Ионообменная способность клеточных стенок из разных органов растений в условиях засоления : на примере представителей сем.Fabaceae Джалалихонарманд Саид

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 8

1 Растительная клеточная стенка 8

1.1 Состав клеточной стенки 9

1.2 Структурная организация клеточной стенки 21

1.3 Некоторые особенности строения первичных клеточных стенок растений из семейства Fabaceae 23

1.4 Свойства клеточной стенки 27

1.4.1 Катионообменная способность 27

1.4.2 Кажущееся свободное пространство 29

1.4.3 Взаимное влияние катионов и анионов в процессе поглощения ионов

1.4.4 Корневой апопласт - поглощение питательных веществ и ближний транспорт ионов

2 Рост растений в условиях засоления 37

2.1 Повреждающее действие солей 37

2.2 Причины снижения роста растений при солевом стрессе 41

2.3 Роль натрия и хлорида в минеральном питании растений 46

2.4 Влияние засоления на рост растений из семейства Fabaceae 51

Экспериментальная часть

Глава 2. Материалы и методы 56

2.1 Подготовка растительного материала к эксперименту 56

2.2 Проращивание семян разных сортов нута 56

2.3 Выделение полимерного матрикса клеточных стенок 57

2.4 Микроскопическое исследование клеточных стенок 57

2.5 Определение качественного и количественного состава ионообменных групп полимерного матрикса клеточных стенок

2.5.1 Метод потенциометрического титрования 59

2.5.2 Определение содержания аминогрупп в полимерном матриксе клеточных стенок методом неводного титрования в уксусной кислоте

2.6 Определение ионообменной способности клеточных стенок при разной концентрации хлористого натрия в растворе

2.7 Определение содержания воды в интактных тканях растений и весового коэффициента набухания полимерного матрикса клеточных стенок в воде и растворах

2.8 Определение эндогенного содержания ионов в тканях растений

2.8.1 Определение хлорид-иона 62

Глава 3. Результаты и обсуждение 64

3.1 Оценка солеустойчивости растений из семейства Fabaceae 64

3.1.1 Влияние засоления на прорастание семян разных сортов нута

3.1.2 Накопление биомассы растениями в зависимости от концентрации NaCl в среде

3.2 Эндогенное содержание ионов в органах растений нута сорта ILC482 и Bivanij в зависимости от концентрации NaCI в среде

3.3 Оводненность тканей нута и вики 75

3.4 Количественный и качественный состав ионогенных групп полимерного матрикса клеточных стенок нута и вики

3.4.1 Ионообменная способность полимерного матрикса нута (сорт Bivanij)

3.4.2 Зависимость ионообменной способности полимерного матрикса клеточных стенок нута

(Bivanij) от ионной силы внешнего раствора

3.4.3 Ионообменная способность полимерного матрикса клеточных стенок нута сорт ILC 482

3.4.4 Влияние ионной силы внешнего раствора на ионообменную способность полимерного матрикса клеточных стенок нута ILC 482

3.4.5 Ионообменная способность полимерного матрикса клеточных стенок вики (V. narbonesis)

3.4.6 Влияние ионной силы внешнего раствора на ионообменную способность полимерного матрикса клеточных стенок вики

3.5 Набухание клеточных стенок в воде 113

3.5.1 Набухание в воде полимерного матрикса клеточных стенок нута и вики

3.5.2 Влияние рН и ионной силы внешнего раствора на набухание полимерного матрикса клеточных стенок растений вики и нута

3.6 Сравнительный анализ состава ионогенных групп в полимерном матриксе клеточных стенок растений из семейства Fabaceae

3.7 Сравнительный анализ набухания полимерного матрикса клеточных стенок растений из семейства Fabaceae

3.8 Поведение клеточных стенок растений семейства Fabaceae при разных уровнях засоления среды

Заключение 137

Выводы 140

Список цитируемой литературы

• Структурная организация клеточной стенки
• Проращивание семян разных сортов нута
• Накопление биомассы растениями в зависимости от концентрации NaCl в среде
• Влияние ионной силы внешнего раствора на ионообменную способность полимерного матрикса клеточных стенок вики

Введение к работе

Актуальность проблемы. На процессы роста и развития растений значительное влияние оказывают экологические факторы, составляющие среду обитания организма. Одним из распространенных по площади и неблагоприятному воздействию на рост и продуктивность растений абиотических стрессоров является засоление почв. Засоленные почвы широко распространены во многих странах мира, занимая около 20% посевных площадей и почти половину орошаемых территорий (Munns, 2002). Выяснение механизмов адаптации растительных организмов, позволяющих им выживать в условиях засоления среды, является важным направлением физиологии устойчивости растений.

Избыточное содержание ионов натрия и хлорида в почве оказывают гиперосмотическое и токсическое влияние на рост растения, снижая продуктивность сельскохозяйственных культур. Поддержание роста в этих условиях связано как с регуляцией водного и осмотического гомеостаза, так и с изменением свойств клеточных стенок растений (Cosgrove and Li, 1993).

На фоне значительного прогресса в изучении состава и свойств составляющих клеточную стенку полисахаридов, структурных белков и ферментов существует мало работ, посвященных влиянию различных стрессоров, в частности, засоления на процессы, происходящие в этом компартменте. В то же время мало известно о том, какой вклад вносят клеточные стенки в формировании комплекса механизмов солеустойчивости растения. Сформулировано представление, что, клеточная стенка может являться источником сигналов для запуска ответных, защитных реакций растительного организма.

В настоящее время клеточная стенка рассматривается как сложноорга-низованный, динамичный компартмент клетки, выполняющий важные функции в процессах роста и развития растения. За счет особенностей свойств этой структуры растительной клетки происходит модификация внешнего раствора в результате реакций обмена между ионообменными группами полимерного матрикса клеточных стенок и ионами среды.

5 Исследованию особенностей функционирования клеточных стенок растений как природных ионообменников в условиях засоления посвящены немногочисленные публикации (Bigot and Binet, 1986; Meychik et al., 2005, Мейчик и др., 2006). Практически нет работ, в которых ионообменная способность клеточных стенок оценивалась бы количественно. В литературе также отсутствуют данные о влиянии сортовой специфики на ионообменные свойства клеточных стенок.

Бобовые растения во многих странах, в том числе в Исламской республике Иран, являются ценными сельскохозяйственными культурами, важными продуцентами белка (Singla and Garg, 2005). В этой связи крайне важно изучить сортовые и видовые особенности бобовых культур с целью их использования на засоленных почвах. Кроме того, сравнительные исследования свойств клеточных стенок растений разных видов и сортов, отличающихся по устойчивости к действию солевого стресса, необходимы для выявления роли этого компартмента клетки в механизмах солеустойчивости.

Цель данной диссертационной работы: провести сравнительное исследование ионообменной способности полимерного матрикса клеточных стенок растений из семейства Fabaceae при действии засоления и установить роль клеточной стенки в солеустойчивости растений.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Используя параметры роста, сравнить степень устойчивости к засолению разных видов и сортов растений из семейства бобовых.

2. Определить качественный и количественный состав функциональных групп полимерного матрикса клеточных стенок бобовых растений, различающихся по устойчивости, и выявить изменения в ответ на действие засоления.

3. Провести сравнительное исследование физико-химических свойств полимерного матрикса клеточных стенок разных сортов и видов бобовых растений:

определить константы диссоциации функциональных групп, расположенных в полимерной структуре клеточных стенок;

оценить коэффициенты набухания полимерного матрикса клеточных стенок при разных значениях рН и ионной силы внешнего раствора;

определить интервал рН, в котором функциональные группы клеточных стенок ионизированы и способны принимать участие в реакциях ионного обмена.

4. Установить роль ионообменного механизма связывания ионов полимерным матриксом клеточных стенок в адаптации бобовых растений к засолению. Научная новизна работы. Впервые исследован состав полимерного матрикса клеточных стенок растений из семейства Fabaceae - нута С. arieti-пит (сорт Bivanij и ILC482) и вики V. narbonesis (сорт Sel2384), и проведен сравнительный анализ содержания катионообменных групп (карбоксильных групп полигалактуроновой и оксикоричных кислот, фенольных групп) и анионообменных групп (аминогрупп). Впервые определены физико-химические параметры, количественно характеризующие ионообменные свойства (константы диссоциации функциональных групп, общее содержание катионообменных и анионообменных групп, количество групп каждого типа) и способность к набуханию полимерного матрикса клеточных стенок растений, различающихся по солеустойчивости. Определены интервалы рН, в которых функциональные группы матрикса ионизированы и способны вступать в обменные реакции с катионами и анионами внешней среды. Впервые показано, что объем клеточных стенок С. arietinum и V. narbonesis не является постоянной величиной и зависит от ионных условий и рН внешнего раствора и апопласта. Установлено, что растения из семейства Fabaceae, отличающиеся по устойчивости к действию засоления, проявляют сортовую и видовую специфичность структуры полимеров экстраклеточного матрикса.

Практическая значимость работы. Полученные в работе данные расширяют фундаментальные знания о роли клеточных стенок в устойчивости растений к неблагоприятным факторам окружающей среды. Результаты могут быть использованы в курсах лекций по минеральному питанию и стресс-устойчивости растений. Показано, что одной из ответных реакций бобовых растений на засоление являются изменения физико-химических свойств клеточных стенок. Полученные в работе физико-химические параметры (константы диссоциации функциональных групп, общее содержание катионооб-менных и анионообменных групп, количество групп каждого типа, коэффициент набухания полимерного матрикса) позволяют предсказывать изменения ионного состава в водном пространстве клеточных стенок на начальном этапе поглощения элементов минерального питания.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на IV-ой Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2005), 13^th Multi-disciplinary Iranian Researchers Conference in Europe (Leeds, 2005), XV International Plant Nutrition Colloquium «Plant nutrition for food security, human health and environmental protection» (Beij'ing, 2005), International scientific conference «Genetic and Physiological Fundamentals of Plant Growth and Productivity» (Vilnius, 2006).

Публикации. Всего по материалам диссертации опубликовано 6 работ. Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителями и сотрудниками, работавшими совместно с автором.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 стр. машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 123 наименования (из них 105 на иностранных языках). Работа содержит 16 таблиц и иллюстрирована 30 рисунками.

1.Клеточная стенка растительной клетки

1.1 Состав клеточной стенки

Клеточная стенка растений представляет собой сложный матрикс, окружающий каждую клетку. В отличие от клеток многих животных и грибов клеточная стенка растений значительно толще, прочнее, жестче и в гораздо большей степени определяет стратегию существования как самой клетки, так и целого растения.

В последнее десятилетие существенно изменился взгляд на структуру и роль клеточной стенки в развитии и функционировании клетки. В настоящее время установлено, что стенка растительной клетки - тонко организованный сложный комплекс разнообразных полисахаридов, белков и ароматических веществ. Некоторые структурные молекулы работают как волокна, другие - служат связующим матриксом. Молекулярный состав и организация полимеров клеточной стенки могут быть различными у представителей разных таксонов, клеток разных тканей одного вида, у индивидуальных клеток, и даже у разных частей стенки, окружающей отдельный протопласт (Buchanan et al., 2001).

Клеточная стенка растений - динамичный компартмент, который изменяется в течение жизни клетки. Первичная клеточная стенка образуется при делении клетки и быстро увеличивает свою поверхность в процессе роста растяжением (в некоторых случаях более чем, в сто раз). При диф-ференцировке большинство клеток формируют вторичную клеточную стенку, образуя сложные структуры, уникально подходящие для выполнения конкретных функций специализированных клеток.

Таким образом, в настоящее время клеточная стенка рассматривается как неотъемлемый и метаболически активный компартмент клетки растения, выполняющий структурную, защитную, транспортную, сигнальную функции, а также участвующий в росте и развитии клетки и поддержании водного и ионного гомеостаза.

Первичная клеточная стенка состоит из нескольких структурно и функционально взаимодействующих сетей полимеров. Основная сеть, образующая каркас клеточной стенки, построена из линейных микрофибрилл целлюлозы и соединяющих их связующих гликанов. Другие - представлены пектиновыми полисахаридами, структурными белками и фенилпропа-ноидами (Шарова, 2004).

Существуют два основных типа клеточных стенок - тип I и тип И. Эти типы различны по строению, химическому составу и находятся у растений разных таксономических групп (Carpita and Gibeaut, 1993).

Основными компонентами клеточной стенки, формирующими ее главный структурный остов, являются полисахариды. Благодаря способности Сахаров образовывать связи в различных положениях они стали универсальным и разносторонним строительным материалом клеточных стенок. Главным структурным компонентом всех типов клеточных стенок растительной клетки является целлюлоза. Она составляет от 9 % до 30 % сухой массы всех первичных клеточных стенок, во вторичных клеточных стенках ее содержание несколько выше (Бардинская,19б4). Целлюлоза существует в форме микрофибрилл, состоящих из множества цепочек нераз-ветвленного (1—>4)р-0-глюкана. Наличие р-1,4-связей создает возможность отдельным цепочкам полимера соединяться между собой водородными связями (O'SuIlivan, 1997). Остатки глюкозы, входящие в состав полимерной цепи, содержат много полярных групп, поэтому они легко гид-ратируются. Каждая макромолекула целлюлозы может состоять из несколько тысяч молекул D-глюкозы и достигать в длину от 2 до 3 мкм (Бар-динская, 1964).

В нескольких типах клеток на определенных стадиях формирования клеточной стенки, например, в прорастающей пыльцевой трубке или срединной пластинке, синтезируется каллоза. Этот полимер отличается от целлюлозы наличием (1—>3)р-0-глюкановых цепочек, которые могут обра-

зовывать спиральные дуплексы и триплексы. Синтез каллозы также происходит в ответ на повреждение или для предотвращения проникновения грибной инфекции (Buchanan et al., 2001).

Другой класс полисахаридов представлен связующими или сшивоч-ными гликанами. Они связываются с микрофибриллами целлюлозы с помощью водородных связей и, таким образом, формируют сеть углеводных полимеров клеточной стенки. Связующие гликаны часто называют "геми-целлюлозами". Этот термин широко распространен, но недостаточно точен. Его применяли ко всем соединениям, независимо от их структуры, которые экстрагировались из клеточной стенки щелочными растворами в концентрации нескольких молей (Buchanan et al., 2001). В эту группу соединений попадали как связующие гликаны ("нейтральные гемицеллюло-зы"), так и пектиновые соединения ("кислые гемицеллюлозы"). В отличие от целлюлозы, связующие гликаны имеют, за редким исключением, разветвленную структуру, что способствует их "сшивочной" функции в клеточной стенке (Алехина и др., 2005). Они обычно имеют главную цепь и боковые ветви, состоящие из глюкозы и пентоз соответственно. Гексозы связующих гликанов представлены D-глюкозой и D-галактозой, пентозы — L-ксилозой и L-арабинозой; выделены также дезоксисахара — L-рамноза (6-дезокси-Ь-манноза) и L-фукоза (6-дезокси-Ь-галактоза) (Buchanan et al., 2001).

