Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Два типа вторичной клеточной стенки растительных волокон 13
1.1.1. Вторичная клеточная стенка классического, ксиланового, типа у растительных волокон 15
1.1.2. Вторичная клеточная стенка особого, желатинозного, типа у растительных волокон 20
1.1.2.1. Состав и структура клеточной стенки желатинозного типа... 23
1.1.2.2. Механизмы реализации функциональной нагрузки клеточной стенки желатинозного типа 28
1.2. Постсинтетические модификации полимеров клеточной стенки 34
1.2.1. Ферменты, локализованные в клеточной стенке и модифицирующие ее компоненты 34
1.2.1.1. Гликаназы (гликозидгидролазы) 36
1.3. Подходы к анализу ферментов клеточной стенки растительных волокон 37
1.4. Формирование желатинозной клеточной стенки флоэмных волокон льна 42
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 51
2.1. Объекты исследований 51
2.2. Оценка галактаназной активности 54
2.2.1. Анализ низкомолекулярных углеводов 54
2.2.2. Измерение р-галактозидазной активности с помощью хромогенного субстрата 54
2.2.3. Окрашивание срезов с помощью флуорогенного субстрата 55
2.3. Выделение и идентификация (3-галактозидазы 55
2.3.1. Выделение тканеспецифичного галактана и ассоциированного с ним белка 55
2.3.2. Постановка одномерного электрофореза по Лэммли 56
2.3.3. Идентификация белка методом ВЭЖХ МС 56
2.3.4. Анализ аминокислотной последовательности белка с помощью методов биоинформатики 58
2.4. Получение поликлональных антител 58
2.4.1. Получение антигена 58
2.4.2. Иммунизация препаратом белка 59
2.4.3. Подтверждение специфичности полученных антител 60
2.5. Анализ срезов растений методами микроскопии и иммуноцитохимии 61
2.6. Определение содержания мРНК методом ПЦР в реальном времени.. 63
2.7. Выделение полимеров, слабо связанных с микрофибриллами целлюлозы клеточной стенки 65
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 67
3.1. Галактаназная активность в тканях стебля льна 67
3.1.1. Определение содержания низкомолекулярных углеводов в тканях стебля льна на разных стадиях развития волокон 67
3.1.2. Оценка Р-галактозидазной активности в тканях стебля льна с помощью искусственных субстратов 71
3.2. Выявление и идентификация фермента, осуществляющего модификации тканеспецифичного галактана волокон льна 74
3.2.1. Анализ Р-галактозидазной активности во фракции, содержащей тканеспецифичный галактан 74
3.2.2. Белковый состав фракции, содержащей тканеспецифичный галактан 77
3.2.3. Анализ выявленного во фракции высокомолекулярного галактана белка методами протеомики и биоинформатики 79
3.3. Субклеточная локализация Р-галактозидазы в тканях стебля льна и других растений, волокна которых формируют клеточную стенку желатинозного типа 90
3.3.1. Получение поликлональных антител к исследуемому белку и оценка степени их специфичности 90
3.3.2. Иммуноцитохимическая локализация р-галактозидазы в тканях стебля льна и других растений 93
3.4. Особенности формирования клеточной стенки желатинозного типа у трансгенных растений льна с антисмысловои конструкцией к гену тканеспецифичной р-галактозидазы волокон 96
3.4.1. Общая характеристика трансгенных растений льна 96
3.4.2. Анализ Р-галактозидазной активности в трансгенных растениях льна 100
3.4.3. Особенности структуры клеточной стенки волокон льна с пониженной экспрессией гена Р-галактозидазы 102
3.4.4. Локализация галактана в клеточной стенке волокон льна с нормальной и пониженной экспрессией гена Р-галактозидазы 105
3.4.5. Содержания тканеспецифичного галактана, слабо связанного с микрофибриллами целлюлозы, в клеточной стенке трансгенных растений льна 108
Заключение 111
Выводы 116
Список литературы 118
- Вторичная клеточная стенка особого, желатинозного, типа у растительных волокон
- Выделение полимеров, слабо связанных с микрофибриллами целлюлозы клеточной стенки
- Анализ выявленного во фракции высокомолекулярного галактана белка методами протеомики и биоинформатики
- Особенности структуры клеточной стенки волокон льна с пониженной экспрессией гена Р-галактозидазы
Введение к работе
Постановка проблемы и ее актуальность. Клеточная стенка растительных клеток выполняет многообразные функции, среди которых наиболее выраженной является механическая. При этом клеточные стенки могут не только служить статичной опорой, но и обладать свойствами, способствующими перемещению частей растения в пространстве. Такие свойства характерны для вторичных клеточных стенок желатинозного типа, которые формируются только в растительных волокнах и отличаются от классического, ксиланового, типа вторичных клеточных стенок высоким содержанием целлюлозы, продольной ориентацией ее микрофибрилл, особым составом полисахаридов матрикса и низким содержанием лигнина (Горшкова, 2007). Особый состав и структура клеточной стенки желатинозного типа обуславливают наличие контрактильных свойств, которые основаны на создании в клеточной стенке натяжения (Clair et al., 2006).
