Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Ионообменные свойства клеточной стенки 14
1.1.1 Количественная оценка катионообменной способности (КОС) корней растений
1.1.2 Ионообменная способность изолированных клеточных стенок
1.1.2.1 «Равновесный» подход к исследованию изолированной клеточной стенки
1.1.2.2 Измерение электрического потенциала клеточной стенки
1.1.3 Кажущееся свободное пространство 29
1.1.4 Взаимное влияние катионов и анионов в процессе поглощения ионов
1.1.5 Корневой апопласт - поглощение питательных веществ и ближний транспорт ионов
1.2 Состав растительной клеточной стенки 38
1.2.1 Полисахариды - 38
1.2.1.1 Целлюлоза 38
1.2.1.2 Связующие гликаны (гемицеллюлозы) 39
1.2.1.2.1 Ксилоглюканы 40
1.2.1.2.2 Глюкуроноарабиноксиланы 40
2.1.2.3 Глюканы со смешанной связью 41
1.2.1.3 Пектиновые вещества 42
1.2.1.3.1 Гомогалактоуронаны 43
1.2.1.3.2 Рамногалактоуронан-1 43
1.2.1.3.3 Замещенные галактуронаны 44
1.2.1.3.4 Макромолекулярная организация пектинов в клеточной стенке
1.2.2 Белки 49
1.2.2.1 Экстенсины 50
1.2.2.1.1 Межмолекулярные взаимодействия и функции экстенсинов
1.2.2.2 Арабиногалактановые белки 54
1.2.2.3 Пролин-обогащенные белки 56
1.2.2.4 Глицин-обогащенные белки 58
1.2.3 Фенольные соединения 60
1.2.3.1 Низкомолекулярные фенольные соединения 60
1.2.3.2 Лигнин 67
1.2.3.3 Суберин 68
ГЛАВА 2. Материалы и методы 72
2.1 Подготовка растительного материала к эксперименту 72
2.2 Выделение полимерного матрикса клеточных стенок 72
2.3 Микроскопическое исследование клеточных стенок 73
2.4 Определение качественного и количественного состава ионообменных групп полимерного матрикса клеточных стенок
2.4.1 Метод потенциометрического титрования 73
2.4.2 Определение содержания аминогрупп в полимерном матриксе клеточных стенок методом неводного титрования в уксусной кислоте
2.5 Определение ионообменной способности клеточных стенок при разной концентрации хлористого натрия в растворе
2.6 Определение фосфора в тканях и изолированных клеточных стенках
2.7 Определение содержания воды в интактных тканях растений и весового коэффициента набухания полимерного матрикса клеточных стенок в воде и растворах
2.8 Элементный анализ 84
2.8.1 Определение хлорид-иона 84
Результаты и обсуждение
ГЛАВА 3. Методический подход к количественной оценке ионообменных свойств клеточных стенок
3.1 Ионогенные группы клеточной стенки корней растений 88
3.2 Влияние состава раствора на ионообменные свойства клеточных стенок
3.3 Набухание полимерного матрикса клеточных стенок 108
3.4 Расчеты некоторых параметров ионного обмена с использованием разработанного подхода
ГЛАВА 4. Ионообменные свойства и набухание полимерного матрикса клеточных стенок из разных частей корней люпина
4.1 Ионообменные свойства 121
4.2 Набухание разных тканей корней люпина и изолированного из них полимерного матрикса клеточных стенок
Глава 5. Сравнительная оценка состава структурных полимеров в клеточных стенках растений
Глава 6. Ионообменная способность клеточных стенок в экстремальных условиях минерального питания (на примере засоления) 147
6.1 Ионообменные свойства клеточных стенок гликофитов из 148 семейства Fabaceae
6.2 Ионообменные свойства полимерного матрикса клеточных стенок 160 галофита и гликофита из семейства Chenopodiaceae
ГЛАВА 7. Диффузия катиона в клеточных стенках 182
7.1 Диффузия в клеточных стенках 185
7.2 Диффузия в корне 202
Заключение
- Ионообменная способность изолированных клеточных стенок
- Микроскопическое исследование клеточных стенок
- Влияние состава раствора на ионообменные свойства клеточных стенок
- Набухание разных тканей корней люпина и изолированного из них полимерного матрикса клеточных стенок
Введение к работе
Актуальность проблемы Клеточная стенка корня, являющаяся частью апопласта - слож-ноорганизованная и многофункциональная система Этот экстраклеточный компартмент первым контактирует с наружным раствором и модифицирует его состав за счет реакций обмена между ионогенными группами полимерного матрикса и ионами среды, тем самым регулируя поступление веществ в корни растений Эффективность такой модификации определяется физико-химическими свойствами стенки, которые находятся под контролем клетки- клеточные стенки являются не только чрезвычайно сложными, но и динамичными системами, состав и организация которых могут изменяться в процессе онтогенеза и под действием внешних факторов (Лозовая, 1987, Carpita and Gibeaut, 1993, Горшкова, 1997, Шарова, 2004)