Первичные клеточные стенки всех покрытосемянных растений содержат два типа связующих гликанов - ксилоглюканы (XyG) и глюкуро-ноарабиноксиланы (GAX). Ксилоглюканы характерны для всех двудольных и примерно половины однодольных растений (Шарова, 2004, Carpita, 1996). Однодольные растения, относящиеся к коммелиноидам (Commelinoid), которые включают в себя бромелиды (bromeliadea), пальмы, имбирь, кипарисы и большинство трав, в качестве главного связующе-

го гликана клеточных стенок имеют глюкуроноарабиноксиланы (GAX). Особая группа связующих гликанов обнаружена у злаков (Carpita, 1996).

Ксилоглюканы (XyGs) представляют собой линейную цепочку (1—»4)Р-0-глюкана, к которому присоединены многочисленные остатки D-ксилозы в 0-6 положении глюкозного остатка (Carpita and Gibeaut, 1993). К некоторым из ксилозных фрагментов в свою очередь присоединяются, в зависимости от вида растения, остатки L-арабинозы или D-галактозы. В ряде позиций к галактозе присоединяется еще и L-фукоза. XyG построены из повторяющихся одинаковых блоков - структурных единиц, каждая из которых содержит от 6 до 11 Сахаров, строение которых специфично для разных тканей и видов растений (Buchanan et al., 2001).

XyG представлены тремя основными вариантами их структуры:

4. Фукогалактоксилоглюканы характерны для всех "некоммелиноид-ных" однодольных и большинства видов двудольных растений. Их основная структура состоит из практически эквивалентных количеств XXXG и XXFG, однако возможны определенные вариации структуры, например присоединение в некоторых местах к глюкозным остаткам L-арабиноз (где Х- остаток глюкозы, замещенный ксилозой, G- незамещенный остаток глюкозы, F- остаток глюкозы, замещенный фукозой) (Pauly et al., 2001).

5. Ксилоглюканы растений семейства пасленовых (Solanaceae) и мяты представлены арабиноксилоглюканами. Для этой разновидности кси-логлюканов характерно, что только две из каждых четырех глюкозильных единиц содержат остаток ксилозы, и к этим ксилозным единицам присоединены один или два остатка L-арабинозы. При этом каждый третий из ксилозных остатков в арабиноксилоглюканах ацетилирован.

6. "Коммелиноидные" однодольные также содержат незначительные количества ксилоглюканов, однако эти XyG имеют боковые фрагменты ксилозы или других Сахаров в случайных положениях (Buchanan et al., 2001).

Глюкуроноарабиноксиланы (GAX) являются основными связующими гликанами "коммелиноидных" видов однодольных растений. В этом полимере арабинозный остаток присоединен исключительно по 0-3 положению, а остатки глюкуроновой кислоты - по 0-2 положению основной цепи (Carpita, 1996). Следует отметить, что в составе клеточных стенок всех покрытосемянных растений содержатся небольшие количества GAX, но их структура может значительно варьировать в отношении места присоединения L-арабинозных остатков - у "некоммелиноидных" видов они чаще находятся в 0-2 положении (Carpita and Gibeaut, 1993).

Для порядка злаковых (Poales), который включает в себя хлебные злаки и ряд трав, характерен третий вид связующих гликанов - смешанные гликаны или (1—*3)(1—»4)р-гликаны (Carpita, 1996). В отличие от других сшивочных гликанов они имеют неразветвленную структуру. На 90% они состоят из имеющих Р"(1—»4)-связи целлотриозных и целлотетраозных фрагментов в соотношении 2:1. Указанные фрагменты соединяются между собой Р-(1—»3)-связью. За счет этого полимер образует складчато-винтообразную структуру (Buchanan et al., 2001).

В первичных клеточных стенках практически всех исследованных покрытосеменных растений найдены также и другие связующие гликаны: ксиланы и маннаны. В зависимости от типа Сахаров, находящихся в боковых цепях, они называются арабиноксиланом, глюкоманнаном, галактог-люкоманнаном, галактоманнаном и т.д. (Саламатова, 1983). Однако их количество существенно меньше, чем основных связующих гликанов.

Пектины представляют собой смесь гетерогенных, разветвленных и сильно гидратированных полисахаридов, обогащенных D-галактуроновой кислотой. В классических работах эти соединения определялись как вещества, экстрагируемые из клеточных стенок растворами, хелатирующими кальций (оксалат аммония, ЭДТА, ЭГТА или циклогександиаминтетрааце-тат) (Buchanan et al., 2001). Содержание пектиновых веществ в первичных

клеточных стенках двудольных растений составляет примерно 30%, а у однодольных растений группы коммелиновых - лишь 5-10% (Ridley et al., 2001,Willats et al., 2001). Полагают, что пектины выполняют множество функций в клеточной стенке: определяют пористость, обеспечивают поверхностный заряд, оказывающий влияние на ее рН и ионный баланс. Кроме того, пектины участвуют в регулировании межклеточной адгезии в процессе формирования срединной пластинки; они служат источником сигнальных молекул, участвующих во взаимодействии растительной клетки с насекомыми, патогенами и симбионтами. Также пектины могут ограничивать действие отдельных ферментов клеточной стенки за счет электростатического связывания. Определяя пористость клеточной стенки, пектины могут влиять на рост клетки, регулируя доступ ферментов к углеводным субстратам (Buchanan et al., 2001).

Пектины клеточных стенок состоят из двух основных компонентов: гомогалактуронана, основная цепочка которого построена исключительно из остатков галактуроновой кислоты, и рамногалактуронана І, у которого остатки галактуроновой кислоты чередуются с остатками рамнозы.

Гомогалактуронаны - гомополимеры (1—»4)|3-0-галактуроновой кислоты, которые содержат как минимум 200 галактуроновых фрагментов и имеют длину около ЮОнм (Carpita and Gibeaut, 1993). Помимо классических гомогалактуронанов известно два типа их структурных модификаций - ксилогалактуронан и рамногалактуронан II (RG II). Основная цепочка этих полимеров представлена остатками галактуроновой кислоты с различными боковыми заместителями. При этом среди полисахаридов клеточных стенок RG II характеризуется богатым разнообразием Сахаров и типов связей между ними. В их состав могут входить апиоза, 3-С-карбокси-5-дезокси-Ь-ксилоза, 2-О-метилфукоза, 2-О-метилксилоза, 3-дезокси-0-манно-2-октулозониевая кислота, 3-дезокси-0-ликсо-2-гептулозариевая кислота (Willats et al., 2001). RG II обнаружены в клеточ-

ных стенках двудольных и однодольных растений, но везде как минорная фракция пектинов. Структура RG II очень консервативна у всех цветковых растений, что, вероятно, указывает на весьма важные функции этих полимеров, несмотря на их относительно невысокое содержание в клеточных стенках (~3%) (Ridley et al., 2001). С учетом сложного и консервативного состава этих соединений было высказано предположение об их сигнальной функции (Carpita and Gibeaut, 1993). В первичных клеточных стенках были обнаружены также димеры RG II, связь в которых осуществляется через остатки апиозы каждого мономера путем образования двух диэфирных связей с участием атома бора. Ионы кальция входят в состав димера RG II и увеличивают его прочность (Kobayashi et al., 1999). При выращивании растений в условиях дефицита бора резко увеличиваются поры клеточной стенки, что указывает на изменение свойств пектинового геля стенки (Freischer et al., 1999). Следовательно, боратные диэфиры в составе RG II, очевидно, выполняют структурную функцию.

Рамногалактуронан I (RG I) представляет собой гетерополимер, основная цепочка которого построена из повторяющихся дисахаридных остатков (1—»2)-Ь-рамноза-(1—»4)-0-галактуроновая кислота (Ridley et al., 2001). Карбоксильные группы галактуроновой кислоты в RG I обычно не метоксилированы. В среднем около 30% остатков галактуроновой кислоты ацетилировано в положении 0-2 (Carpita and Gibeaut, 1993). Реже бывают ацетилированы спиртовые группы в положении О-З. К большинству остатков рамнозы в цепочке RG I по 0-4 положению присоединены боковые полисахариды. Они представлены, главным образом, нейтральными саха-рами типа арабинанов, галактанов и сильно разветвленных арабиногалак-танов типа I (AG I) различных конфигураций и размеров (Carpita and Gibeaut, 1993). В целом, около половины остатков рамнозы в RG I имеют боковые цепочки, но это отношение может меняться в зависимости от вида растения, типа ткани и стадии развития (Шарова, 2004).

В клеточных стенках присутствуют два типа структур арабиногалак-танов:

Тип I AG обнаружен только в связанном с пектинами виде и состоит из (1—>4)Р-0-галактановых цепей, к О-3-положению галактозного остатка которых присоединена арабиноза.

Тип II AG представлен широкой группой коротких галактановых цепочек, связанных друг с другом (1—*3) и (1—*6) связями, и образующих сильно разветвленные структуры. Араби ногалактаны этого типа связаны с арабиногалактановыми белками клеточной стенки.

У растений семейства Chenopodiaceae спиртовые группы остатков арабинозы и галактозы в составе боковых цепей RG I могут быть этерифи-цированы феруловой кислотой (Ridley et al., 2001).

Полигалактуроновые цепи пектинов содержат большое количество карбоксильных групп, которые связывают ионы двухвалентных металлов, особенно кальция. При определенных условиях внешней среды ионы кальция могут обмениваться на другие катионы, например Н⁺, К⁺, Na⁺ (Sattel-macher, 2001). У гомогалактуронанов, секретируемых из цитоплазмы, 70-80% карбоксильных групп метоксилированы. Такие пектины несут -СООСНз-группы и, таким образом, относительно нейтральны, значительная их часть находится в молодых тканях. Частично ацетилированы спиртовые группы в положении 0-2 и О-З. Степень метоксилирования гомогалактуронанов очевидно определяется тем, насколько метоксилированы секретируемые в клеточные стенки молекулы, а также тем, насколько быстро они деэтерифицируются под действием пектинметилэстераз и затем гидролизуются с участием полигалактуроназ (Шарова, 2004). Образовавшиеся при этом свободные карбоксильные группы могут соединяться с ионами Са²⁺. В клетках меристем и зоны растяжения, где концентрация кальция весьма низкая, деметилирование гомогалактуронанов может происходить без последующего связывания с ионами Са²⁺. В этом случае об-

разовавшиеся свободные карбоксильные группы не влияют на пористость клеточных стенок, а определяют и регулируют рН стенки.

У растущих клеток обычно сохраняется высокая степень этерифика-ции пектинов, однако в дальнейшем происходит постепенное вытеснение высокометоксилированных пектинов кислыми (Kim and Carpita, 1992). Очень низка степень метоксилирования (менее 30%) наблюдается у многих зрелых сочных плодов (Brummell and Harpster, 2001). Кроме того, пектины, несущие свободные карбоксильные группы, более восприимчивы к гидролизу различными ферментами (Fry, 2004). Результаты применения моно-клональных антител свидетельствуют о том, что деэтерифицированные, связанные с кальцием гомогалактуронаны локализованы в срединных пластинках, углах клеток, вокруг межклетников, тогда как этерифицирован-ные гомогалактуронаны равномерно распределены по всей толще первичных клеточных стенок (Ridley et al., 2001).

Как свободные, так и метоксилированные карбоксильные группы полигалактуроновых цепей, обладая двумя атомами кислорода, образуют водородные связи с молекулами воды, удерживая ее в клеточной стенке. Поэтому высокая оводненность матрикса первичной клеточной стенки (до 90%) обусловлена в значительной мере ее пектиновыми компонентами (Sattelmacher, 2001). Таким образом, пектиновые вещества участвуют в ионообменных реакциях и поддерживают высокую оводненность клеточной стенки.

Первичные нелигнифицированные клеточные стенки однодольных растений, относящихся к коммелиноидам, а также растений семейства Chenopodiaceae (например, сахарной свеклы и шпината) содержат значительные количества ароматических веществ, основная часть которых представлена гидроксикоричными кислотами, феруловой и р-кумаровой (Buchanan et al., 2001). У злаковых и некоторых трав гидроксикоричные кислоты присоединены сложноэфирной связью к 0-5 положению некоторых

из арабинозных единиц глюкуроноарабиноксиланов, а у двудольных - феруловая кислота связана с пектиновыми веществами (Bunzel et al., 2004). Некоторая часть остатков феруловой кислоты на GAX может соединяться фенил-фенильной или фенил-эфирной связью с соседним GAX, объединяя, таким образом, глюкуроноарабиноксиланы в сложную сеть. У растений семейства Chenopodiaceae оксикоричные кислоты присоединены к галак-тозным или арабинозным остаткам боковых цепей RG I. Оксикоричные кислоты также могут быть восстановлены до оксикоричных спиртов, пополняя, таким образом, пул предшественников синтеза лигнинов и лигна-нов.

Количество феруловой кислоты и других гидроксикоричных кислот в растительной клеточной стенке изменяется в ходе жизненного цикла. Концентрация феруловой кислоты значительна на ранних стадиях развития растения, а на поздних стадиях - уменьшается (Faulds and Williamson, 1999).

Часть феруловых кислот могут образовывать димеры между ароматическими кольцами или незамещёнными алифатическими боковыми группами. Такие димеры связывают между собой полисахаридные цепочки, полисахариды и лигнин или белки. Эти связи определяют механические свойства клеточной стенки, такие как растяжимость (Faulds and Williamson, 1999).

Полисахариды могут соединяться с остатками ферулатов в изолированной клеточной стенке с помощью пероксидазы в результате реакции перекисного окисления с образованием нескольких разных эфиров (5-5"-, 8-0-4-, 8-8'- и т. д.) (Encina and Fry, 2005). Полагают, что эфирная связь возникает и между тримерами или более крупными цепочками ферулатов. Помимо поперечных сшивок двух цепей оксикоричные кислоты могут участвовать в формировании внутрицепочечных петлей (Kerr and Fry, 2004).

В состав матрикса клеточных стенок помимо углеводных компонентов входят белки. Природа белков клеточной стенки различна. Все белки, за исключением тех, которые обогащены глицином, гликозилированы и содержат гидроксипролин. Большинство белков клеточной стенки соединены с ней ковалентными связями и, вероятно, имеют структурные функции, хотя они могут также участвовать в морфогенезе. Взаимодействия белков между собой и с другими компонентами стенки до сих пор не выяснено, так же как неизвестно, каким образом компоненты клеточной стенки собраны в единый структурно-функциональный ансамбль (Buchanan et al., 2001).

Известно четыре главных класса структурных белков клеточной стенки, три из них названы по преобладающей в данном белке аминокислоте. Это гидроксипролин-обогащенные гликопротеиды, пролин-обогащенные и глицин-обогащенные белки (Шарова, 2004). Структурные белки клеточной стенки обычно кодируются большими мультигенными семействами. Их синтез находится под контролем развития, и относительное количество белка варьирует в разных тканях и видах растений.

К гликопротеинам, обогащенным гидроксипролином, относится экстенсии. Экстенсии - наиболее изученный структурный белок клеточных стенок растений. Содержание экстенсинов в первичных стенках двудольных растений составляет 5-10%, у однодольных - только 0,5-1% (Cassab and Varner, 1988). Он состоит из повторяющихся последовательностей Ser-(Нур)₄ и Tyr-Lys-Tyr, которые важны для формирования вторичной и третичной структуры белка (Cassab and Varner, 1988). Повтор гидроксипроли-нового остатка предопределяет "полипролин Н"-подобную структуру белка (Buchanan et al., 2001). Экстенсии является гликопротеином, белковая часть которого содержит более 20% L-оксипролина от суммы аминокислот, которого нет у внутриклеточных белков (Jackson et al., 2001). Кроме того, в них много пролина, серина, тирозина, лизина, гистидина и валина.