Механизм создания натяжения в клеточных стенках желатинозного типа остро дискутируется. Основные предложенные гипотезы сводятся к пассивному набуханию клеточных стенок желатинозного типа при ограничении их объема окружающими слоями ксилановой клеточной стенки (Goswami et al., 2008), или к натяжению латерально взаимодействующих микрофибрилл целлюлозы при попадании между ними полисахаридов матрикса (Mellerowicz et al., 2008). Последний механизм подразумевает, что создание натяжения в клеточной стенке основано на активных метаболических процессах. Такие процессы предполагаются, в частности, для тканеспецифичного галактана, накопление которого сопряжено с формированием вторичной клеточной стенки флоэмных волокон льна и конопли (Gorshkova et al., 1996, 2004; Gorshkova, Morvan, 2006). Этот полисахарид построен как сложный рамногалактуронан I с боковыми цепочками, состоящими, в основном, из Р~(1—>4)-связанной галактозы, составляющей основную массу полимера. После встраивания галактана в клеточную стенку происходит значительное уменьшение его молекулярной массы (Gurjanov et al., 2008), что может быть связано с укорочением боковых цепочек полимера. Гидролиз боковых цепочек галактана in vivo теоретически возможен в результате действия эндогенной галактозидазы и/или эндогалактаназы. Выявление и характеристика фермента, осуществляющего постсинтетические модификации тканеспецифичного галактана, позволит существенно дополнить картину процессов, происходящих при формировании вторичной клеточной стенки желатинозного типа и выявить ключевые элементы в механизмах ее функционирования.
Цель и задачи исследования. Целью работы было выявление и характеристика фермента, обеспечивающего постсинтетические модификации галактана в ходе формирования клеточной стенки желатинозного типа.
Были поставлены следующие задачи:
Оценить эндогалактаназную и галактозидазную активность в тканях стебля льна, содержащих волокна на разных стадиях развития.
Выделить и очистить фермент, идентифицировать и охарактеризовать его методами протеомики и биоинформатики.
3. Получить антитела к анализируемому белку. Установить субклеточную
локализацию фермента в тканях стебля льна. Определить наличие и локализацию
белка в тканях других растений, волокна которых формируют клеточную стенку
желатинозного типа.
4. Охарактеризовать особенности формирования клеточной стенки
желатинозного типа у трансгенных растений льна с антисмысловои конструкцией к
гену выявленного фермента.
Научная новизна работы. С помощью комплекса подходов впервые охарактеризован тканеспецифичный белок волокон желатинозного типа, который идентифицирован как Р-галактозидаза. Выявлена активация экспрессии гена этого фермента при переходе волокон к формированию клеточной стенки желатинозного типа. С помощью наработанных антител продемонстрирована локализация фермента во флоэмных волокнах льна, где он обнаруживается совместно с тканеспецифичным галактаном в секретируемых пузырьках аппарата Гольджи и во вторичной клеточной стенке желатинозного типа. Установлено наличие аналогичной Р-галактозидазы в клеточной стенке желатинозного типа волокон растений различной таксономической принадлежности и образуемых различными меристемами, что указывает на наличие у них сходных механизмов формирования клеточных стенок желатинозного типа и существенную роль в них Р-галактозидазы. Снижение уровня экспрессии тканеспецифичной Р-галактозидазы путем введения антисмысловои конструкции к соответствующему гену приводит к нарушению нормального хода трансформации слоев клеточной стенки, что доказывает ключевую роль фермента в формировании ее надмолекулярной структуры и свидетельствует о необходимости активной метаболической составляющей в функционировании клеточной стенки желатинозного типа.