Принято считать, что структура и ионообменные свойства клеточных стенок и апопласта корня в целом имеют важное физиологическое значение, так как именно они определяют ионный состав среды, которая омывает клеточную мембрану, контролируют внеклеточный транспорт растворенных веществ, влияют на механические и осмотические явления в процессе роста клеток (Haynes, 1980, Gngnon and Sentenac, 1991) На важную роль физико-химических свойств клеточной стенки, от которых зависят первичные процессы поглощения минеральных элементов, впервые обратили серьезное внимание отечественные исследователи (Колосов ИИ , 1939, 1940, Сабинин Д А, 1955) В последующем их анализ предпринимался неоднократно (Gngnon and Sentenac, 1991, Sattelmacher, 2001), однако долгие годы исследования носили эпизодический характер В качестве главной количественной характеристики способности стенок к адсорбции использовали, как правило, катионообмен-ную способность корней (Кузнецова, 1972, Gngnon and Sentenac, 1991, Marshner, 1995), которая, как считается, обусловлена присутствием в полимерном матриксе карбоксильных групп остатков уроновых кислот в составе пектинов (Morvan et al, 1979, Richter and Dainty 1989, Gngnon and Sentenac, 1991) Однако, данные биохимических исследований состава клеточных стенок противоречат таким упрощенным представлениям и указывают на наличие в них других группировок, участвующих в ионном обмене (Richter and Dainty, 1989), а количественная оценка ионообменных свойств клеточных стенок с использованием ранее предложенных подходов не вскрывает и не отражает реальной сложности процессов, обеспечивающих первичные этапы поглощения минеральных элементов корнями растений
Одним из подходов к исследованию процессов в клеточной стенке может быть рассмотрение ее с позиций химии полимеров В анализе полимерного ионообменного материала важную роль играют параметры, которые характеризуют происходящие в нем процессы диффузии и набухания Они позволяют описать такие важные свойства, как проницаемость и скорость транспортирования ионов в полимере Кроме того, коэффициенты набухания и диффузии являются функцией степени поперечной сшивки полимерных цепей, общего числа ионогенных групп ионита, степени их диссоциации, концентрации внешнего раствора, и зависят от радиуса гидратированного иона, которым заполняется сорбент (Гельферих, 1962, Шатаева и др , 1979) О процессах диффузии ионов в апопласте и набухании полимерного матрикса клеточных оболочек известно мало (Canny, 1995), однако, можно полагать, что
2 экспериментальная оценка набухания и диффузии даст возможность оценить различия в структуре биохимически пластичного полимерного матрикса у растений разных видов, а также определить степень его участия в водном режиме при нормальных и экстремальных условиях минерального питания
Таким образом, оценка физико-химических характеристик экстраклеточного компар-тмента корня с использованием методов химии полимеров может быть важным направлением исследования, которое позволит выявить существенные механизмы, контролирующие поглощающую способность корней как в нормальных, так и экстремальных условиях минерального питания, получить информацию о том, как модифицируются свойства апопласта в разных условиях питания и водного режима растений
Цель работы. Выявление основных закономерностей ионообменных и диффузионных процессов в апопласте корней растений разных систематических групп и определение функциональной роли ионообменного механизма в минеральном питании и водном режиме растений в нормальных и экстремальных условиях роста
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи
-
Разработать методологию количественной оценки ионообменных свойств клеточных стенок и диффузии ионов в них
-
Провести сравнительный анализ физико-химических параметров, характеризующих состав ионогенных групп, способность к набуханию клеточных стенок и диффузионные свойства апопласта в корнях растений разных видов
-
Установить вклад ионообменного механизма и набухания в поглощение минеральных элементов корнями растений при изменении параметров внешней среды
-
Определить влияние физиологического состояния, возраста и вида растений, состава среды выращивания на ионообменные свойства клеточных стенок
Основное положение, выносимое на защиту:
Концепция зависимости физиологических функций поглощения и транспорта минеральных элементов и воды растениями от физико-химических свойств полимерного матрикса их клеточных стенок
Научная новизна работы. Разработана методология количественной оценки ионообменных и диффузионных свойств клеточных стенок корней растений На этой основе проведено комплексное сравнительно-физиологическое исследование связи физико-химических свойств клеточных стенок и процессов организации ионных и водных потоков в апопласте, разработаны теоретические представления для их количественного описания Впервые установлено, что в составе полимерного матрикса клеточных стенок всех исследованных растений содержатся четыре типа ионообменных групп, три из которых являются катионооб-менными (карбоксильные группы полигалактуроновой и гидроксикоричных кислот, фе-нольные ОН-группы), и одна - анионообменной (аминогруппы) Впервые показано, что ионообменные свойства клеточной стенки зависят от вида, возраста, физиологического состояния растений, а также условий произрастания и определяются количественными соотношениями типов ионогенных групп полимерного матрикса экстраклеточного пространства