Углеводная часть экстенсина на 97% представлена тетрасахаридами ара-бинозы и на 3% остатками галактозы (Cassab and Varner, 1988). В онтогенезе клетки или в условиях стресса прочность связи экстенсина с другими компонентами матрикса меняется. Это сказывается на способности клеточной стенки к росту растяжением (Cosgrove, 1997). Содержание экстен-синов возрастает в процессе дифференцировки клеток, а также в условиях стресса. Показано, что эти белки интенсивно накапливаются в клеточных стенках стареющих тканей, при механическом повреждении, поражении растений патогенами (Stiefel et al., 1990, Sommer-Knudsen et al., 1998). В условиях стресса экстенсии инсолюбилизируется в результате окислительных сшивок между остатками тирозина, и это способствует большей жесткости клеточных стенок (Jackson et al., 2001).

Арабиногалактановые белки, вероятно, являются протеогликанами, так как могут состоять более чем на 95 % из углеводов (Sommer-Knudsen et al., 1998, Gaspar et al., 2001). Они расположены также на поверхности клеточной мембраны, в мембранах эндоплазматического ретикулума и в гуммиарабике. Содержание арабиногалактановых белков составляет 0,1-1%) от сухой массы клеточных стенок (Шарова, 2004). Арабиногалактановые белки обогащены пролином (гидроксипролином), аланином и сери-ном/треонином. Идентификационным признаком этих белков является наличие в полипептидной цепи повторов Ala-Hyp и Hyp-Ala (Showalter, 1993). Характерное свойство арабиногалактановых белков - способность избирательно взаимодействовать с углеводами. Эти белки представляют собой Р-лектины растений, так как связываются Р-гликозидными антигенами Ярива (Schindler et al., 1995). Для арабиногалактановых белков не установлена какая-либо точная функциональная роль. Полагают, что эти белки участвуют в адгезии клеток, а также могут служить маркерами направления клеточной дифференцировки (Showalter, 1993, Schindler et al., 1995).

Белки клеточной стенки, обогащенные пролином, участвуют в регуляции развития, начиная от прорастания и заканчивая образованием клубеньков на ранних этапах их формирования. Возможно, они влияют на процессы развития и дифференциации ксилемы, клубеньков и стручков, а также яйцеклетки, зародыша и развития микроспоры, но их специфические функции неизвестны (Gassab, 1998). Синтез этих белков индуцируется в участках поранения, инфицирования патогенными и симбиотическими микроорганизмами.

Глицин-обогащенные белки представляют собой разнообразную группу гликопротеидов, которые могут функционировать в качестве структурных элементов как внутри клетки, так и в клеточной стенке (Car-pita, 1996). Эти белки, ряд из которых содержат более чем 70% глицина, имеют Р-складчатую структуру (Carpita and Gibeaut, 1993). Глицин-обогащенные белки, в отличие от других белков клеточное стенки, не содержат оксипролина. Полагают, что глицин-обогащенные белки формируют складчатую структуру в районе контактов клеточной стенки и плазматической мембраны. Складчатая структура содержит ароматические аминокислоты, функция которых не известна. Подобно гидроксипролин-обогащенным белкам, глицин-обогащенные белки трудно экстрагируются из полимерного матрикса стенки, следовательно, можно сделать предположение, что они прочно встроены в клеточную стенку (Buchanan et al., 2001). Гены этих белков к настоящему времени обнаружены у многих видов растений и показано, что их экспрессия наблюдается в метаксилеме, в участках поранения, а также в процессе лигнификации (Шарова, 2004)

Основным инкрустирующим веществом клеточной стенки является гетерополимерное ароматическое вещество - лигнин. Лигнин появляется в клеточной стенке на ранних стадиях развития сосудов протоксилемы и инкрустирует последовательно первичную, а затем вторичную клеточные стенки (Саламатова, 1983). Интенсивная лигнификация клеточных стенок

начинается после прекращения роста клетки. Лигнины представляют собой нерегулярные трехмерные полимеры сети из фенилпропаноидов - ароматических фенольных соединений со структурой С₆-Сз- В этом полимере содержится много активных групп — метоксильные, гидроксильные, карбонильные (Шарова, 2004). Лигнин соединяется эфирными или гликозид-ными связями с пектиновыми веществами матрикса стенки, выполняя роль инкрустирующего аморфного вещества, заполняющего межфибриллярные промежутки в стенке во время одревеснения (Buchanan et al., 2001).

Вторичные клеточные стенки могут подвергаться суберинизации (например, в эндодерме, перидерме). Мономерами суберина являются мо-но-, ди- и триоксижирные насыщенные и ненасыщенные кислоты (C^-Cjs) (Саламатова, 1983). Импрегнированные суберином клеточные стенки становятся трудно проницаемыми для воды и растворов и выполняют защитные функции, регулируя водно-тепловой режим тканей, препятствуя излишнему испарению воды.

1.2 Структурная организация клеточной стенки Клеточная стенка растительной клетки представляет собой внешний компартмент, тесно связанный с внутренним содержимым клетки плазмодесмами, плазмалеммой и цитоскелетом. Микрофибриллы целлюлозы, образующие каркас клеточной стенки, взаимодействуют с матриксом, состоящим из гемицеллюлоз, пектинов, структурных белков и фенольных соединений, формируя трехмерный сшитый полимер. Связи между разными компонентами клеточной стенки могут быть нековалентными (водородные, ионные), например, между гликопротеинами с основными свойствами и кислыми полисахаридами, между гемицеллюлозой и целлюлозой, Са²⁺-мостики, связывающие молекулы пектинов друг с другом. Другие связи являются ковалентными, например, молекулы рамногалактуронана II могут соединяться между собой диэфиром бора, некоторые полисахарид-ные цепи связываются через окисленные боковые фенольные группы (фе-

руловая кислота) или через тирозиновые остатки (Yu et al., 2002). Лигнин может ковалентно присоединяться к определенным полисахаридам через бензил-эфирные мостики, формируя лигнин-карбогидратный комплекс (Fry, 2004).

Еще до 70-х годов применение химических методов анализа к изучению экстраклеточного компартмента позволило выяснить, что: 1) соседние цепи целлюлозы в микро- и макрофибриллах связаны водородными связями; 2) пектиновые полимеры «сшиваются» ионами кальция; 3) существуют ковалентные связи между лигнином и целлюлозой через карбонильные группы лигнина; 4) ксилоглюкан способен нековалентно связываться с целлюлозой (Саламатова, 1983).

Дальнейшие исследования показали, что микрофибриллы целлюлозы соединены с ксилоглюканами гемицеллюлоз водородными связями, образующимися между гидроксильными группами шестого атома углерода глюкозы в целлюлозных цепях и кислородом в гликозидных связях ксилоглюкана. Число молекул ксилоглюкана примерно соответствует числу молекул целлюлозы на поверхности микрофибрилл (Саламатова, 1983). Связи пектинов с гемицеллюлозами и экстенсином — ковалентные. Они возникают: а) между редуцирующими концами полимеров ксилоглюкана и галактаном или арабиногалактаном рамногалактуронана (Talbot and Ray, 1992) и б) возможно, между рамногалактуронаном и серином экстенсина. Следует отметить, что один пектиновый полисахарид через цепи ксилоглюкана может быть связан с несколькими цепями целлюлозы, а одна цепь целлюлозы через ксилоглюкан - с несколькими пектиновыми полимерами. Таким образом, в клеточной стенке возникает система ковалентных пересекающихся связей (Шарова, 2004).

Представленная модель, полученная на культуре клеток явора, предполагала наличие ковалентных связей между ксилоглюканами и пектинами, однако некоторые исследователи выдвигали предположения о невоз-

можности существования гликозидных связей между полимерами (Hayashi, 1989, O'Neill and Selvendran, 1983). Один из таких вариантов строения клеточной стенки характеризовался наличием двух независимых сетей пектинов и белков, не связанных друг с другом ковалентными связями. Модель строения клеточной стенки, предложенная другими авторами, предполагает, что каждая микрофибрилла целлюлозы покрыта серией по-лисахаридных слоев, между которыми отсутствуют ковалентные связи (Cosgrove,2001).

Однако затем были получены данные, свидетельствующие в пользу существования ковалентных связей между пектинами и гемицеллюлозами. Комплекс пектинов с гемицеллюлозами содержал UV-абсорбирующий компонент фенольной природы, в качестве которого выступают гидрокси-коричные кислоты (Thompson and Fry, 2000). В настоящее время показано, что пектины и гемицеллюлозы могут быть связаны между собой гликозид-ными, эфирными связями или образованными с помощью остатков фенольной природы (диферуловый эфир) (Popper and Fry, 2005).

1.3 Некоторые особенности строения первичных клеточных стенок растений из семейства Fabaceae

Результаты анализа изменений полисахаридов матрикса клеточных стенок гороха Pisum sativum, происходящих в процессе ауксин-индуцированного растяжения клетки, свидетельствуют, что модель, предложенная для культуры клеток явора, не подходит для описания организации первичных клеточных стенок растений гороха. Данные экспериментов, полученные на клеточных стенках, изолированных из стеблей гороха и анализированных методом гельпроникающей хроматографии, показали отсутствие во фракции пектинов рамногалактуронана I и II с массами 100 kD и 5-Ю kD, соответственно (Talbott and Ray, 1992). Пик полиуронидов пектина характеризуется молекулярной массой 1100 kD, при этом пектины составляют 40% от массы клеточной стенки гороха. Было показано, что

большая часть (86%) нейтральных Сахаров пектинов, преимущественно арабинозы и галактозы, ковалентно связана с полиуронидами, также как в RG-II и RG-I. Однако более высокое содержание уроновых кислот во фракции пектинов, чем у RG-II и RG-I, и высокое соотношение уроновых кислот к рамнозе (по сравнению с ожидаемым соотношением 1:1 для RG-I и 2,5:1 для RG-II) свидетельствует о том, что главным компонентом пектиновых веществ гороха является гомогалактуронан. Он составляет около 82% от общего содержания полиуронидов пектина или 37% от чистой фракции пектина (Talbott and Ray, 1992). Результаты других исследований свидетельствуют, что клеточные стенки гороха содержат рамногалактуро-нан-Н в количестве 8,5 % от общего содержания пектинов (Darvill et al., 1978). Вероятно, рамногалактуронан-І также присутствует в клеточных стенках гороха, поскольку этот полимер широко распространен в первичных клеточных стенках семян, и его содержание в два раза больше по сравнению с рамногалактуронаном-П (Carpita and Gibeaut, 1993).

Известно, что выделение полимеров RG-II и RG-I из клеточной стенки можно осуществить путем ферментативной деструкции с помощью эн-дополигалактуроназы, гидролизующей гомогалактуронан (McNeil et al., 1990). Этот факт и результаты других экспериментов позволяют предположить, что пектины содержат разветвленные блоки рамногалактуронана и линейные блоки гомогалактуронана (Thibault, 1983). Это точка зрения подтверждается данными, свидетельствующими о том, что в процессе хроматографии нейтральные сахара рамногалактуронана выделяются вместе с уроновыми кислотами (большинство из которых принадлежат гомогалак-туронану, как было отмечено выше) в виде отдельного пика. Расчеты показывают, что если размер блоков RG-II и RG-I полимеров гороха соответствуют таковым для клена явора, то в среднем молекула пектина массой около 1100 kD может содержать не более двух таких блоков RG-I и 25-40 блоков RG-II (Talbott and Ray, 1992).

Фракция гемицеллюлозы, которая составляет 30% от массы первичной клеточной стенки гороха, в отличие от пектинов содержит значительные количества глюкозы и ксилозы (Talbott and Ray, 1992). Эти данные согласуются с результатами ранних исследований, свидетельствующих о том, что основная масса ксилоглюканов принадлежит гем и целлюлозам (Hayashi and Maclachlan, 1984). Пик ксилоглюкана клеточных стенок гороха характеризуется молекулярной массой 30 Ш, следовательно, его углеводный скелет может содержать около 180 остатков глюкозы. Кроме того, было показано, что галактоза и арабиноза также являются главными составляющими гемицеллюлозы. Фракция гемицеллюлозы содержит араби-ногалактан, включающий почти половину арабинозы и две третьих галактозы от общей массы матрикса клеточных стенок гороха (Talbott and Ray, 1992). Полагают, что арабиногалактан состоит из связанных между собой, вероятно, гликозидными связями, цепочек галактана и арабинана. В настоящее время арабиногалактаны чаще относят к пектиновым веществам клеточной стенки. Однако в работах более ранних лет (Lorences et al., 1987, Redgwell and Selvendran, 1986) было обнаружено, что галактоза и арабиноза являются важными компонентами гемицеллюлозы, и в процессе хроматографии не удавалось разделить арабиногалактаны от других составляющих гемицеллюлоз. Результаты, полученные при анализе хроматограмм фракции гемицеллюлозы гороха, отчетливо показывают наличие в ней хорошо разделяемых между собой полимеров арабиногалактана и ксилоглюкана. Следовательно, говоря о структурной организации клеточной стенки, необходимо считать арабиногалактаны важным компонентом гемицеллюлозы.

На основании данных ряда исследований можно полагать, что модель, согласно которой между полимерами матрикса имеются ковалентные связи, не адекватно отражает структурную организацию первичных клеточных стенок двудольных растений и механизм процесса роста клетки

растяжением (Jarvis et al., 1981, O'Neill and Selvendran, 1983, Ring and Selvendran, 1981). Вероятно иная гипотеза, свидетельствующая о существовании нековалентых ассоциаций молекул полимеров, например, между пектиновыми веществами, экстенсинами и пектинами, между ксилоглюка-нами и целлюлозой, уместна для объяснения механического сцепления полимеров растущей клеточной стенки. Эта концепция была выдвинута много лет назад (Preston, 1979), в настоящее время некоторые исследователи снова возвращаются к ее рассмотрению и используют для описания моделей организации клеточных стенок.

Результаты, полученные при изучении клеточных стенок гороха с помощью метода гельпроникающей хроматографии, позволяют предположить, что на поверхности микрофибрилл целлюлозы располагаются кси-логлюканы, которые могут внедряться между микрофибриллами, оставляя свободные петли и концы, обращенные в матрикс. Согласно предлагаемой модели пектиновые и гемицеллюлозные компоненты матрикса клеточной стенки могут формировать отдельные фазы в межмикрофибриллярных пространствах, при этом арабиногалактаны, подобно ксилоглюканам, контактируют с микрофибриллами целлюлозы. Таким образом, арабиногалактаны и ксилоглюканы образуют гемицеллюлозную оболочку (кортекс) вокруг отдельной микрофибриллы, промежутки между которыми занимают формирующие гель пектиновые вещества. На границе между фазой пектинов и гемицеллюлозной оболочкой соседних микрофибрилл арабиногалактаны и пектины могут взаимно переплетаться друг с другом (Talbott and Ray, 1992).