Научно-практическая значимость работы. Представленные в работе результаты вносят вклад в понимание механизмов образования и функционирования вторичной клеточной стенки желатинозного типа, которая характерна для многих хозяйственно ценных культур. Полученные представления об участии тканеспецифичного фермента в формировании надмолекулярной структуры клеточной стенки позволяют развить биотехнологические подходы для целенаправленного изменения свойств клеточной стенки и, следовательно, качества волокна. Разработанная совокупность подходов для идентификации, характеристики и установления роли индивидуального фермента может быть использована при исследовании других белков растительной клетки.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Исследования проводились в соответствии с планами НИР КИББ КазНЦ РАН (номер госрегистрации 0120.0 408625); частично поддержаны грантами РФФИ № 06-04-48853, № 08-04-00845, № 09-04-97038. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на итоговой научной конференции КГУ (Казань, 2005), VI съезде Общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007), IX Международной конференции по клеточной стенке (Копенгаген, Дания, 2007), Международной конференции «Pectins and Pectinases» (Вагенинген, Нидерланды, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международной конференции по растительным полисахаридам «PPW 2008» (Сигтуна, Швеция, 2008), Международном симпозиуме по углеводам «ICS 2008» (Осло, Норвегия, 2008), Гордоновской конференции по растительной клеточной стенке (Смитфилд, США, 2009), годичном собрании общества физиологов России (Апатиты, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), Международной конференции по растительным волокнам «Plant fibers: view of fundamental biology» (Казань, 2009), итоговых конференциях КИББ КазНЦ РАН (2009, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. В работе представлено 5 таблиц и 42 рисунка. Список литературы включает 155 источников, в том числе, 138 - иностранных.
Вторичная клеточная стенка особого, желатинозного, типа у растительных волокон
Механизм контроля ориентации микрофибрилл остро дискутируется; большинство авторов считает, что он осуществляется кортикальными микротрубочками (Heath, 1974; Carpita, McCann, 2000); факторы, нарушающие ориентацию микротрубочек, приводят к нарушению нормальной структуры вторичной клеточной стенки (Chaffey, 2000; Mellerowicz et al., 2001). При этом существуют и другие точки зрения (Lindeboom et al., 2008). В любом случае неясно, чем контролируется толщина слоев SI, S2, S3 и что является первопричиной для смены ориентации микрофибрилл (или микротрубочек), которая, судя по четкой границе между слоями, осуществляется достаточно резко.
Ключевым нецеллюлозным полисахаридом вторичных клеточных стенок ксиланового типа служит (3-D-(l— 4)-ксилан. Он относится к связующим гликанам, которые взаимодействуют как с молекулами целлюлозы, так и между собой, формируя своеобразную сеть. Ксиланы вторичной клеточной стенки — относительно некрупные полисахариды: молекулярная масса, по данным гель-хроматографии, составляет 8-40 кДа (Evtuguin et al., 2003; Kabel et al., 2007), что примерно соответствует степени полимеризации в 50-250 мономеров. Во вторичных клеточных стенках степень разветвленности ксиланового остова низкая, боковые цепочки из арабинозы обычно отсутствуют. Для ксиланов из различных источников описаны разнообразные варианты расположения заместителей вдоль остова молекулы: случайное, упорядоченное (т.е. регулярное по всей длине) или блочное (сосредоточенное в некоторых участках остова) (Ebringerova, Heinze, 2000).
Вторичная клеточная стенка ксиланового типа характерна не только для волокон, но и для других типов клеток, например проводящих сосудов и трахеид, а также одревесневшей паренхимы. Биохимический анализ проводится суммарно для всех тканей древесины, что не даёт возможность определить, существуют ли особенности строения ксилана у разных типов клеток и в различных слоях клеточной стенки. Некоторая информация, свидетельствующая о том, что структура ксилана не идентична в различных слоях ксилановой клеточной стенки, получена с помощью цитохимических подходов, в том числе с использованием антител (Awano et al., 2000; Ruel et al., 2006), а также комплексов фермент-золото (Vian et al., 1992), которые по-разному связывались с отдельными слоями.
В древесине покрытосеменных, в том числе в ксилемных волокнах, ксилан может составлять до 80% нецеллюлозных полисахаридов и до 30% от массы клеточной стенки. Оставшиеся 10% приходятся на долю пектиновых веществ срединной пластинки и первичной клеточной стенки, а также на глюко(галакто)маннан — минорный компонент вторичной клеточной стенки (Mellerowicz et al., 2001). При этом у трахеид хвойных в клеточной стенке такого типа глюко(галакто)маннаны служат существенной составляющей (Hosoo et al., 2006).