Впервые экспериментально доказано, что апопласт корня - это компартмент, в котором происходит концентрирование катионов минерального питания на первичном этапе поглощения ионов из внешней среды, а степень их накопления зависит от вида растения, условий произрастания и ионных условий в экстраклеточном пространстве
Впервые установлено, что объем полимерного матрикса клеточных стенок, который связан с их гидравлической проводимостью, зависит от ионных условий и рН в окружающей среде и в экстраклеточном пространстве Показано, что изменение в набухании, которое определяется физико-химическими свойствами клеточной стенки в ответ на варьирование внешних ити внутренних условий, представляет собой элемент механизма регулирования потока воды по корню
Впервые проведено сравнительное исследование диффузии катиона в апопласте корней и показано, что механизм его поглощения в значительной мере обусловлен ионообменными реакциями между катионом и карбоксильными группами клеточных стенок, а скорость процесса поглощения в целом определяется диффузией катиона в полимерном матриксе Впервые выявлены различия в проницаемости полимерного матрикса корней растений различных видов
Впервые проведено сравнительное исследование ионообменных свойств клеточных стенок, изолированных из корней галофитов и гликофитов и показано, что ионообменные процессы являются частью механизма устойчивости растений к экстремальным условиям питания
Таким образом, в работе обоснована концепция зависимости физиологических функций поглощения и транспорта минеральных элементов и воды растениями от физико-химических свойств полимерного матрикса их клеточных стенок
Практическая значимость работы Разработаны новые подходы к количественной оценке физико-химических параметров клеточных стенок, которые позволили провести сравнительный анализ ионообменных свойств и состава их структурных полимеров Полученные в работе физико-химические параметры (количество ионогенных групп каждого типа и константы их диссоциации, общее количество катионо- и анионообменных групп, коэффициенты набухания и диффузии) являются основой для предсказаний изменений ионного состава в водном пространстве матрикса на начальном этапе поглощения элементов питания Впервые установлено, что одной из ответных реакций на экстремальные условия питания является изменение физико-химических свойств и состава матрикса клеточных стенок
Полученные в работе данные расширяют фундаментальные знания о механизмах ионообменной адсорбции и диффузии катионов в клеточных стенках и показывают их роль на первичных этапах поглощения ионов, в устойчивости растений к неблагоприятным факторам окружающей среды и могут быть использованы в исследовательской практике и включены в курсы лекций по минеральному питанию и стресс-устойчивости растений Апробация работы Результаты исследования были представлены на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, посвященный (Санкт-Петербург, 1998), Международной конференция «The supporting roots Structure and function» (Бордо, Франция, 1998), IV съезде общества физиологии растений России (Москва, 1999), II Международной науч-
4 ной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск , 2001),
на 13-ом конгрессе FESPP (Греция, 2002), V съезде общества физиологов растений и международной конференции «Физиология растений-основа биотехнологии» (Пенза, 2003), IV-ой Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2005), XV International Plant Nutrition Colloquium «Plant nutrition for food security, human health and environmental protection» (Beijing, 2005), 13th Multi-disciplinary Iranian Researchers Conference in Europe (Leeds ,2005), XlXth International Congress on Sexual Plant Reproduction (Budapest Hungary, 2006), International scientific conference «Genetic and Physiological Fundamentals of Plant Growth and Productivity» (Vilnius, 2006) Публикации По теме диссертации опубликовано 58 работ (общее число публикаций автора - 114, из них 17 авторских свидетельств на способы синтеза ионообменных материалов) в отечественных ("Физиология растений", "Биохимия", "Физическая химия" и др) и зарубежных (Plant and Soil, Biology а) научных журналах, материалах конференций и научных сборниках
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 251 стр машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 297 наименований (из них 257 на иностранных языках) Работа содержит 24 табчицы и иллюстрирована 44 рисунками
Ионообменная способность изолированных клеточных стенок
Во всех цитируемых ниже работах выделение клеточной стенки из разных частей растений проводили путем последовательной обработки тканей 0,5-1% раствором тритона Х-100, метанолом и затем дистиллированной водой. В некоторых случаях предварительно проводили плазмолиз в 0,4 М манитоле с добавлением 25 мМ Трис-HCl (рН 7), а затем ткани разрушали дроблением в 0,4М сахарозе, 10 мМ MES, 25 мМ Трис-HCl. Полученную суспензию центрифугировали, гомогенизировали в 100 мМ КС1, 10 мМ MES, 5 мМ Трис-HCl и промывали растворами и дистиллированной водой.