В процессе роста клетки растяжением новые молекулы ксилоглюка-нов будут связываться с растущими микрофибриллами целлюлозы и, внедряясь между ними, будут образовывать обкладку вокруг микрофибрилл. Новые пектиновые компоненты за счет высокой концентрации в клеточной стенке ионов кальция будут формировать гелеобразную фазу в простран-

ствах между микрофибриллами целлюлозы (Jarvis, 1984). Все это приведет к обособлению арабиногалактанов и минорных компонентов клеточной стенки в слой, располагающийся между фазой пектина и ксилоглюканами, образующими оболочку вокруг микрофибрилл. Поскольку экстенсии (его содержание в клеточных стенках гороха около 2%) взаимодействует ионными связями с полиуронидами и его боковые цепочки, состоящие из ара-бинозы, связываются с арабиногалактанами, можно предположить, что экстенсии будет располагаться на границе между пектинами и арабиногалактанами (Cassab and Varner, 1988). Молекулы пектинов тесно связаны друг с другом и формируют «сеть» (фиброидную фазу), существующую независимо от целлюлозно-гемицеллюлозной фазы или сети (McCann et al., 1990).

1.4. Свойства плеточной стенки

1.4.1. Катионообменная способность

Известно, что благодаря наличию фиксированных отрицательно заряженных групп клеточная стенка растений обладает катионообменной способностью (КОС), то есть может связывать катионы из внешнего раствора. Свойства клеточной стенки описывают аналогично свойствам сла-босшитого катионообменника, однако она может обменивать и анионы (Huffaker and Wallace, 1958). КОС клеточных стенок двудольных растений значительно выше по сравнению с однодольными растениями (Keller and Deuel, 1957). Определение КОС в большинстве экспериментов производилось на изолированных клеточных стенках. В связи с этим необходимо отметить, что измеряемые величины КОС намного ниже по сравнению с существующими in vivo благодаря пространственным ограничениям для доступна катионов к свободным обменным сайтам (Marschner, 1995).

Полагают, что 70-90% КОС обусловлены свободными карбоксильными группами пектинов (Knight et al., 1961), а также карбоксильными группами, связанными с целлюлозой, гемицеллюлозой и лигнином клеточ-

ной стенки. Остатки гидроксикоричных кислот вносят свой вклад в величину КОС, когда находятся в восстановленном состоянии, то есть не образуют димера. Белковые компоненты также участвуют в адсорбции катионов, на долю которой приходится 10-30 % ионообменной способности, не связанной с пектиновыми веществами (Haynes, 1980). Относительный вклад пектинов, целлюлозы и белков в величину КОС корня зависит от вида растения. Клеточные стенки также обладают небольшой анионообмен-ной способностью, которая, вероятно, обусловлена фиксированными органическими катионами матрикса клеточных стенок - свободными аминогруппами белков (Haynes, 1980).

Большинство аккумулированных ионов могут обратимо удерживаться на клеточных стенках либо в виде свободных гидратированных ионов, либо иммобилизованных разными способами, но легко обмениваемых. Мультивалентные ионы (например, Са ) могут связываться с катионооб-менными группами различных полимерных цепей, следовательно, их удаление ведет к разрыхлению клеточной стенки и к увеличению КОС (Grignon and Sentenac, 1991).

КОС не является постоянной величиной и значительно зависит от возраста и вида растения, условий окружающей среды (Chamuah and Dev, 1987). Этот параметр возрастает в период активной вегетации растений, а после цветения снижается. Добавление в питательную среду фосфора и азота способствует увеличению КОС, поскольку приводит к ускорению пролиферации корней и уменьшению доли «непектиновой» части клеточной стенки (Raju and Varma, 1987). Установлено, что добавление цинка повышает КОС на стадии цветения растений (Srivastava and Srivastava, 1992). На величину КОС влияют также присутствие в среде тяжелых металлов, высокие концентрации солей, рН среды. Например, засоление питательного раствора обычно приводит к уменьшению КОС, которая регулируется ферментом метилпектинэстеразой. Этот фермент деметилирует пектины и,

таким образом, способствует увеличению КОС клеточных стенок. Его активность зависит от наличия полиаминов в апопласте и, следовательно, от азотного питания растений. Поэтому, используя молекулярно-генетические подходы к регулированию активности этого фермента, можно влиять не только на скорость роста надземной части растения, но и на катионосвязывающую способность клеточных стенок (Pilling et al., 2000).

Фиксированные недиффундирующие анионы клеточной стенки оказывают сильное влияние на движение ионов. Например, наличие электрических двойных слоев ограничивает транспорт анионов в межфибриллярных пространствах, тогда как скорость движения катионов (преимущественно, кальция) снижается благодаря взаимодействию со свободными карбоксильными группами (Marschner, 1995).

С практической точки зрения важно, что КОС коррелирует с урожайностью растений. Было показано, что сорта с большей КОС имеют более высокую урожайность зерна (Verma et al., 1989). Авторы полагают, что КОС клеточных стенок связана с интенсивностью поглощения минеральных веществ растением.

1.4.2 Кажущееся свободное пространство

Поскольку клеточные стенки клеток одной ткани и органа непосредственно контактируют друг с другом, то возникает единая система клеточных стенок (включая и межклетники, заполненные водой), получившая название апопласт. Существование апопласта, лишенного мембранных барьеров, облегчает процессы передвижения веществ от клетки к клетке. Межмолекулярное пространство в фазе клеточной стенки, где осуществляются диффузия растворимых веществ, их адсорбция и освобождение, называется «свободным пространством».

Некоторые исследователи предлагают разделить апопласт на следующие составные части: пространство внутри ксилемы, водное свободное пространство (заполненные водой межклетники и водное пространство

клеточной стенки), доннановское свободное пространство и межклетники, заполненные воздухом (Canny, 1995).

Поскольку клеточная стенка содержит отрицательные заряды свободных карбоксильных групп полигалактуроновых кислот пектинов движение ионов в ней характеризуется электростатическими взаимодействиями, приводящими к аккумуляции катионов в кажущемся свободном пространстве (Marschner, 1995). Термин "кажущееся свободное пространство" для апопласта введен с той целью, чтобы подчеркнуть, что движение ионов в этом компартменте не свободное, а зависит от их взаимодействия с фиксированными анионами КС. Кажущееся свободное пространство (КСП) описывает те части клетки или ткани, в которых ионы обмениваются относительно быстро с окружающим раствором. КСП обычно определяется как объем ткани корня, в котором происходит разбавление абсорбированных ионов в процессе начального этапа поглощения, и выражается как процент от объема корня. Оценки размера КСП указанным способом свидетельствуют, что этот показатель находятся в пределах от 3 до 50% или выше (Люттге и Хигинботам, 1984).

КСП делится на доннановское свободное пространство (ДСП) и водное свободное пространство (ВСП). ДСП это та часть КСП, в котором распределение ионов характеризуется присутствием неподвижных фиксированных анионов, в ВСП, напротив, движение ионов не связано с электрическими зарядами. Для описания физико-химических свойств ДСП используют такие параметры как катионнообменная способность и электрический потенциал. Следует отметить, что невозможно четко разделить КСП на ДСП и ВСП, поскольку нельзя провести пространственное разделение между этими двумя компартментами, и, кроме того, размер ДСП не является фиксированной величиной. Тем не менее, эта модель полезна,

особенно в понимании таких явлений, как синергизм ионов Са и Н2РО4 или различий в поглощении Zn²⁺ в ионной и хелатной формах (Marschner,

1995).

Характеристики свободного пространства описываются в терминах теории электрического двойного слоя. Клеточная стенка в этом случае рассматривается как система отрицательно заряженных пор, стенки которой притягивают смежный слой подвижных заряженных катионов и формируют двойной электрический слой. В соответствии с этой феноменологической моделью минеральные ионы, поступающие в клеточные стенки корня через отрицательно заряженные поры, распределены в пределах объема поры в зависимости от ряда факторов, таких как плотность электрических зарядов в порах, размер пор, знак валентности рассматриваемого иона.

Принимая во внимание сложную структуру клеточных стенок, необходимо отметить, что модель двойного слоя является большим упрощением комплексной системы свободного пространства. Однако в некоторых случаях эта модель дает ключ к пониманию процессов, происходящих в апопласте, и дает возможность описать сложную биологическую систему в простых математических терминах. Особенно полезна модель двойного электрического слоя в понимании ионных взаимодействий в апопласте корня.

1.4.3. Взаимное влияние катионов и анионов в процессе поглощения ионов

При рассмотрении вопроса о взаимодействии катионов и анионов в апопласте и их влияния на накопление ионов в растении необходимо учитывать «эффект Виета». Виет впервые сообщил о стимулирующем влиянии кальция и других поливалентных катионов на адсорбцию ионов корнями растений ячменя. Было показано, что кальций стимулирует поглощение таких ионов, как К⁺, Rb⁺, Br", СГ, S0₄²' and Р0₄³". Эффект не связан с изменением целостности мембраны, поскольку другие двух- и трехвалентные катионы оказывают подобное действие, но в отличие от кальция не принимают участия в поддержании структуры мембраны. Franklin (1971)

предположил, что концентрация катионов в свободном пространстве клеточных стенок оказывает влияние на апопластный транспорт ионов. Дальнейшие исследования показали, что одновалентные катионы также способны увеличивать поглощение анионов, но в меньшей степени. Было установлено, что кальций усиливает поглощение анионов в большей степени при низких концентрациях аниона, чем при высоких, при этом его стимулирующее влияние на поглощение анионов проявляется почти мгновенно (Hooymans, 1964). Результаты исследований свидетельствуют, что в основе стимулирующего влияния катионов на поглощение анионов лежит неспецифический пассивный (физико-химический) механизм. Согласно этому механизму предварительная обработка растений поливалентными катионами значительно увеличивает поглощение корнями фосфора, при этом, чем выше валентность катиона, тем больше проявляется стимулирующий эффект. Отрицательный заряд на клеточной стенке будет увеличиваться в ряду: К⁺ > Са²⁺ > А1³⁺ (обратно пропорционально плотности заряда адсорбируемого катиона), так как поливалентные катионы более эффективно, по сравнению с одновалентными катионами, экранируют отрицательный заряд клеточной стенки.

Скорость диффузии катионов в порах зависит от их объема, занятого адсорбируемым катионом. Поливалентные катионы в большей степени уменьшают ширину двойных слоев, чем эквивалентная концентрация одновалентных катионов. Следовательно, одновалентные катионы оказывают большее влияние на свободное пространство клеточных стенок, нежели поливалентные катионы. Таким образом, при насыщении свободного пространства клеточных стенок трехвалентными катионами сохраняется большой свободный просвет в поре для движения других ионов по сравнению с насыщением одновалентными катионами. С другой стороны, одновалентные катионы в высоких концентрациях эффективно экранируют фиксированные отрицательные заряды клеточной стенки и, таким образом,

33 способствуют увеличению поглощения анионов. Кроме того, соотношение

Лі і

концентраций Са' и К в свободном пространстве апопласта также влияет на поглощение анионов.

Известно, что протоны оказывают положительное влияние на поглощение анионов. С другой стороны, было показано, что внесение в среду аммония также усиливает поглощение анионов растениями, вероятно, за счет высокой концентрации выделяющихся при этом в свободное пространство протонов. Изменения в ризосфере и рН внутри апопласта, происходящие в процессе поглощения ионов нитрата или аммония, оказывают значительное влияние на доступность и адсорбцию фосфора. Полагают, что увеличение поглощения фосфора на фоне аммонийного питания, в отличие от нитратного, является результатом снижения рН в экстраклеточном пространстве, что приводит к повышению соотношения ИОНОВ Н2РО4' к НРО4', следовательно, уменьшается возможность образования нерастворимого СаНР04*Н₂0 на поверхности корня.

Адсорбированные клеточной стенкой поливалентные катионы инги-бируют поглощение двухвалентных катионов, таких как Са . Кроме того, Снижение транспорта ионов Са²⁺ по апопласту может происходить также из-за уменьшения доступных сайтов его связывания на плазмалемме. Знак заряда пор апопласта может меняться из-за образования, например,

А1(ОН)₂⁺.

1.4.4 Корневой апопласт - поглощение питательных веществ и ближний транспорт ионов

Корневой апопласт выполняет многочисленные функции, важнейшими из которых являются поглощение воды и минеральных веществ. Питательные вещества не просто проходят через этот компартмент на пути к плазмалемме, но, благодаря физико-химическим свойствам этой структу-

ры, включаются в создание «внутренней физиологической среды» организма (Алехина и др., 2005).

Благодаря наличию отрицательных фиксированных групп в клеточной стенке в апопласте корня происходит накопление катионов и передвижение анионов. Особенно это важно для ди- и поливалентных ионов. Несмотря на то, что аккумуляция ионов в апопласте корня является не самым главным этапом в адсорбции питательных веществ, однако этот процесс помогает объяснить такие хорошо известные явления, как различие в К⁺/Са²⁺-обмене у разных видов растений, поглощение некоторых металлов, например, цинка и меди, преимущественно в ионной форме по сравнению с хелатированной формой (Haynes, 1980). В последнем случае, вероятно, существенную роль играет такой факт, как ограничение проникновения через поры клеточной стенки относительно больших молекул хелатов.

Связывание некоторых катионов металлов, например, меди, марганца, бора, цинка или железа, компонентами клеточной стенки может быть достаточно специфично. Например, медь может связываться в неионной форме с N-содержащими группами белков клеточной стенки, тогда как бор - с ди- и полиолами, главным образом, рамногалактуронана-И (O'Neill et al., 1996). Адсорбция ионов различными компонентами клеточной стенки приводит к их накоплению в этом компартменте, которое, как полагали ранее, оказывает значительное влияние на эффективность минерального питания растения. Однако на примере поглощения железа было показано, что его аккумуляция в апопласте корней сои не вносит существенного вклада в питание растений, поскольку железо практически полностью адсорбируется на внешней поверхности эпидермиса корня (Sattelmacher, 2001).

Участие компонентов клеточной стенки корня в поглощении труднорастворимого фосфата железа на бедных почвах было показано для арахиса (Sattelmacher, 2001). Полагают, что этот эффект обусловлен связывани-

ем ионов железа компонентами клеточной стенки корня, способствующим высвобождение фосфата. Эта точка зрения подтверждается тем, что насыщение корней растений ионами железа перед опытом снижает подвижность фосфата.

Благодаря особенностям свойств клеточной стенки корня состав ионов в растворе около плазмалеммы значительно отличается от таковых в ризосфере (Grignon and Sentenac, 1991). Это важно для понимания таких процессов, как ионный антагонизм или явный синергизм, как, например, между ионами Са и Н2РО4". Однако градиенты ионов возникают не только в результате особенностей свойств апопласта и поглощения ионов. На потоки ионов в апопласте значительное влияние оказывают процесс выхода ионов из клетки или активность ионных помп. Например, ионные градиенты формируются в тканях с повышенной активностью Н⁺-АТФазы или в результате десорбции Ca^2f вследствие повышения концентрации протонов (Canny, 1993).

