. Известно, что пектины, входящие в состав продуктов питания и широко применяемые в пищевой промышленности, присутствуют в пищевом рационе человека наряду с белками (Скальный и др., 2005) и обладают иммуномодулирующим действием (Sakurai et al., 1999; Inagaki et al., 2001; Kiyohara et al., 2002; Vos et al., 2007; Оводов и др., 2009). Способность пектинов модулировать активность тучных клеток (Sawabe et al., 1992; Kobayashi et al., 2004) и секрецию цитокинов иммунными клетками (Inngjerdingen et al., 20076; Guo et al., 2000), а также взаимодействовать со слизистой кишечника (Liu et al., 2005) определяет их возможность изменять проницаемость кишечной стенки для белковых антигенов. Однако до сих пор не изучена проницаемость стенки кишки и развитие иммунного ответа на белковый антиген, поступающий с пектинами. Не исследована секреция цитокинов, модулирующих кишечную проницаемость, у животных, получающих белок с пектиновыми полисахаридами. Слабо охарактеризовано действие пектинов на
протеолиз белков, между тем расщепление белка в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) влияет на его молекулярные характеристики и тем самым может изменить его способность проникать через кишечный барьер.
Выяснение механизмов действия пектинов на проницаемость кишечной стенки и иммунный ответ на белковые антигены важно для регулирования барьерной функции и иммунитета кишечника.
Цель исследования - изучить проницаемость кишечной стенки для OVA и иммунный ответ на белок, поступающий с пектиновыми полисахаридами.
Для достижения цели исследования поставлены следующие задачи:
-
Изучить проницаемость кишечной стенки для OVA, введенного перорально с пектиновыми полисахаридами.
-
Определить содержание цитокинов в слизистой тонкой кишки мышей после введения OVA с пектинами.
-
Изучить способность макрофагов секретировать цитокины у мышей, получивших OVA с пектинами.
-
Установить действие пектинов на протеолиз белка in vitro.
-
Исследовать развитие иммунного ответа на белковый антиген у мышей, получивших OVA с пектинами.
Научная новизна. Получены новые данные об
иммуностимулирующем действии пектиновых полисахаридов. Впервые установлено, что проницаемость стенки кишечника для белкового антигена изменяется при поступлении белка с пектинами. Выявлены пектиновые полисахариды как повышающие (лемнаны, цирсиуман и цитрусовый пектин), так и снижающие (бадан, комаруман, гераклеуман) проницаемость кишечной стенки для OVA. Установлено, что модулирование пектинами проникновения белка обусловлено их влиянием на секрецию цитокинов и протеолиз белковой макромолекулы. Впервые показано, что пектины, повышающие проникновение OVA в кровь, стимулируют иммунный ответ на белок и ингибируют оральную толерантность к OVA. Показано, что фрагменты разветвленной области макромолекулы лемнана и цирсиумана обладают иммуностимулирующим действием.
Научно-практическая значимость. Расширены представления о
модуляции проницаемости кишечной стенки и иммунного ответа на
пищевые белки, а также о связи между структурой и
иммуностимулирующей активностью пектинов. Получены
экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что иммуностимулирующее действие пектинов может быть обусловлено повышением проницаемости кишечной стенки для антигенов. Эти результаты могут быть использованы для быстрого тестирования растительных полисахаридов с целью выяснения их иммуностимулирующей активности. Способность пектинов повышать проникновение совместно вводимого с ними белка необходимо учитывать при составлении диет для пациентов, страдающих пищевыми аллергиями. Пектины, стимулирующие иммунный ответ на совместно вводимый с
содержание антиген-специфичных антител в сыворотке незначительно.
Трехкратная пероральная иммунизация OVA как с исходными пектинами
бодяка и ряски (цирсиуман СЕ и лемнан LM), так и с лемнаном LM-P и
цирсиуманом СЕ-Р, полученными в результате ферментативного
гидролиза, приводит к повышению титра анти-OVA-IgG в сыворотке
(табл. 4).
Таблица 4
Концентрация антиген-специфичных антител в крови мышей,
иммунизированных только OVA или OVA с пектинами
Примечание: * - р<0.05 по сравнению с OVA; п - количество животных в группе
Стимуляция иммунного ответа лемнаном LM-P и цирсиуманом СЕ-Р свидетельствует о том, что именно разветвленный участок пектиновой молекулы определяет иммуностимулирующее действие пектинов. Результаты, согласующиеся с нашими, были получены ранее японскими исследователями (Matsumoto, Yamada, 1995; Inngjerdingen et al., 2007a). Более того, установлено, что повышение содержания остатков галактуроновой кислоты в макромолекуле пектина приводит к снижению его иммуностимулирующей активности (Kiyohara et al., 2002).