Для клеточной стенки, изолированной из Sphagnum russowii, было установлено, что ее общая катионообменная способность определяется присутствием в полимерном матриксе двух типов групп, одна из которых характеризуется значением рК от 2 до 4, а другая - 5. (Richter and Dainty, 1989а). Химический анализ клеточной стенки S. russowii позволил авторам заключить, что группы с низким значением рК относятся к уроновым кислотам и их содержание достигает 1071 мэкв на 1 г сухой массы клеточных стенок, а группы с высоким значением рК в количестве 545 мэкв на 1 г сухой массы клеточных стенок могут принадлежать аминокислотам и фенольным кислотам полимерного матрикса.
Методом потенциомерического титрования определено, что клеточная стенка S. russowii характеризуется и анионообменной способностью, но значение этого параметра не превышает 60-66 мэкв на 1 г сухой массы (Richter and Dainty, 1989b). Привлечение к исследованию клеточной стенки S. russowii нейтронно-активационного анализа в сочетании с методами математического моделирования позволило канадским ученым оценить размер Доннановского свободного пространства ( 1,77 мл/г), водного свободного пространства (2,63 и 1,65 мл/г в присутствии калия и кальция соответственно) и концентрацию фиксированных анионов в нем ( 1,1 М).
Используя потенциометрическое титрование в присутствии катионов разной валентности и модель ионной конденсации Маннинга в сочетании с моделью Доннана, Ричер и Денти оценили селективность катионного связывания в клеточной стенке S. russowii (Richter and Dainty, 1990 a,b). Авторы показали, что при эквимолярной концентрации катионов и полной ионизации функциональных групп полимерного матрикса селективность + 2+ + 3+ 2+ 3+ изменялась в ряду Na - Са Na - La Са - La в соответствии с предсказаниями выбранной для описания модели. Кроме того, было установлено, что коэффициент селективности для Са в два раза выше, чем 2+ для Mg , в то время как для одновалентных катионов значения этого параметра были приблизительно равные.
Катионообменные свойства клеточных стенок, выделенных из листьев капусты, были исследованы в связи с селективностью стенки по отношению к протонам и катионам калия, кальция и магния (Bush and McColl; 1987). Для расчетов авторы использовали закон действующих масс, который позволил им определить коэффициенты селективности одного иона по отношению к другому. Было показано, что в клеточной стенке состав катионов зависит от их концентрации в среде, а селективность к катионам увеличивается с возрастанием их доли во внешнем растворе. Установлено, что при рН=6,5 ионообменная способность изолированной клеточной стенки В. oleracea по ионам кальция составляет 860 мэкв на 1 г сухой массы стенки, а ее + селективность по катионам минерального питания изменяется в ряду: Н
»(К+ Са2+) Mg2+.