Ионы диффундируют в клеточные стенки эпидермальных клеток, на плазмалемме которых может происходить их активное поглощение. Ионы могут транспортироваться далее через клетки коры, эндодерму и перицикл по симпласту (через плазмодесмы) или передвигаться пассивно по свободному пространству клеточных стенок коры, далее транспортироваться через плазмалемму клеток коры и эндодермы и входить в симпласт (Haynes, 1980).

Для некоторых ионов транспорт по апопласту имеет большее значение, чем для других. Хорошо растворимые одновалентные катионы, такие как К⁺, вероятно, попадают в свободное пространство корней, не вовлекаясь в адсорбционно-обменные процессы, поскольку, за исключением Н⁺, одновалентные катионы меньше адсорбируются, чем поливалентные. Поэтому полагают, что преобладающими катионами на электроотрицательных сайтах клеточной стенки являются Са²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, А1³⁺ и Н⁺, и это ис-

ключает наличие одновалентных катионов, особенно если они присутствуют в низких концентрациях (Haynes, 1980).

В апопласте корней главным барьером для диффузии ионов являются пояски Каспари. До настоящего времени полагали, что эти структуры полностью непроницаемы для воды и ионов. Однако результаты экспериментов свидетельствуют о том, что в молодых клетках корня пояски Каспари состоят в основном из лигнина. Этот полимер является гидрофильным соединением и поэтому в некоторых зонах корня пояски Каспари не представляют барьер для проникновения воды из корневого кортекса в стель (Sattelmacher, 2001). В зависимости от вида растения и возраста эндодерма и экзодерма содержат кутин и суберин в разных количествах. Химический состав поясков Каспари изменяется в процессе онтогенеза, так же как и в ответ на изменение окружающей среды. Неблагоприятные ионные условия, возникающие при солевом стрессе, ускоряют формирование эндодермы и поясков Каспари, что предотвращает избыточное поступление ионов в надземные органы по апопласту. Более того, эта роль поясков Каспари подтверждается данными о том, что во многих случаях соле-устойчивые виды имеют более утолщенные пояски по сравнению с менее толерантными видами растений.

В онтогенезе у большинства видов растений гиподерма превращается в экзодерму - формируются внешние пояски Каспари, которые в большинстве случаях содержат суберин. Формирование экзодермы происходит позже, чем эндодермы, и зависит в большей степени от условий роста, таких как, например, засоление. В соответствии с данными литературы значение экзодермы для поглощения воды и ионов до конца не установлено. Недавно было показано, что для некоторых элементов минерального питания, например, К⁺, она представляет значительный диффузионный барьер. Функции экзодермы состоит в предотвращении дегидратации при низком водном потенциале почвенного раствора, контроле процессов обмена рас-

творенных веществ между симбионтами. Показано, что экзодерма определяет устойчивость растений к патогенам. Экзодерма не образует непрерывный апопластный барьер. Наличие разрывов, индуцированных развитием боковых корней наряду с существованием пропускных клеток, предполагает, что питательные вещества могут диффундировать в КСП, которое занимает около 5% объема корня, несмотря на развитие экзодермы (Peterson and Enstone, 1996). Некоторые исследователи полагают, что роль апопласта в поглощении ионов корнями растений не велика. Увеличение адсорбирующей поверхности корня играет важную роль для поглощения питательных веществ, обычно находящихся в низких концентрациях в почвенном растворе, например, для фосфора или калия. Однако, благодаря большой поглощающей активности эпидермальных клеток, включая корневые волоски, ионы в ризосфере часто содержатся в минимальных концентрациях, при которых их поток внутрь клеток соответствует потоку из клетки (Jungk et al., 1982). Следовательно, и вклад КСП в минеральное питание растений для этих веществ будет достаточно низок.

Клеточная стенка представляет собой внешний компартмент растительной клетки, который первым сталкивается с влиянием неблагоприятных условий среды. Однако ответ растения на действие стрессора определяется не только особенностями свойств этого компартмента, но и способностью поддержания водного и ионного гомеостаза внутри клетки. В связи с этим необходимо рассмотреть влияние высоких концентраций солей с позиций повреждающего действия на рост растения на уровне клетки и целого организма, а также с точки зрения ответных реакций, направленных на формирование механизмов адаптации.

2. Рост растений в условиях засоления

В зависимости от ответа растений на действие высоких концентраций солей их разделяют на две большие группы: галофиты (натрофилы),

способные произрастать на засоленных почвах и полностью завершать жизненный цикл в этих условиях, и гликофиты (натрофобы), которые не выдерживают воздействие высоких концентраций солей (Taiz and Zeiger, 1998).

2.1. Повреждающее действие солей

Доминирующими ионами в засоленных почвах являются натрий и

хлорид. Несмотря на необходимость хлорида как микроэлемента для всех высших растений и натрия как элемента минерального питания для многих галофитов и некоторых Севидов, концентрация этих ионов в почвенном растворе часто превышает потребность растений в них и оказывает повреждающее действие на неустойчивые виды растений (Marschner, 1995). Высокие концентрации NaCl вызывают гиперосмотический стресс и ионный дисбаланс, которые, в свою очередь, приводят к вторичным стрессам (На-segawa et al, 2000; Zhu, 2001). При засолении почв в прикорневой зоне развивается низкий водный потенциал, влияющий на водный режим растений (Taiz and Zeiger, 1998). В этих условиях наблюдается уменьшение доступности и поглощения воды растениями и, таким образом, снижение транспорта воды и питательных веществ (таких как фосфор, железо, цинк), а также ингибирование роста почвенных симбиотических микроорганизмов (Tester and Davenport, 2003). Водный дефицит, возникающий в условиях засоления (осмотический стресс), также как и при засухе, приводит к дегидратации клеток. Ионная токсичность, связанная с увеличением соотношения концентраций натрия к калию в цитоплазме (ионный стресс) и, следовательно, вызывающая дефицит калия в растениях, проявляется в резком изменении направления метаболических процессов (Taiz and Zeiger, 1998). Полагают, что осмотическое и токсическое действия солей приводят к дисбалансу элементов минерального питания вследствие уменьшения поглощения и/или транспорта ионов к надземным органам, а также из-за нарушения распределения минеральных элементов, в частности кальция

(Marschner, 1995). Снижение поглощения элементов минерального питания при засолении может происходить как за счет непосредственного влияния Na⁺ на транспортные белки плазмалеммы корней (например, на К⁺-селективные каналы), так и в результате ингибирования роста корней вследствие осмотического действия NaCl или нарушения структуры почвы (Tester and Davenport, 2003). Природа токсического действия ионов Na⁺ и С1", особенно первичных молекулярных повреждений, слабо изучена. Известно, что при высоких концентрациях они могут дезинтегрировать клеточные мембраны, подавлять активность ферментов и приводить к нарушениям важных физиологических процессов (Zhu, 2001). Высокие концентрации солей (более 0,4 М NaCl) ингибируют многие ферменты, вероятно, вследствие нарушения гидрофобно-электростатического баланса сил, поддерживающих структуру белковых молекул. Однако токсический эффект проявляется уже при более низких концентрациях (около 0,1 М), указывая на наличие специфических мишеней действия солей. Хлорид может внедряться в места связывания анионов, таких как РНК, и многих метаболитов (бикарбонатов, карбоксилатов и сахарофосфатов). В свою очередь, натрий конкурирует с К⁺, Са⁺², Mg⁺² за сайты связывания катионов (Serrano et al., 1999).

В условиях избытка солей изменяется интенсивность и направленность обмена веществ, происходит образование и накопление разнообразных промежуточных продуктов обмена в таких концентрациях, которые не свойственны нормально функционирующему организму. Одни из этих веществ оказывают токсическое действие на клетку (аммиак, диамиды и др.), тогда как другие выполняют защитные функции (сахара, органические кислоты, полиамины). Следовательно, в условиях избытка солей в обмене веществ возникают две противоположные тенденции. С одной стороны, изменение обмена веществ обусловливает патологическое состояние клетки, нередко приводящее к ее гибели, а с другой - способствует возникно-

вению ответных реакций, направленных на формирование механизмов адаптации, которые позволяют преодолевать или избегать неблагоприятного воздействия (Строганов и др., 1970). Повреждающие эффекты и механизмы адаптации образуют сложную систему, включающую изменения функциональной организации растения от молекулярного уровня до уровня целого организма.

Изменение обмена веществ у растений в условиях засоления нередко находит свое отражение в ультраструктуре органелл клетки. В частности, повышение при солевом стрессе содержания РНК и ДНК сопровождается увеличением объема ядра и ядрышка. Показано, что различные органеллы клетки по-разному реагируют на действие NaCl: наиболее устойчивы к солям митохондрии, затем ядра и наименее устойчивы хлоропласты. Различия в устойчивости органелл, очевидно, и определяют специфику обмена веществ клетки в этих условиях (Косулина и др., 1993).

В условиях засоления NaCl в клетках увеличивается отношение органического фосфора к неорганическому, повышается интенсивность дыхания растительных тканей при одновременном снижении интенсивности накопления биомассы, которое не сопровождается разобщением в цепи окислительного фосфорилирования. Засоление питательной среды резко нарушает метаболизм серы в растениях. Это в значительной степени может быть обусловлено изменением нативной конфигурации ферментных белков и, как следствие, частичной или полной потерей их активности. У растений в условиях солевого стресса изменение содержания свободных сульфгидрильных и дисульфгидрильных соединений зависит как от осмотического, так и токсического влияния солей на окислительно-восстановительную систему клетки (Косулина и др., 1993).

Рассматривая причину патологического состояния клеток при солевом стрессе, следует подчеркнуть, что вещества, оказывающие токсическое действие на растение, накапливаются преимущественно в результате

Р0ССИИО AW

ГОСУД'РСТГ.ГИНЛЯ

[,.!'> ЛИОН I А

резкого нарушения азотного обмена. Вследствие подавления синтеза белков или активизации их распада происходит накопление аммиака, повышается содержание некоторых аминокислот, сульфоксидов и сульфонов. В условиях засоления накопление этих веществ может вызвать у растений морфологические изменения, своеобразную окраску некрозов и гибель клеток (Строгонов, 1973).

Полагают, что нарушение синтеза белков при водном дефиците или избытке ионов может быть вызвано Ыа⁺/К⁺-дисбалансом или хлоридной токсичностью для чувствительных к этому иону видов (Marschner, 1995). Более 50 ферментов в клетке активируются в присутствии калия, и его высокая концентрация (100-200 мМ) в цитоплазме по сравнению с натрием (10-30 мМ) обеспечивает оптимальные ионные условия для функционирования различных ферментов и процесса синтеза белка. Так, в частности, для связывания т-РНК с рибосомами требуется высокая концентрация калия. Следовательно, в условиях солевого стресса увеличение концентрации натрия или Ыа⁺/К⁺-отношения в цитоплазме приводит к нарушению различных энзиматических процессов (Tester and Davenport, 2003). Неблагоприятное влияние засоления на процесс синтеза белка и на содержание калия может быть уменьшено введением КС1, несмотря на дальнейшее увеличение осмотического потенциала и концентрации хлорида (Marschner, 1995).

2.2 Причины снижения роста растений при солевом стрессе

Высокие концентрации NaCl, подобно многим другим стрессорам, подавляют рост растений. Ингибирующее воздействие солевого стресса на рост растений проявляется на разных уровнях организации организма и вовлекает множество клеточных процессов. Солевой стресс влияет на экспрессию генов клеточного цикла и, следовательно, на деление клеток, вызывает нарушения тургора клеток, и, таким образом, воздействует на рост

клеток растяжением. Некоторые авторы полагают, что изменения в гормональном статусе, происходящие в этих условиях, могут оказывать регуля-торное воздействие на указанные процессы (Xiong and Zhu, 2002). При засолении в тканях растений уменьшается концентрация рост-стимулирующих гормонов, таких как ауксин, цитокинин, гиббереллины и брассиностероиды и увеличивается концентрация АБК (Marschner, 1995). Такие изменения в составе гормонов приводят к стимуляции механизмов устойчивости растений. Полагают, что замедление роста при солевом стрессе является не столько проявлением повреждающего действия NaCl, сколько результатом адаптивных ответов, способствующих выживанию растений в стрессовых условиях, поскольку освобождает множество ресурсов (энергии и веществ), необходимых для реализации защитной программы. Такая точка зрения подкрепляется тем, что степень устойчивости растений к солевому стрессу часто характеризуется обратной корреляцией со скоростью роста (Zhu, 2001, Tester and Davenport, 2003).

Одной из причин снижения скорости роста, возникающего при высоких концентрациях Na⁺ и/или СГ в хлоропластах, является ингибирование процесса фотосинтеза. Несмотря на то, что электрон-транспортная цепь фотосинтеза относительно не чувствительна к действию солей, процессы метаболизма углерода и фосфорилирования подвержены влиянию засоления (Taiz and Zeiger, 1998). Низкая скорость ассимиляции углекислоты в световой период при засолении может быть вызвана водным дефицитом, который приводит к потере тургора клетками листьев и, в частности, замыкающими клетками устьиц, и, следовательно, к закрыванию устьиц. В снижении тургорного давления замыкающих клеток в этих условиях, наряду с непосредственным действием соли, принимают участие процессы, индуцируемые АБК. Накапливающийся в замыкающих клетках гормон ин-гибирует РҐ-АТФазу, приводя к деполяризации ПМ, что, в свою очередь, влияет на активность входящих и выходящих К⁺- и СГ-каналов, вызывая

отток этих ионов из замыкающих клеток с сопутствующей потерей тургора и закрытием устьиц (Blatt, 2000). Этот эффект способствует сохранению оводненности клеток, но приводит к снижению скорости фотосинтеза и ингибированию роста растений. Другой причиной, оказывающей влияние на процесс фотосинтеза в условиях засоления, может быть ингибирующее действие NaCl на эффективность транслокации и ассимиляции продуктов фотосинтеза. Оба этих процесса регулируются гормонами. Таким образом, и в этом случае рост растений может в значительной степени контролироваться гормональным гомеостазом (Xiong and Zhu, 2002). Известно много примеров стимулирования роста растений обработкой цитокининами и гиббереллинами при выращивании на солевом субстрате (Marschner, 1995).

Полагают также, что одним из факторов, способствующих снижению роста, является высокая чувствительность растений к хлориду, а не водный дефицит. Вероятно, что токсичность натрия не так широко распространена, как хлоридная токсичность, и, главным образом, связана с низкими концентрациями кальция в субстрате или плохой аэрацией почвы. Несмотря на то, что высокие концентрации хлорида могут ингибировать поглощение нитрата, дефицит азота при засолении не является основной причиной ингибирования роста растений (Marschner, 1995).

Высокая концентрация NaCl и водный дефицит могут ингибировать рост растений, влияя на процессы деления и дифференцировки клеток. Подавление роста при этом сопряжено с экспрессией некоторых генов, индуцируемых стрессорным воздействием и не экспрессирующихся в нормальных условиях. К таким генам относятся, например, CBF1, DREB1 и ICK1 у Arabidopsis thaliana (Cushman and Bohnert, 2000). Продукты этих генов ин-гибируют процессы клеточного деления и растяжения и таким образом замедляют рост. Так, белок ICK1 ингибирует циклин-зависимые протеинки-назы, вовлеченные в индукцию клеточного цикла. Солевой стресс может ингибировать деление клеток, вызывая накопление АБК, которая, в свою

очередь, приводит к индукции экспрессии ICK1. Стрессовые факторы также воздействуют на процесс деления путем транскрипционной и/или посттранскрипционной регуляции других компонентов клеточного цикла (Zhu,2001).