ВЫВОДЫ
-
Овальбумин, введенный перорально, частично проникает в кровь, сохраняя свои антигенные свойства. Проницаемость кишечной стенки для овальбумина увеличивается при его совместном введении с цитрусовым пектином (PC), пектинами ряски (лемнанами LM, LMC) и бодяка (цирсиуманом СЕ).
-
Увеличение проницаемости кишечной стенки обусловлено повышением концентрации цитокинов (ФНО-а, ИЛ-ір, ИФН-у) в слизистой оболочке кишки, стимуляцией продукции цитокинов макрофагами, а также усилением протеолиза белка под действием пектинов.
-
Повышение концентрации иммуногенного овальбумина в крови, вызванное пектинами, приводит к активации у мышей иммунного ответа на белок: происходит усиление реакции ГЗТ и стимулирование образования антител.
-
Пектин бодяка, цирсиуман СЕ, препятствует развитию аллергической реакции, что обусловлено уменьшением продукции IgE.
-
Активной областью лемнана LM и цирсиумана СЕ является разветвленный фрагмент пектиновой макромолекулы.
сильная анафилактическая реакция (100% контрольных животных имеют высокие баллы: 3-4). Подобная интенсивность анафилаксии наблюдается у 75% сенсибилизированных мышей, перорально получивших OVA, тогда как степень анафилаксии в 2 раза ниже (38%), если животные получают OVA с цирсиуманом СЕ.
Показано, что содержание анти-OVA-IgE в сыворотке контрольных сенсибилизированных животных составляет 40 нг/мл спустя 10 дней после сенсибилизации и увеличивается после введения разрешающей дозы белка. Пероральная иммунизация OVA сенсибилизированных мышей стимулирует продукцию антител: концентрация анти-OVA-IgE выше контрольных значений через 10 дней после сенсибилизации, а после введения разрешающей дозы белка (через 15 дней) уровень IgE сравнивается с контрольными значениями. Введение OVA с цирсиуманом СЕ приводит к уменьшению концентрации анти-OVA-IgE как через 10, так и через 15 дней. Аналогичные результаты получены при определении содержания общего IgE в сыворотках животных (табл. 3).
Таблица 3 Содержание IgE в сыворотке крови у мышей, перорально иммунизированных
OVA или OVA с цирсиуманом СЕ
Примечание: *- р<0.05 по сравнению с контролем; **- р<0.05 по сравнению с мышами, иммунизированными OVA; п - количество животных в группе.
Показано, что цирсиуман ингибирует анафилаксию, снижая содержание IgE и IgGi, и, напротив, повышает продукцию ИФН-у и IgG2a-Подобный путь противоаллергического действия веществ уже был показан в ряде работ (Hasegawa et al., 1999; Shida et al., 2002; Saito et al., 2003; Marinaro et al., 1999). Судя по всему, цирсиуман может снижать аллергическую реакцию на белок на стадии сенсибилизации, ингибируя образование аллерген-специфичного иммуноглобулина IgE. Наиболее вероятной мишенью воздействия пектина бодяка является антиген-презентирующие клетки кишечника, секретирующие ИЛ-12 (макрофаги, дендритные клетки). В свою очередь, ИЛ-12 стимулирует продукцию ИФН-у Th-1 лимфоцитами, что приводит к ингибированию секреции IgE. Наши данные подтверждают ранее полученные результаты ингибирования аллергии веществами, сдвигающими иммунный ответ с Th-2 пути на Th-1 путь иммунного ответа.
Иммунный ответ на OVA у мышей, иммунизированных OVA или смесью OVA с лемнаном LM-P и цирсиуманом СЕ-Р. Показано, что у животных, перорально иммунизированных только OVA (контроль),
ними антиген, могут представлять интерес при создании пероральных вакцин.
Положения, выносимые на защиту:
-
Проницаемость кишечной стенки для белкового антигена изменяется при поступлении белка с пектиновыми полисахаридами.
-
Увеличение проникновения белка, вызванное пектинами, приводит к повышению иммунного ответа на антиген.
-
Модулирование пектинами проницаемости кишечной стенки для белка связано с изменением секреции цитокинов и протеолиза белковой макромолекулы.
Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н.Н.Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006), XIII Молодежной научной конференции Института биологии Коми НЦ УрО РАН «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2006), VI Молодежной научной конференции Института физиологии «Физиология человека и животных от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2007), 14-ом Европейском симпозиуме по углеводам "Eurocarb 14", (Любек, Германия, 2007), I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на севере» (Сыктывкар, 2008), V Всероссийской школе-конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008).
Публикации. По теме диссертационной работы в соавторстве опубликовано девять печатных работ (из них четыре опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 машинописных страницах, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и списка литературы (192 источника). Диссертация содержит 20 таблиц и 6 рисунков.