Для описания равновесной концентрации ионов в клеточных стенках корней конских бобов Vicia faba L. и желтого люпина Lupinus luteus L. французские ученые Сэнтэнак и Гриньон предложили модель, в основе которой лежат два явления: электростатическое взаимодействие и специфичное ионное связывание (Sentenac and Grignon, 1981). Авторы показали, что модель адекватно описывает равновесные эксперименты и высказали предположение о возникновении в водном пространстве клеточных стенок локальных градиентов рН и концентраций ионов, которые влияют на транспортные функции плазматической мембраны. Определено, что у V.faba ионообменная способность составила 1000, а у L. luteus - 670 мкмоль на 1 г сухой массы клеточной стенки корней. Было также показано, что при рН 5 в препаратах клеточной стенки люпина, которые приводили в равновесие с 1 мМ водным раствором КС1, только 50% карбоксильных групп уроновых кислот принимают участие в обменных реакциях (Sentenac and Grignon, 1981).
Демарти с сотр. исследовали ионообменные свойства клеточной стенки, изолированной из растений Lemna minor L. (Demarty et al., 1978, 1979). Авторы определили ионообменную способность клеточной стенки этого растения при рН 7, которая составляла 440 мкмоль на 1 г сухой массы клеточной стенки, и рациональные коэффициенты селективности Ыме+) карбоксильных групп пектинов при обмене двухвалентных катионов на моновалентные (Са - К (лҐ); Са - Na ( )). Указанные коэффициенты отражают суммарно взаимодействия между ионами в растворе, между противоионами и ионизированными карбоксильными группами стенки, а также влияние гидратации. Если Д =1, то 1 2 ионообменный материал не проявляет селективности ни к Me , ни к Me , и ионы обоих типов адсорбируются с равной вероятностью. Было показано, что R f и R% изменяются при варьировании экспериментальных условий, что, по мнению авторов, свидетельствовало о чисто физико-химическом механизме регуляции ионного обмена в клеточных стенках L. minor. Максимальный коэффициент селективности карбоксильных групп к ионам кальция наблюдался при мольной доле кальция в растворе (ХСа) +2 + около 0,3 и достигал значения 100 при обмене Са на К (концентрации +2 + калия в растворе 8,5 мМ) и 60 при обмене Са на Na (концентрации натрия в растворе 7,5 мМ). Значение 2 зависело также от ионной силы раствора, увеличение которой приводило к снижению этого показателя. Так, например, при ХСа = 0,2 величина Д Г уменьшалась от 64 до 29 при увеличении концентрации ионов натрия в растворе от 7,5 до 17 мМ. Авторы отмечают, что такое же поведение было установлено для синтетических ионитов и корней растений и называется «эффектом разбавления» (Гельферих, 1962; Demarty et al., 1978,1979).
Микроскопическое исследование клеточных стенок
Проведенные исследования химический структуры суберина позволили канадскому ученому Бернарду предложить новую модель строения этого полимера, в соответствии с которой полифенольный домен погружен в первичную клеточную стенку и ковалентно связан глицериновыми мостиками с алифатическим полимерным доменом, расположенным между первичной клеточной стенкой и плазматической мембраной (Bernards, 2002).
Таким образом, суберинизированные ткани характеризуются специализированной модификацией клеточной стенки. Суберин включает в себя полиалифатический и полифенольный домены. С одной стороны эти два домена пространственно разделены, а с другой - соединены между собой ковалентными связями, образуя макромолекулу суберина. Изложенные выше данные свидетельствуют, что химический состав суберина имеет свои характерные особенности и значительно отличается от состава лигнина и кутина.
Важная физиологическая роль суберина заключается в том, что он снижает водную проницаемость клеточных стенок и тем самым уменьшает потери воды клеткой при необходимых условиях. Так, было показано, что опробковение тканей связано с отложениями значительных количеств восков, удаление которых приводит к увеличению водной проницаемости тканей (Vogt et al., 1983; Gil et al., 2000). Суберинизированные клетки экзо- и эндодермиса (пояски Каспари) обеспечивают апопластный барьер для транспорта растворенных веществ, тем самым блокируя поступление избыточного количества ионов в центральный цилиндр при действии неблагоприятных факторов внешней среды, как например, при солевом стрессе (Peterson et al., 1993, 1999; Steudle and Peterson, 1998). При поранении отложения суберина в клеточной стенке защищают клетку от поражения микроорганизмами. Так, было показано, что суберинизированные экзодермальные клетки блокировали инфицирование корней кукурузы и спаржи Fusarium culmorum hypae (Kamula et al., 1995). Таким образом анализ состава клеточных стенок показывает, что они являются гетерогенной средой, которая характеризуется разнообразием химических связей и макроструктур. Поведение такой среды как ионообменника представляется весьма сложным и зависящим от многих факторов. Нетривиальность ее поведения должна учитываться при описании физиологических процессов, связанных с поглощением и ионов и их транспортом.