Засоление, подобно многим другим стрессовым воздействиям, приводит к увеличению в тканях концентрации активных форм кислорода (АФК): перекиси водорода, гидроксил-радикалов, супероксиданионов (Xiong and Zhu, 2002). Наблюдающиеся в этом случае токсические эффекты происходят не из-за непосредственного действия ионов Na⁺ или СГ на молекулярные мишени, а являются результатом вторичных стрессов -взаимодействий биополимеров с накапливающимися АФК. У чувствительных к засолению видов увеличивается содержание малонового диальдеги-да - продукта перекисного окисления липидов (Meloni et al., 2003). Механизмы, отвечающие за образование АФК при воздействии абиотических факторов среды, изучены недостаточно и во многих случаях неясны. Полагают, что причиной образования АФК является снижение интенсивности фотосинтеза вследствие закрывания устьиц и перевосстановление электрон-транспортной цепи. Кислород принимает лишние электроны с электрон-транспортной цепи фотосинтеза и вызывает окислительный стресс (Meloni et al., 2003). АФК оказывают повреждающее действие на различные структуры клетки и макромолекулы, такие как липиды, ферменты и ДНК. Следовательно, механизмы детоксикации АФК будут способствовать достижению солетолерантности, а также устойчивости к другим стрессорам (Hasegawa et al., 2000). В ответ на действие высоких концентраций солей в растениях синтезируются шоковые белки и осмолиты. Функции этих соединений, вероятно, заключаются в детоксикации растений через связывание активных форм кислорода или через предупреждение повреждения клеточных структур (Yokoi et al., 2002). Большинство солеустойчивых трансгенных растений получено с использованием такой стратегии деток-

сикации. У этих растений наблюдают сверхэкспрессию ферментов, вовлеченных в процессы защиты от окисления: глутатионпероксидазы, суперок-сиддисмутазы, каталазы, аскорбатпероксидазы и глутатионредуктазы (Zhu, 2001).

Солевой стресс может приводить к повреждениям ДНК, т.е. к гено-токсичности. Связь этого процесса с влиянием NaCl была выявлена в результате изоляции мутанта арабидопсиса uvs 66 (Zhu, 2002). Этот мутант оказался гиперчувствительным к УФ-С и повреждающим ДНК агентам -метилметансульфонату и митомицину. Интересно, что рост корней проростков мутантных растений был также чувствительным к воздействию NaCl и АБК. Показано, что солечувствительность мутанта является специфичной к NaCl, а не к общему действию осмотического стресса (Xiong and Zhu, 2002). Полагают, что пути трансдукции сигнала, запускаемые разными стрессорными факторами (солевым стрессом и генотоксичностью), вероятно используют одни и те же компоненты, например МАРК-модули (Zhu, 2002).

Известно, что солевой стресс приводит к увеличению эндогенного уровня АБК. Экзогенная обработка растений и отдельных тканей АБК повышала их солеустойчивость. На уровне целого растения АБК снижает ин-гибирование роста, вызванное высокими концентрациями NaCl. Было показано, что в этих условиях увеличение содержания АБК является важным фактором для поддержания активности роста первичных корней в целях согласованного регулирования роста целого растения (Xiong and Zhu, 2002). Полагают, что при низком водном потенциале важная роль АБК в обеспечении роста корней и надземных органов состоит в ограничении образования этилена и, следовательно, в снижении его ингибирующего влияния на рост клеток растяжением (Shi et al., 2002). На молекулярном уровне АБК индуцирует экспрессию большого числа генов. Некоторые из них кодируют различные регуляторные компоненты, участвующие в трансдук-

ции сигнала, такие как рецепторные белки, протеинкиназы/фосфатазы и транскрипционные факторы (Zhu, 2002). Другие кодируют эффекторные молекулы, например, Н⁺-АТФазы, аквапорины, ферменты синтеза осмоли-тов, приводящие к реализации защитных программ (Xiong and Zhu, 2002). Мутантные растения, дефектные по АБК и другим гормонам, или с изменениями в пути трансдукции сигнала являются удобным инструментом для анализа роли гормонов в адаптации растений к засолению (Hasegawa et al., 2000).

2.3 Роль натрия и хлорида в минеральном питании растений

В зависимости от способности к росту в присутствии ионов натрия, поглощения Na⁺ корнями и их дальнего транспорта к побегам растения можно охарактеризовать как натрофильные и натрофобные. Различия в поглощении Na⁺ корневыми системами связаны с разной активностью на-трий-выводящих транспортных механизмов, проницаемостью плазматической мембраны корней для натрия и др. При рассмотрении роли ионов натрия в минеральном питании растений следует уделить внимание трем аспектам: 1) натрий - как необходимый элемент питания для определенных видов растений; 2) степень замещения натрием функций калия; 3) усиление роста растений в присутствии Na⁺ в среде (Marschner, 1995).

В соответствии с влиянием Na⁺ на характер роста растений и степенью замещения им функций К⁺, а также в зависимости от ответа на действие высоких концентраций СГ в среде растения разделяют на несколько групп (Marschner, 1995, White and Broadley, 2001):

1 группа - большая часть К⁺ может замещаться Na⁺. У этой группы ионы натрия и хлорида стимулируют рост растений, который не может быть достигнут за счет увеличения содержания К⁺ в среде. К ней относятся экстремальные галофиты семейства Chenopodiaceae (например, Suaeda maritima, Atriplex nummularia и многие Сг травы);

2. группа - меньшее количество К⁺ может быть замещено на Na⁺ по сравнению с первой группой, а в присутствии ионов натрия и хлорида до 200 мМ происходит незначительное усиление роста. Растения этой группы выдерживают концентрации NaCl до 200 мМ (Atriplex hastata, Spartina spp., сахарная свекла, капуста, редис, горох, шпинат, лен, пшеница);

3. группа - замещение К⁺ на Na⁺ может происходить только в ограниченной степени, и последний не оказывает стимулирующего влияния на рост растений. К этой группе относятся галофиты и гликофиты, рост которых значительно подавляется в присутствии 100 мМ NaCl. В этой группе можно выделить толерантные растения {Festuca rubris, Puccinella peisonis, хлопок, ячмень, рис, райграс), промежуточные (томаты) и чувствительные (кукуруза, соя, бобы, тимофеевка, рожь);

4. группа - замещение К⁺ на Na⁺ невозможно. К этой группе принадлежат гликофиты, крайне чувствительные к засолению (цитрусовые и древесные растения).

Степень замещения калия на натрий в натрофильных видах растений различается между отдельными органами и клеточными компартментами, зависит от возраста и жизненной стадии растений. Однако не все функции К⁺ могут быть обеспечены Na⁺. Например, для процесса трансляции м-РНК пшеницы на рибосомах необходима определенная концентрация (100-200 мМ) К⁺, и это требование не зависит от степени солеустойчивости различных генотипов пшеницы. В натрофобных видах Na⁺ не может замещать функции К⁺.

На примере большого числа сельскохозяйственных культур было показано, что более солеустойчивые виды обладают большей способностью исключать Na⁺ из клеток тканей листьев и поддерживать высокий уровень К⁺ в них (Zhu, 2001). При засолении скорость роста листьев большинства злаковых культур отрицательно коррелировала с концентрацией Na⁺ в клетках листьев. Однако, в отличие от однодольных, для двудольных ви-

дов растений не всегда была характерна подобная корреляция. Например, солеустойчивый дикий вид томата Lycopersicon peruvianum накапливал больше Na⁺ в тканях надземных органов по сравнению с культурным видом L. esculentum. Подобная корреляция не всегда характерна и для гало-фитов. Двудольные галофиты накапливают большое количество NaCl в вакуолях клеток тканей побегов и используют Na⁺ в качестве главного осмо-лита для создания необходимого осмотического потенциала (Flowers and Yeo, 1988). Так, например, у галофитов семейства Chenopodiaceae высокая солеустойчивость основывается на накоплении большого количества (1-1,5 М) солей в тканях надземных органов и использовании Na⁺ для поддержания тургора и замещения функций К⁺ (Marschner, 1995). Адаптация, основанная на такой стратегии использования ионов натрия и хлорида, подразумевает высокую толерантность тканей к этим ионам.

У солеустойчивых видов растений при высоком засолении значительно увеличивается способность вакуолей клеток мезофилла листьев к накоплению Na⁺ и СГ. Это происходит за счет увеличения размера клеток, особенно вакуоли, и, таким образом, происходит «разбавление» солей и предотвращение или, по крайней мере, замедление накопления ионов в апопласте и цитоплазме листьев. В условиях засоления у типичных представителей галофитов наблюдается усиление роста и увеличение эндогенного содержания СГ и особенно Na⁺ в тканях побега при увеличении концентрации NaCl в наружной среде.

Однодольные галофиты поглощают меньше Na⁺ по сравнению с двудольными и способны поддерживать высокую концентрацию К⁺ в тканях надземных органов. В этом случае необходимое осмотическое давление в клетках достигается за счет синтеза Сахаров. Однако, несмотря на то, что двудольные галофиты накапливают большое количество NaCl, это не означает, что они транспортируют натрий с более высокой скоростью, чем солечувствительные растения.

Другим адаптивным ответом факультативных гал офитов на действие солевого стресса является переключение Сз-пути фотосинтеза на САМ. При этом значительно снижается транспирация и транспорт ионов в надземные органы.

Ограничение поступления Na⁺ и СГ в молодые листья и генеративные ткани - еще одно важное свойство солетолерантных видов. У таких растений устойчивость определяется способностью поддерживать градиент этих ионов между старыми и молодыми листьями, при этом общее содержание солей Na⁺ в тканях не играет существенной роли. Высокое содержание К⁺ по сравнению с Na⁺ в молодых листьях и репродуктивных органах обеспечивается низким поступлением ионов в ксилему и значительной рециркуляцией К⁺ из флоэмы от зрелых листьев (Marschner, 1995).

Выведение Na⁺ и СГ из клеток тканей надземных органов - главное направление адаптации гликофитов. Однако определение гликофитов, как солевыводящих растений, относительно и подразумевает более низкие скорости поглощения и транспорта солей из корней в надземные органы по сравнению с соленакапливающими видами. Было показано, что более высокая чувствительность гороха по сравнению со шпинатом вызвана не только усиленным контролем транспорта Na⁺ и СГ в надземные органы у шпината, но и поддержанием низких концентраций ионов в апопласте листьев. Рост гликофитов ингибируется при сильном засолении, несмотря на то, что содержание ионов натрия и хлорида в тканях надземных органов остается относительно низким (Marschner, 1995).

Многие солечувствительные виды способны эффективно исключать ионы натрия из поглощения, то есть ограничивать их транспорт к надземным органам, но не обладает такой способностью по отношению к хлорид-ионам. Поэтому даже при небольшом уровне засоления токсичность СГ является главной причиной снижения роста этих растений (Marschner, 1995). Механизмы, ограничивающие транспорт Na⁺ и СГ к надземным ор-

ганам, должны функционировать как на уровне корня, так и на пути от корней к побегам. Рециркуляция Na⁺ из надземной части растения к корням может обеспечивать его низкое содержание в тканях побегов как соле-устойчивых, так и солечувствительных видов (Tester and Davenport, 2003). Адаптация с использованием стратегии выведения Na⁺ и СГ из тканей надземных органов требует наличия механизмов, обеспечивающих избежание водного дефицита. У гликофитов это достигается за счет повышения в клетках синтеза органических растворенных веществ (сахаров, аминокис-лот) или увеличения скорости поглощения К , Са или NO3'.

Полагают, что принципиальное отличие между двумя группами растений заключается в способности галофитов выдерживать солевой шок. Это позволяет им быстрее, по сравнению с гликофитами, устанавливать новое метаболически устойчивое состояние для поддержания роста в условиях засоления (Hasegawa and Bressan, 2000). Однако ответ на солевой стресс и, по крайней мере, способность к установлению нового устойчивого состояния не являются уникальными для галофитов, поскольку на уровне клетки и целого растения гликофиты проявляют значительную толерантность при условии, что стресс действует постепенно (Amzallag et al., 1990). Возможно, главным преимуществом галофитов по сравнению с гликофитами является не более эффективное распределение натрия, а более эффективное регулирование потоков этого иона, скоординированное с процессами, контролирующими рост, как на клеточном уровне, так и на уровне целого растения (Hasegawa and Bressan, 2000).

Контроль процесса транспорта натрия может осуществляться на нескольких уровнях: поглощения и поступления в побеги, а также распределения между тканями надземных органов. Например, растения могут: 1) уменьшить поглощение Na⁺; 2) увеличить его выход из клетки; 3) снизить поступление Na⁺ в ксилему или увеличить его отток из нее до того, как этот ион достигнет тканей надземных органов; 4) увеличить рециркуляцию

Na⁺ из тканей побега во флоэму; 5) усилить внутриклеточную компартмен-тацию NaCl или его распределение в определенные части побега (например, клетки сердцевины или старые листья); 6) секретировать соли на поверхность листьев (Tester and Davenport, 2003).

Физиологические функции и биохимические процессы у галофитов и гликофитов скорее различаются в количественном отношении, чем в качественном (Yeo, 1998). Толерантные к засолению растения обладают более эффективными по сравнению с солечувствительными растениями системами (синтеза осмолитов, ионного гомеостатирования и детоксикации) для предотвращения повреждающего воздействия солевого стресса.

2.4 Влияние засоления на рост растений из семейства Fabaceae

В соответствии с влиянием засоления на рост растений бобовые культуры относят к солечувствительным гликофитам (Singla and Garg, 2005, Raptan et al., 2001a, b, Baalbaki et al., 2000). Концентрация хлористого натрия в среде 100 мМ вызывает значительное ингибирование роста чувствительных к данному стрессору растений. Однако ответ к засолению зависит от возраста растения, поэтому разные стадии жизненного цикла характеризуются различной устойчивостью к засолению. Например, более высокая чувствительность растений чечевицы и фасоли проявляется на стадии прорастания семян по сравнению с последующими фазами жизненного цикла, тогда как для гороха отмечается обратная закономерность (Saxena et al., 1994). На примере растений Vigna radiata было показано, что наибольшая чувствительность к засолению проявляется в виргинильный период роста, дальнейшие стадии характеризуются большей устойчивостью (Minnas etal., 1990).