Анализ данных литературы показывает, что в настоящее время основным аспектом исследований растительной клеточной стенки является химический состав компонентов, входящих в структуру этого компартмента. Методами химического анализа установлено, что в составе различных полимерных компонентов клеточной стенки могут находиться несколько типов ионогенных групп (амидные, карбоксильные, фенольные, фосфорсодержащие), которые в определенных условиях участвуют в процессах ионного обмена. Однако проведенные до настоящей работы измерения ионных и электрических свойств свидетельствуют, что только карбоксильные группы уроновых кислот в составе пектинов, с величиной рК, близкой к 3, участвуют в реакциях ионного обмена (Morvan et al., 1979; Richter and Dainty 1989; Grignon and Sentenac, 1991).
Из физической химии ионного обмена известно, что параметры процессов диффузии и набухания являются другой физико-химической характеристикой полимерного ионообменного материала, которые позволяют описать такие важные его свойства, как проницаемость, скорость транспортирования ионов в ионите (Гельферих, 1962). Кроме того, коэффициент набухания полимера и коэффициент диффузии в нем являются функцией степени поперечной связанности (сшивки) полимерных цепей, общего числа ионогенных групп ионита, степени их диссоциации, концентрации внешнего раствора и зависят от радиуса гидратированного иона, которым заполняется сорбент (Гельферих, 1962; Шатаева и др., 1979). Однако о процессах диффузии ионов в апопласте и набухания полимерного матрикса клеточных оболочек практически ничего не известно (Canny, 1995). Более того, способность клеточной стенки удерживать воду, которая количественно характеризуется коэффициентом набухания, не определяли и не принимали во внимание.
В связи с изложенным, можно полагать, что экспериментальная оценка набухания и диффузии даст возможность оценить различия в структуре биохимически пластичного полимерного матрикса у растений разных видов, а также определить степень его участия в водном режиме растений при нормальных и экстремальных условиях минерального питания.
До начала настоящей работы отсутствовали подходы к количественному исследованию физико-химических свойств клеточных стенок, которые могли бы дать адекватную информацию о том, как модифицируются свойства апопласта в разных условиях питания, какова роль физико-химических свойств этого компартмента в минеральном питании и водном обмене растений. Можно полагать, что оценка физико-химических характеристик экстраклеточного компартмента корня с использованием методов химии полимеров может быть важным направлением исследования, которое позволит выявить существенные механизмы, контролирующие поглощающую способность корней как в нормальных, так и экстремальных условиях минерального питания, получить информацию о том, как модифицируются свойства апопласта в разных условиях питания и водного режима растений.
Влияние состава раствора на ионообменные свойства клеточных стенок
Для галактуроновои кислоты рКа = 3,42 (Richter and Dainty, 1989). Однако рКа низкомолекулярных и полимерных кислот значительно различаются. Для иллюстрации приведем следующий ряд изменения рКа при переходе от низкомолекулярных соединений к трехмерным полимерным структурам: акриловая кислота - 4,26 (Альберт и Сержент, 1964), полиакриловая кислота - 4,8 (Шатаева и др., 1979), ее трехмерный аналог - 5 т 7,5 (Шатаева и др., 1979) в зависимости от типа и количества сшивающего агента. Таким образом, можно с большой вероятностью предполагать, что в трехмерной структуре апопласта функциональные группы с рК 5, установленные нами, являются группами галактуроновои кислоты. Значение константы ионизации для этих групп, определенное ранее методом потенциометрического титрования (рКа= 3,2 - 3,4; Morvan et al.,1979; Richter and Dainty, 1989), значительно отличается от величины, полученной в настоящей работе. Это обусловлено тем, что при анализе экспериментальных кривых и расчетах авторы не учитывали наличие других типов ионогенных групп, и, следовательно, некорректно определяли границы области рН, в которой происходила последовательная диссоциация групп галактуроновои кислоты.
Установленные в структуре клеточной стенки ионогенные группы с рКа 7-7,5 могут принадлежать как кислотным (фосфор - или карбоксилсодержащим) (Шатаева и др., 1979), так и основным (имидазольным или а-аминогруппами) (Альберт и Сержент, 1964) группам. Если соединение содержит в своей структуре и кислотные, и основные группы, то оно является или амфолитом, или цвиттерионом. Общее свойство и тех, и других заключается в том, что в сильно кислых растворах они существуют целиком в виде катиона (максимальное поглощение анионов), а в сильно щелочных - в виде аниона (максимальное поглощение катионов). В связи с изложенным и на основании проведенного нами исследования можно считать, что 40, 190, 440 и 125 микромолей на 1 г сухой массы клеточных стенок (разность между AS и AS , табл. 3.1) у этиолированных проростков и зеленых растений пшеницы, проростков люпина и растений гороха, соответственно, однозначно являются катионообменными. Известно также, что последние с указанным значением рКа могут быть или карбоксильными, или фосфоновокислотными (Шатаева, 1979). Однако проведенный нами анализ образцов клеточной стенки всех вариантов на содержание фосфора по Лоури показал, что исследуемые материалы содержат фосфора менее 0,06% (22,0 мкмоль/г). Отсюда следует, что группы с рК 7-7,5 являются в основном карбоксильными.
Анализ данных литературы о структуре клеточных стенок (Haynes, 1980; Richter and Dainty, 1989; Gassab 1998; Sattelmacher 2001; Carpita and McCann, 2000; Bernards, 2002; Fry, 2004; Bunzel 2005), о константах ионизации карбоксильных групп в составе низко- и высокомолекулярных соединений позволил заключить, что установленные нами группы с рК 7 являются остатками гидроксикоричных кислот. Известно, что константа ионизации карбоксильной группы коричной кислоты, которая с некоторыми допущениями может служить низкомолекулярным аналогом гидроксикоричных кислот, равна 4,44 (Альберт и Сержент, 1964). Однако, как показано выше на примере акриловой, полиакриловой кислот и трехмерного аналога последней, значения рКа низкомолекулярных и полимерных кислот значительно различаются. Поэтому можно с большой вероятностью предполагать, что в трехмерной структуре клеточных стенок катионообменные группы с рК 7 являются карбоксильными группами гидроксикоричных кислот.
Рассчитанные значения физико-химических параметров, характеризующих ионообменный процесс, показывают, что клеточные стенки корней проростков и растений по качественному составу функциональных групп не различаются, о чем свидетельствуют значения констант ионизации рКа (табл. 3.1). Наиболее ярко стенки исследуемых растений отличаются между собой по количеству карбоксильных групп полигалактуроновой кислоты (ПГК). У этиолированных проростков пшеницы количество этих групп в 2 раза меньше по сравнению со взрослыми растениями, а у бобовых растений - в 2-3 раза выше, чем у пшеницы. Результаты о различиях в количестве карбоксильных групп ПГК у Fabaceae и Роасеае согласуются с данными других авторов о катионообменной способности корней (Drake et al., 1951; Crooke et al., 1960; Heintze, 1961; Knight et al., 1961; Haynes, 1980; Grignon and Sentenac, 1991; Sattelmacher, 2001). Авторы показали, что катионообменная способность корней двудольных растений почти в 2 раза выше по сравнению с однодольными. Кроме того, было определено, что катионообменая способность корней основных сельскохозяйственных культур лежит в пределах 100-600 мкмоль на 1 г сухой массы корней, что также согласуется с результатами нашей работы. Следует подчеркнуть, что основное отличие настоящего исследования от известных ранее состоит в том, что предлагаемый в работе подход к оценке ионообменных свойств впервые позволил адекватно сравнивать структуру клеточных стенок и их потенциальных адсорбционных возможностей в зависимости от вида и физиологического состояния корней растений разных видов.
Набухание разных тканей корней люпина и изолированного из них полимерного матрикса клеточных стенок
При определенных условиях окружающей среды апопластный путь передвижения воды и ионов в корнях растений является превалирующим и поэтому детерминируется главным образом свойствами клеточной стенки (Steudle and Peterson, 1998). В самом корне ионы и вода движутся как в радиальном направлении, так и вдоль его оси. В этих же направлениях изменяется структура клеток и тканей, в том числе структура и химический состав клеточных стенок (Luttge, 1983). В этой связи можно предположить, что и ионообменные свойства клеточных стенок варьируют как по оси, так и в радиальном направлении корня. Однако экспериментальных данных, подтверждающих или опровергающих последнее положение, до начала настоящей работы получено не было.