Одним из тестов для оценки степени солеустойчивости растения является прорастание семян. При этом используют такие параметры, как общее прорастание семян, скорость их прорастания, а также время, необхо-

димое для прорастания 10% семян от максимально возможного числа (Sol-tani et al., 2002). Полагают, что способность семян к прорастанию и дальнейшее появление проростков во время действия солевого стресса являются генетически детерминированными характеристиками, по крайней мере, на этой стадии жизненного цикла. Было показано, что высокие концентрации солей замедляют прорастание семян гороха, фасоли и сои (Essa, 2002, Saxena et al., 1994). Полагают, что это связано в большей степени с влиянием осмотической компоненты солевого стресса, нежели токсическим эффектом. На основании результатов экспериментов с прорастанием семян солеустойчивость бобовых растений уменьшается в ряду: фасоль> чечеви-ца> горох (Saxena et al., 1994). Горох является чувствительным к засолению растением, особенно на стадии прорастания семени. Полагают, что недружное появление всходов, а также их изреженность на засоленных почвах может быть вызвано повреждением гипокотиля и семядолей в процессе их пробивания через почвенные слои за счет неблагоприятного влияния высокого содержания солей преимущественно в верхнем слое почвы. Увеличение концентрации солей в воде для орошения приводит к большему проценту повреждения гипокотиля проростков гороха и люцерны (Esechie et al., 2002).

Известно, что не только разные виды растений, но и различные сорта одной и той же культуры могут значительно варьировать по степени устойчивости к какому-либо стрессору и наследственно сохраняют свой уровень устойчивости в поколениях. Результаты экспериментов показывают, что характеристики прорастания разных сортов гороха при разном уровне засоления внешнего раствора имеют существенные отличия: более соле-устойчивый сорт гороха характеризуется более высоким процентом прорастания, более высокой скоростью прорастания и значительно меньшим временем, необходимым для прорастания 10% семян от максимально возможного числа (Soltani et al., 2002).

Другим критерием для оценки степени устойчивости растений к засолению является накопление биомассы и определения пороговых концентраций NaCl, при которых начинается снижение роста и урожайности растений. В соответствии с этой тест-системой был получен такой же ряд со-леустойчивости бобовых культур: фасоль>чечевица>горох (Saxena et al., 1994). При увеличении концентрации NaCl в питательном растворе происходит существенное ингибирование роста солечувствительных гликофитов, которое выражается в снижении высоты растений, толщины побегов и, следовательно, в накоплении сухой массы (Essa, 2002, Tester and Davenport, 2003). С увеличением уровня засоления внешнего раствора от 0,5 до 8,5 dSm'¹ происходило уменьшение высоты растений солетолерантного сорта сои на 34%, а солечувствительного сорта - на 47%, при этом снижение сухой массы надземных органов составило 34% и 53% соответственно (Essa, 2002). Кроме того, было показано, что рост корней растений сои в меньшей степени подвержен повреждающему действию солей по сравнению с надземными органами. Полагают, что корни растений сои обладают большей устойчивостью к засолению, чем побеги (Cordovilla et al., 1995).

Сравнение разных по солеустойчивости сортов (Jam и Кака) гороха Cicer arietinum показывает, что более чувствительные к засолению растения имеют меньшую толщину проростков и более низкую скорость их роста. Предполагают, что ингибирование роста проростков при засолении может быть обусловлено снижением скорости и/или эффективности утилизации запасных питательных веществ семени. Показано, что увеличение осмотического давления почвенного раствора приводит к уменьшению скорости роста проростков гороха, в первую очередь, за счет ограничения мобилизации запасных веществ семядолей, нежели эффективности их дальнейшего превращения в ткани растения (Soltani et al., 2002).

Результаты многочисленных экспериментов свидетельствуют, что размер семени оказывает значительное влияние на дальнейший рост про-

ростков. На примере растений Medicago sativa, Vicia sativa, Cicer arietinum было показано, что в стрессовых условиях крупные семена дают более сильные и устойчивые проростки по сравнению с мелкими семенами (Cash and Ditterline, 1996). Вероятно, подобный эффект обусловлен более высоким содержанием запасных питательных веществ в больших по размеру семенах и их способностью быстрого обеспечения энергией дальнейших процессов роста проростка.

С увеличением уровня засоления у растений гороха Cicer arietinum происходит значительное снижение накопления сухой массы и поглощения фосфора, цинка и железа. Это обусловлено тем, что высокие концентрации солей в почве приводят к уменьшению водного потенциала, а, следовательно, к снижению доступности и поглощения воды растениями и, таким образом, к ограничению транспорта воды и питательных веществ (Tester and Davenport, 2003). Полагают, что уменьшение поглощения фосфора растениями гороха вызвано снижением его подвижности, а также подавлением роста корней при засолении и уменьшении поверхности корневой системы, контактирующей с частицами почвы. Причиной снижения поглощения железа растениями, вероятно, является его преципитация в виде сульфата железа благодаря более высокой доступности сульфат-иона на засоленных почвах (Dravid and Goswami, 1987). Внесение в среду для выращивания гороха макро- и микроэлементов способствует увеличению накопления биомассы растениями, поглощения и эффективности использования фосфора, железа и цинка.

Увеличение концентрации NaCl в среде приводит к значительному повышению содержания ионов натрия и хлорида в листьях растений разных по устойчивости сортов сои. При этом солетолерантный сорт обладает способностью поддерживать более низкие концентрации этих ионов, более высокое содержание ионов калия и К⁺/Ыа⁺-отношение в тканях листьев по сравнению с солечувствительным сортом. Солевой стресс также приводит

к снижению накопления калия, кальция и магния в листьях разных сортов сои (Essa, 2002). Полагают, что механизм, отвечающий за выведение хлорида из тканей растений, функционирует на уровне корня. Было показано, что солечувствительные сорта по сравнению с солетолерантными обладают более высокой скоростью поглощения хлорид-ионов, даже при низких концентрациях солей в растворе, и меньшим контролем загрузки этих ионов в ксилему (Essa, 2002). В присутствии 50 мМ NaCl в среде у растений фасоли также наблюдается снижение поглощения калия и изменение ком-партментации этого иона в пределах растения (Gouia et al., 1994). Кроме того, происходит значительное ингибирование поглощения нитрата, уменьшение скорости ксилемного транспорта этого иона, а также скорости его восстановления в надземных органах и снижение скорости ксилемного и флоэмного транспорта продуктов ассимиляции азота.

Известно, что в ответ на действие солевого стресса в растениях осуществляется синтез осмолитов, в качестве которых могут выступать 3 типа соединений, различающихся по химической природе: бетаины и родственные им соединения, сахара и аминокислоты (Serrano et al., 1999). Следует отметить, что помимо осморегуляторной функции некоторым из вышеуказанных соединений отводят роль протекторов. Показано, что основными осмолитами для растений из семейства бобовых являются пролин-бетаин, диметилпролин (стахидрин), в незначительных количествах также обнаружены глицин-бетаин, гидроксипролин-бетаин, тригонеллин, гомоста-хидрин (Wood et al., 1991). Увеличение концентрации хлористого натрия в среде до 0,2 мМ способствует значительному накоплению пролина и про-лин-бетаина в корнях и надземных органах растений люцерны Medicago sativa. Результаты экспериментов свидетельствуют, что аккумуляция про-лин-бетаина в тканях люцерны отражает долговременный ответ растений к условиям засоления, который, в свою очередь, связан с накоплением пролина (Trinchant et al., 2004).

Структурная организация клеточной стенки

Результаты анализа изменений полисахаридов матрикса клеточных стенок гороха Pisum sativum, происходящих в процессе ауксин-индуцированного растяжения клетки, свидетельствуют, что модель, предложенная для культуры клеток явора, не подходит для описания организации первичных клеточных стенок растений гороха. Данные экспериментов, полученные на клеточных стенках, изолированных из стеблей гороха и анализированных методом гельпроникающей хроматографии, показали отсутствие во фракции пектинов рамногалактуронана I и II с массами 100 kD и 5-Ю kD, соответственно (Talbott and Ray, 1992). Пик полиуронидов пектина характеризуется молекулярной массой 1100 kD, при этом пектины составляют 40% от массы клеточной стенки гороха. Было показано, что большая часть (86%) нейтральных Сахаров пектинов, преимущественно арабинозы и галактозы, ковалентно связана с полиуронидами, также как в RG-II и RG-I. Однако более высокое содержание уроновых кислот во фракции пектинов, чем у RG-II и RG-I, и высокое соотношение уроновых кислот к рамнозе (по сравнению с ожидаемым соотношением 1:1 для RG-I и 2,5:1 для RG-II) свидетельствует о том, что главным компонентом пектиновых веществ гороха является гомогалактуронан. Он составляет около 82% от общего содержания полиуронидов пектина или 37% от чистой фракции пектина (Talbott and Ray, 1992). Результаты других исследований свидетельствуют, что клеточные стенки гороха содержат рамногалактуро-нан-Н в количестве 8,5 % от общего содержания пектинов (Darvill et al., 1978). Вероятно, рамногалактуронан-І также присутствует в клеточных стенках гороха, поскольку этот полимер широко распространен в первичных клеточных стенках семян, и его содержание в два раза больше по сравнению с рамногалактуронаном-П (Carpita and Gibeaut, 1993).

Известно, что выделение полимеров RG-II и RG-I из клеточной стенки можно осуществить путем ферментативной деструкции с помощью эн-дополигалактуроназы, гидролизующей гомогалактуронан (McNeil et al., 1990). Этот факт и результаты других экспериментов позволяют предположить, что пектины содержат разветвленные блоки рамногалактуронана и линейные блоки гомогалактуронана (Thibault, 1983). Это точка зрения подтверждается данными, свидетельствующими о том, что в процессе хроматографии нейтральные сахара рамногалактуронана выделяются вместе с уроновыми кислотами (большинство из которых принадлежат гомогалак-туронану, как было отмечено выше) в виде отдельного пика. Расчеты показывают, что если размер блоков RG-II и RG-I полимеров гороха соответствуют таковым для клена явора, то в среднем молекула пектина массой около 1100 kD может содержать не более двух таких блоков RG-I и 25-40 блоков RG-II (Talbott and Ray, 1992).

Фракция гемицеллюлозы, которая составляет 30% от массы первичной клеточной стенки гороха, в отличие от пектинов содержит значительные количества глюкозы и ксилозы (Talbott and Ray, 1992). Эти данные согласуются с результатами ранних исследований, свидетельствующих о том, что основная масса ксилоглюканов принадлежит гем и целлюлозам (Hayashi and Maclachlan, 1984). Пик ксилоглюкана клеточных стенок гороха характеризуется молекулярной массой 30 Ш, следовательно, его углеводный скелет может содержать около 180 остатков глюкозы. Кроме того, было показано, что галактоза и арабиноза также являются главными составляющими гемицеллюлозы. Фракция гемицеллюлозы содержит араби-ногалактан, включающий почти половину арабинозы и две третьих галактозы от общей массы матрикса клеточных стенок гороха (Talbott and Ray, 1992). Полагают, что арабиногалактан состоит из связанных между собой, вероятно, гликозидными связями, цепочек галактана и арабинана. В настоящее время арабиногалактаны чаще относят к пектиновым веществам клеточной стенки. Однако в работах более ранних лет (Lorences et al., 1987, Redgwell and Selvendran, 1986) было обнаружено, что галактоза и арабиноза являются важными компонентами гемицеллюлозы, и в процессе хроматографии не удавалось разделить арабиногалактаны от других составляющих гемицеллюлоз. Результаты, полученные при анализе хроматограмм фракции гемицеллюлозы гороха, отчетливо показывают наличие в ней хорошо разделяемых между собой полимеров арабиногалактана и ксилоглюкана. Следовательно, говоря о структурной организации клеточной стенки, необходимо считать арабиногалактаны важным компонентом гемицеллюлозы.

На основании данных ряда исследований можно полагать, что модель, согласно которой между полимерами матрикса имеются ковалентные связи, не адекватно отражает структурную организацию первичных клеточных стенок двудольных растений и механизм процесса роста клетки растяжением (Jarvis et al., 1981, O Neill and Selvendran, 1983, Ring and Selvendran, 1981). Вероятно иная гипотеза, свидетельствующая о существовании нековалентых ассоциаций молекул полимеров, например, между пектиновыми веществами, экстенсинами и пектинами, между ксилоглюка-нами и целлюлозой, уместна для объяснения механического сцепления полимеров растущей клеточной стенки. Эта концепция была выдвинута много лет назад (Preston, 1979), в настоящее время некоторые исследователи снова возвращаются к ее рассмотрению и используют для описания моделей организации клеточных стенок.

Проращивание семян разных сортов нута

Объектами исследования служили семена нута Cicer arietinum L. сорта Bivanij, 1LC482, Hachem. Отобранные семена стерилизовали в растворе КМп04, а затем проращивали в чашках Петри между двумя слоями влажной фильтровальной бумаги (25 семян в каждой чашке) на растворах разной концентрации NaCl: 0 (контроль), 40, 80, и 120 мМ. Прорастание семян проводили в термостате при 23С в течение 7 дней, после чего подсчитывали количество проросших семян. В расчет принимали семена, у которых длина корешка и плюмулы составляли более 5 мм.

Выделение полимерного матрикса клеточных стенок

Выделение клеточной стенки проводили в соответствии с ранее описанной методикой (Мейчик и др., 1999; Meychik and Yermakov, 1999). Для выделения клеточных стенок использовали интактные ткани разных органов растений нута С. arietinum и вики V. narbonesis. Полученные образцы помещали в стеклянную ионообменную колонку (V=250 мл) и промывали динамических условиях последовательно 1%-ным раствором NaOH (-0,5 л), НгО ( 2л), 1%-ным раствором НС1 ( 0,5 л) и дистиллированной водой до отсутствия в промывных водах хлорид-иона, определение которого проводили титриметрическим методом с азотнокислой ртутью. Затем материал высушивали в присутствии поглотителя СаСЬ при 55-60С до постоянного веса. Указанный метод стандартизации, то есть переведения всех имеющихся в структуре клеточных стенок катионообменных групп в FT-форму, а анионообменных - в форму свободного амина, позволяет проводить сравнительное исследование сорбционных свойств ионообменных материалов с различной структурой функциональных групп (Лейкин и др., 1978; Мейчик и др., 1999; Meychik and Yermakov, 1999).

Микроскопическое исследование клеточных стенок

Для оценки качества выделения клеточных стенок проводили микроскопический анализ препаратов интактных тканей и изолированных из них клеточных стенок, окрашенных флуоресцентным красителем DAPI (4\6-diamidino-2-phenilindole; Sigma) с концентрацией 1 мкг/мкл в 50% этаноле при комнатной температуре. DAP1 связывается с малой бороздой двухце-почечной молекулы ДНК, преимущественно с А-Т кластерами. Связыва ниє DAPI с ДНК вызывает двадцатикратное увеличение флуоресценции. DAPI флуоресцирует голубым светом ( тах возбуждения - 358 нм, Хщах флуоресценции - 451 нм). Исследование показало отсутствие в образцах изолированных клеточных стенок внутриклеточных структур. Кроме того, было обнаружено, что в препаратах клеточных стенок полностью сохраняется архитектура тканей.