Мы применили разработанный в работе подход к исследованию состава ионогенных групп в полимерном матриксе клеточных стенок и их набухающей способности для описания на количественном уровне изменений в ионообменных свойствах клеточных стенок различных анатомических структур корней люпина.
В этих опытах семена Lupinus albus L. (сорт Немчиновский белый ) замачивали 3 ч в водопроводной воде при комнатной температуре и проращивали в термостате при 27 в темноте. Опыты проводили на корнях 7-дневных проростков (вариант I), выросших на водопроводной воде, и 14-дневных растениий (вариант II), росших с 7-дневного возраста на полном растворе Кнопа. В обоих вариантах температура 20-22, освещенность ПО мкМ/с на 1 м2, 14-часовой день, аэрация растворов в течение 8 ч в день. Таким образом, в опытах изменялся возраст растений и ионная сила питательных растворов.
В варианте I средняя длина корня составила 8 ± 1,6 см, в варианте II -14 ± 2,1 см. Целые корни отсекали и делили на фрагменты следующим образом: кончик корня - 0-1,5 см, зона боковых корней вместе с боковыми корнями - 1,5-6 см у варианта I и 1,5-12 см в варианте II, базальная часть - 6-8 и 12-14 см в варианте I и II соответственно. У варианта I число боковых корней было 4 -7 штук и их длина составляла 1-5 мм, а у варианта II - 10-15 штук длиной 1-Ю мм. Фрагменты базальной части корня длиной 1-2 см в варианте I и II в свою очередь разделяли на ткани коры и центрального цилиндра. Ионообменную способность клеточных стенок определяли в соответствии с описанным методом.
Ионообменные свойства
Полученные данные (рис. 4.1) свидетельствуют, что у проростков люпина общее количество анионообменных групп (S) в расчете на 1 г сухой массы изолированных клеточных стенок остается неизменным как по длине, так и в радиальном направлении корня, а общее количество катионообменных групп (SQT) варьирует в зависимости от типа тканей. Во всех образцах значительно больше (в 30-50 раз), чем S. Изменения в S по длине корня составляют не более 10% (базальная часть корня и участок боковых корней), тогда как в радиальном направлении достигают 50%.
Результаты указывают на то, что в полимерной структуре клеточных стенок из разных анатомических зон корня люпина существуют четыре типа ионогенных групп: аминогруппы с рКа 3, карбоксильные группы полигалактуроновой кислоты с рКа 5, карбоксильные группы 3 4 гидроксикоричных кислот с рКа 7,3 и фенольные ОН-группы с рКа 10. Указанные величины констант хорошо согласуются с изложенными выше результатами потенциометрического титрования клеточных стенок целого корня различных растений (табл. 3.1). качественному составу функциональных групп, о чем свидетельствуют близкие по значению pKaJ (табл. 4.1, 4.2), а отличие состоит в количестве ионогенных групп каждого типа. Данные свидетельствуют, что по длине и в радиальном направлении корня изменяется количество групп полигалактуроновой кислоты (AS , рис. 4.2, 4.3). Величина AS резко увеличивается к зоне боковых корней и уменьшается к базальной части корня (рис. 4.2). В кончике корня этот параметр в 2-5 раз меньше, чем в других зонах. В тканях центрального цилиндра содержание групп полигалактуроновой кислоты в 10 и 2 раза меньше, чем в стенках коры у 7-дневных проростков и 14-дневных растений соответственно (рис. 4.3 а и б). Полученные результаты могут быть сопоставлены с функциональными особенностями разных типов тканей корня. Если основной функцией клеточной стенки эпидермиса и коры являются первичное поглощение и концентрирование катионов внешней среды, то для клеточной стенки центрального цилиндра - их проведение к наземной части растения. Принято считать, что сосуды проводящих элементов, обеспечивающие дальний транспорт воды и ионов по ксилеме и относящиеся к апопласту, служат для переноса массового транспирационного тока. Результаты нашего исследования указывают на то, что при таком движении состав восходящего тока может претерпевать изменения за счет взаимодействия катионов раствора и ионогенных групп клеточных стенок сосудов, т.е. определяется только физико-химическими свойствами. Эти изменения могут происходить, например, при увеличении или уменьшении рН, концентрации ионов в ксилемном соке, за которыми последует соответственно уменьшение или увеличение концентрации катионов в растворе, поступающем к надземной части растения.