Потенциометрическое титрование осуществляли методом отдельных навесок (Мейчик и др., 1999). Сухие навески образцов клеточных стенок по 40±0,1мг помещали в шлифованные бюксы с притертой пробкой (объем 50 мл) и заливали 12,5 мл раствора NaOH или НС1 различной концентрации, но постоянной ионной силы, которую создавали добавлением соответствующих растворов хлористого натрия. Диапазон изменения концентраций кислоты или щелочи в исходных растворах составлял От-10 мМ, a NaCl -10т-250 мМ. По истечении 48 часов образцы отделяли от раствора. До и после контакта с образцами в растворах определяли рН (рН Meter, Model 3320, фирма "Jenway", Англия) и концентрацию кислоты или щелочи титрованием с индикатором метиловым красным. По изменению концентрации Н или ОН в растворе рассчитывали сорбционную способность клеточных стенок при рН, по формуле: лсаг an _ V o Ц ) " /1 \ 8 где S, - сорбционная емкость образцов клеточных стенок по катионам (S,"") или анионам (Sf) при рН„ мкмоль/г сухой массы клеточных стенок; С0 и С, - исходная и соответствующая равновесная концентрации NaOH или НС1 в растворе, мМ; V- объем раствора, мл; g - навеска образца, г.

Навеску растертого и сухого образца клеточных стенок в количестве 20 мг заливали 7 мл 10 мМ раствором хлорной кислоты в ледяной уксусной кислоте. По истечении двух суток образцы отделяли от раствора. До и после контакта с клеточными стенками раствор титровали 10 мМ раствором бифталата калия в ледяной уксусной кислоте в присутствии индикатора кристаллического фиолетового (гексаметилпарарозанилин хлористый). Бифталат калия реагирует с хлорной кислотой в соотношении 1 моль на 1 моль в соответствии с уравнением:

Накопление биомассы растениями в зависимости от концентрации NaCl в среде

С увеличением концентрации NaCI в питательном растворе у обоих сортов нута содержание ионов хлорида и натрия в тканях возрастает (рис. 7). При этом накопление этих ионов в листьях значительно превышает их содержание в корнях. Особенно ярко это отличие в накоплении между тканями разных органов проявляется в присутствии 80 мМ NaCI. В этих условиях содержание ионов натрия и хлорида в листьях нута ILC482 и Bivanij в 3-6 раз больше, чем корнях (рис. 8). Кроме того, в тканях растений при увеличении уровня засоления содержание хлорид-ионов возрастает в большей степени по сравнению с натрием.

При всех условиях в корнях и листьях более солеустойчивого сорта нута ILC482 накопление ионов натрия и хлорида значительно выше, чем у Bivanij. Однако более яркие отличия в накоплении ионов между разными сортами растений наблюдаются в листьях. Так, с увеличением концентрации NaCI в среде до 80 мМ содержание ионов хлорида и натрия в корнях и листьях сорта ILC482 возрастает в 10-20 раз, а в тканях сорта Bivanij - в 5-10 раз (рис. 8). Следует отметить, что у обоих сортов нута при всех уровнях засоления в корнях накапливается больше Na+, чем СГ, в то время как в листьях концентрация хлорид-ионов выше, чем натрия (рис. 9).

С повышением CNaC1 в среде от 0,5 до 80 мМ содержание К+ в корнях растений нута ILC482 и Bivanij уменьшается в 5 раз (рис. 10). Влияние засоления на концентрацию этого иона в листьях имеет совершенно иной характер. С увеличением засоления до 80 мМ NaCI концентрация К+ в листьях растений обоих сортов нута возрастает в 1,5-2 раза (рис. 10). Следует отметить, что в корнях растений чувствительного сорта Bivanij под держивается более высокое содержание калия по сравнению с сортом ILC482, в то время как в листьях наблюдается противоположная тенденция. Наиболее солеустойчивый сорт нута ILC482 характеризуется большим накоплением калия в тканях листьев, чем сорт Bivanij (рис.11).

С увеличением концентрации NaCl в среде от 0,5 до 80 мМ происходит снижение оводненности тканей листьев нижнего и верхнего ярусов нута и вики, тогда как этот параметр в корнях и стеблях растений изменяется незначительно (табл.1). Во всех вариантах содержание воды в тканях листьев 2-3 раза меньше, чем в корнях и стеблях. При этом оводненность тканей вики, главным образом, стеблей и листьев выше по сравнению с нутом.

В качестве экспериментального подхода к изучению ионообменных свойств полимерного матрикса клеточных стенок растений С. arietinum выбран потенциометрический метод, который был ранее разработан и применен к исследованию структуры ионогенных групп клеточных стенок других растений (Мейчик и др., 1999; Meychik and Yermakov, 1999, 2001). На рис. 12 представлены экспериментальные кривые pHt=f{St) титрования полимерного матрикса клеточных стенок, изолированных из разных органов растений С. arietinum, выращенных при разном уровне засоления. Область положительных значений St соответствует выделению протонов в соответствии с уравнением реакции СООН + Na+ -» COONa + ЬҐ", где обозначает полимерную цепь, а область отрицательных - их поглощению (R-NH2+H+-»[R-NH3]+). При рН 10,8 значения катионообменной (St ) способности достигают максимального уровня.

Значения Scta характеризуют общее количество кислотных групп, которые имеются в полимерной структуре и потенциально способны принимать участие в реакциях обмена при соответствующих значениях рН окружающей среды.

Кривые потенциометрического титрования имеют сложную полисигмоидную форму, что свидетельствует о наличии в структуре полимерного матрикса клеточных стенок исследуемых растений нескольких типов функциональных групп (Мейчик и др., 1999; Meychik and Yermakov, 1999). Разделение экспериментальных кривых на моносигмоидные участки проводили по разработанной ранее методике (Meychik and Yermakov, 1999), согласно дифференциальным кривым

Экспериментальные кривые потенциометрического титрования полимерного матрикса клеточных стенок разных органов растений нута (Bivanij), выращенных при разной концентрации NaCl в среде, мМ: а - 0,5; 6-80 мМ. Ионная сила раствора при титровании 100 мМ. S - ионообменная способность полимерного матрикса клеточных стенок, мкмоль/г сухой массы клеточных стенок. В легенде обозначены органы, из которых выделяли клеточные стенки. в_лист - листья верхнего яруса, н_лист - листья нижнего яруса. —- = Др#,), показывающим ряд минимумов, которые соответствуют dpH, началу (а = 0) и концу (а = 1) ионизации функциональной группы j-того типа. Задача численного дифференцирования состоит в вычислении значения производной в равноотстоящих точках. Следует отметить, что если численное интегрирование сглаживает ошибки исходных данных, устраняет шум эксперимента, то на результат численного дифференцирования этот шум оказывает очень большое влияние: даже небольшие ошибки в исходных данных могут заметно исказить результаты, поэтому необходимо сначала сгладить исходные данные, а уже затем применять те или иные методы численного дифференцирования. Для устранения шума эксперимента применяли формулы линейного сглаживания по пяти точкам, которые имеют вид (Румшисский, 1973): у0= 1/5(у.2 + у-1 + Уо + Уі + у2), (5) у.1 = 1/Ю(4у.2 + Зу.1 + 2у0 + у1), (6) у, = 1/10(у.1+2уо + Зу,+ 4у2), (7) У-2=1/5(Зу.2 + 2у.1 + у0-у2), (8) У2=1/5(-у.2 + Уо + 2у, + Зу2), (9)

Для определения значений функции (S) в равноотстоящих точках (рН) использовали линейную интерполяцию по формуле Лагранжа (Румшисский, 1972): Р(х) = [(х-х,)/(х0-хі)] у0 + [(х-хо)/(хгх0)] Уь (10) а производную рассчитывали по уравнению: Уо =1/п [(УгУ-.)/2], (11) где h - шаг интерполяции. Операция численного дифференцирования позволила определить значения емкости для каждой ступени протонирования (AS) и рассчитать степень диссоциации а при соответствующем значении рН, по формуле: С" _ ?J CJ _ СУ (12), max umin где S - сорбционная емкость при соответствующем рН, мкмоль/г сухой массы, S и S - минимальное и максимальное значения сорбционной mm max r емкости для j-той ступени протонирования, найденные в соответствии с экстремумами дифференциальных кривых, мкмоль/г сухой массы, AS = max mm

Для расчета величин констант ионизации применено модифицированное Грегором уравнение Хендерсона-Хассельбаха (Gregor etaL, 1954): ( а ю (13), 1-а pH = pKa+n\og щорКа - кажущаяся константа ионизации ионогенной группы полимера, а - степень диссоциации, п - константа, зависящая от строения полимерной матрицы и природы противоиона (Gregor et al., 1954). Уравнение 9 носит в значительной мере эмпирический характер, но успешно используется для описания процессов кислотно-основного равновесия в структуре полифункциональных синтетических (Лейкин и др., 1978; Мейчик и др., 1989) и природных ионообменников (Мейчик и др., 1999; Meychik and Yermakov,2001)..

Влияние ионной силы внешнего раствора на ионообменную способность полимерного матрикса клеточных стенок вики

Следует отметить высокое содержание карбоксильных групп полигалактуроновой кислоты в клеточных стенках стебля и корней исследуемых растений (рис. 27) по сравнению с этим показателем у других растений (Meychik and Yermakov, 2001; 2003; Meychik et al., 2005; Мейчик и др., 2006). Показано, что в корнях люпина, огурца, шпината содержание карбоксильных групп ПГК составляет от 350 до 450, в то время как в корнях нута ILC 482 и вики достигает 680 и 620 мкмоль на 1 г сухой массы клеточных стенок (рис. 27).

В ряду исследуемых растений клеточные оболочки самого солечувствительного сорта нута имеют в своем составе наименьшее количество фенольных групп, что может свидетельствовать о сравнительно меньшей степени лигнификации стенок С. arietinum (Bivanij) по сравнению с С. arietinum (1LC 482) и V. narbonesis. В соответствии с данными по относительной солеустойчивости исследуемые растения располагаются в ряд: С. arietinum (Bivanij) С. arietinum (ILC 482) V. narbonesis, и в той же последовательности происходит увеличение содержания фенольных ОН-групп в стенках всех органов (рис. 28). Можно полагать, что большая степень лигнификации корней у вики и нута ILC 482 является одним из факторов, который определяет большую солеустойчивость растений С. arietinum (ILC 482) и V. narbonesis по сравнению с С. arietinum (Bivanij).

С увеличением концентрации соли в питательной среде и у нута (табл. 5, 6), и у вики изменяется константа ионизации карбоксильных групп ПГК, в то время как рКа двух других групп мало зависят от этого фактора. Следует отметить, что указанная закономерность соблюдается для клеточных оболочек, изолированных и из корней, и из листьев, и из стеблей. С увеличением содержания NaCl в питательном растворе уменьшается константа ионизации карбоксильных групп ПГК или усиливаются их кислотные свойства. Таким образом, в ответ на засоление должно происходить увеличение ионообменной способности полимерного матрикса клеточных стенок. Доказательством последнего утверждения могут служить зависимости ионообменной способности полимерного матрикса клеточных стенок нута и вики от концентрации хлорида натрия (CNaC1) во внешнем растворе (рис. 14-16, 19, 22). Во всех вариантах выращивания у исследуемых растений с увеличением CNaCI резко возрастает ионообменная способность клеточных стенок, причем и для корней, и для листьев, и для стеблей указанные зависимости имеют аналогичный характер. В зависимости от CNaC1 для корней нута и вики параметр S изменяется от 70 до 200-220, для стеблей - от 130 до 400 мкмоль, а для листьев - от 70 до 150 (листья верхнего яруса) - 300 (листья нижнего яруса) микромолей на 1 г сухой массы клеточных стенок в интервале изменения ионной силы от 5 до 1000 мМ. Следует подчеркнуть, что при любых условиях способность к ионному обмену клеточных стенок стебля выше по сравнению с остальными органами (рис. 14,19,22).

Степень ионизации (а) слабых кислот и оснований, к которым относятся и ионогенные группы в структуре полимерного матрикса клеточных стенок, зависит лишь от двух факторов: от значений рН и рКа. Последний параметр, как известно, является постоянным для любой кислоты или основания. Следовательно, для фиксированного значения рН степень ионизации зависит только от химической природы кислоты или основания (Альберт и Сержент, 1964). На основании полученных в работе результатов можно рассчитать степень диссоциации каждой группы в зависимости от рН и ионной силы раствора. Уравнение для расчета а выглядит следующим образом: а={1/[1 + 1/10[(рН"рКа)/п3]}, (17)

Так как качественный состав ионогенных групп клеточных стенок всех исследуемых растений из семейства бобовых идентичен, то представленные кривые (рис. 29) характеризуют состояние ионообменных групп полимерного матрикса клеточных стенок и нута, и вики при разной ионной силе внешнего раствора. Так, при рН=4,5 около 60% карбоксильных групп ПГК ионизировано в среде с 10 мМ NaCl, в то время как при 100 мМ NaCl величина а этих групп достигает 80%. В этих условиях все карбоксильные группы оксикоричных кислот не способны к реакциям обмена с ионами внешней среды. При рН=7 карбоксильные группы ПГК диссоциированы на 100%, тогда как карбоксильные группы оксикоричных кислот - на 20%. Следует отметить, что фенольные и аминогруппы всегда закрыты при физиологических условиях (рН 5,0-8,0) и, следовательно, не принимают участия в ионообменных реакциях (рис. 29). У всех исследуемых растений коэффициент набухания полимерного CVV матрикса клеточных стенок (К ), также как ионообменная способность, зависит от ионной силы внешнего раствора (рис. 23-25). Наши результаты показывают, что набухание клеточной стенки изменяется в соответствии с физико-химическими закономерностями, которые известны для синтетических слабосшитых слабоосновных катионообменников (Гельферих, 1962). Значение увеличивается с уменьшением ионной силы раствора и с увеличением рН (или степени диссоциации ионогенных групп). Во всех случаях набухание клеточной стенки минимально в кислой области. Это означает, что клеточные стенки сжимаются или уменьшаются в объеме с уменьшением рН апопласта или внешней среды. Аналогичные изменения в объеме клеточной стенки происходят при увеличении ионной CW силы внешнего раствора

Похожие диссертации на Ионообменная способность клеточных стенок из разных органов растений в условиях засоления : на примере представителей сем.Fabaceae

Исследование стресс-протекторного действия брассиностероидов на растения рапса в условиях засоленияХасан Жалал Абду Каид Альмиклафи

Дифференциальная экспрессия генов аквапоринов в растениях Mesembryanthemun crystallinum L. в условиях засоления и при действии меди и цинкаАбдеева Анна Рамильевна

Регуляция окислительного метаболизма растений семейств LEМNACEAE и ARACEAE в условиях различного углеродного питания, освещения и засоленияПопова, Инна Вячеславовна

Динамика накопления липидов при формировании семян хлопчатника под действием кальция в условиях почвенного засоленияХолбеков Юсуф

Дыхание запасающих органов растений и его регуляция в ходе онтогенезаШугаев Александр Григорьевич

Реакция отделенных органов растений на солевой стрессАлиева Зарина Магомедрасуловна

Энергетический баланс молодых тканей и органов растенийМалышев Руслан Владимирович

ВЛИЯНИЕ ИСТОЧНИКА АЗОТНОГО ПИТАНИЯ И ЯРУСНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА КОНЦЕНТРАЦИЮ И СООТНОШЕНИЕ КАТИОНОВ В ОРГАНАХ РАСТЕНИИАнна, Степановна Лосева

Роль отдельных органов в продукционном процессе растений яровой пшеницы разного эколого-географического происхождения Ионова Наталия Эрнестовна

Белоксинтезирующая система осевых органов семени фасолиКозеко, Людмила Евгеньевна