Глюкуроноксилан, расположенный на поверхности микрофибрилл целлюлозы, придает им отрицательный заряд, который можно выявить при обработке катионным золотом (Reis, Vian, 2004). Этот заряд препятствует слипанию микрофибрилл между собой и создает условия для их параллельного расположения. Предложена модель, согласно которой ксилан служит промежуточным слоем между микрофибриллами целлюлозы и аморфным лигнином (Reis, Vian, 2004; Dammstrom et al., 2009). Наличие и распределение различных «довесков» у остова ксилана существенно сказывается на способности этого связующего гликана к самоассоциации (Kabel et al., 2007; Kohnke et al., 2008), к ассоциации с микрофибриллами целлюлозы (Kabel et al., 2007), а также на доступности к действию различных ферментов и поведении в растворе (Ebringerova, Heinze, 2000). Линейные ксиланы лучше связываются с целлюлозой, наличие ацетильных групп и, особенно, остатков арабинозы, снижают эффективность взаимодействия (Kabel et al., 2007). Существует идея, что ксилан способствует созданию спиралевидной ориентации микрофибрилл, выступая в качестве «закручивающего фактора» («twisting agent») (Reis, Vian, 2004), хотя существуют примеры аналогичного расположения микрофибрилл в отсутствии ксилана, например, во вторичной клеточной стенке волосков семян хлопчатника.
Интенсивность связывания антител на ксилан в уже отложенных ранее слоях со временем увеличивается, что объясняют проникновением новых порций ксилана вглубь клеточной стенки, то есть в удаленные от плазмалеммы слои (Awano et al., 2000; Ruel et al., 2006). Соответственно, ксилан делят на две фракции: связавшийся с целлюлозой непосредственно в ходе формирования микрофибрилл и отложенный позднее. Считают, что ксилан первой фракции тонким слоем распределен вдоль микрофибрилл целлюлозы, а второй — взаимодействует, в основном, с лигнином (Reis, Vian, 2004; Dammstrom et al., 2009).
Лигнификация - ключевой процесс, характерный для вторичной клеточной стенки ксиланового типа, за счет которого она приобретает особую механическую прочность. Отложение лигнина приводит к уменьшению содержания в клеточной стенке воды. Это происходит за счет заполнения лигнином доступного свободного пространства между полисахаридами (микрофибриллами целлюлозы и глюкуроноксиланом) и приводит к уменьшению пористости клеточной стенки и увеличению ее гидрофобности (Mellerowicz et al., 2001; Ruel et al., 2006).
Ксилемные волокна характеризуются высоким содержанием лигнина; о нем, правда, обычно судят по оценке содержания лигнина во всей древесине. Такой подход отчасти оправдан тем, что волокна либриформа у некоторых видов растений составляют большую часть древесины. Например, у тополя волокна либриформа составляют до 53-55% древесины (Mellerowicz et al., 2001), а у ивы - до 72% (Xu et al., 2006). Тем не менее, такая оценка может давать завышенные значения содержания лигнина в волокнах из-за более высокой концентрации лигнина в проводящих сосудах. Так, в сосудах древесины ивы она в два раза больше, чем в S2 слое клеточной стенки волокон либриформа (Xu et al., 2006); подобная закономерность отмечена и для других видов (Watanabe et al., 1997). При этом для степени лигнификации первичной клеточной стенки наблюдается противоположная картина. Существует точка зрения, согласно которой специализация волокон и сосудов в ходе эволюции элементов древесины споровых и цветковых растений шла, отчасти, по пути формирования различий в локализации лигнина в слоях клеточной стенки (Boyсе et al., 2004).
Выделение полимеров, слабо связанных с микрофибриллами целлюлозы клеточной стенки
Специфичность полученных антител подтверждали путем вестерн-блоттинга растворимых белков волокнистой части стебля льна ниже «точки слома» и высокомолекулярной фракции. Фракцию растворимых белков получали путем осаждения осветленного гомогента волокнистой части стебля льна 80% ацетоном с 10% ТХУ. Гомогенизацию волокнистой части проводили в 10 мМ Na-ацетатного буфера (рН 5.5) с добавлением коктейля ингибиторов протеаз (Sigma). Полученный в ходе осаждения осадок тщательно отмывали 80% ацетоном, растворяли в буфере для образцов (Laemmli, 1970) и проводили разделение с помощью одномерного электрофореза. Высокомолеклярную фракцию получали в соответствии с разделами 2.3.1, и 2.3.2.
Вестерн-блоттинг. После проведения электрофореза переносили белки на нитроцеллюлозную мембрану (Sigma, США) с помощью прибора для полусухого переноса - блоттера (Россия, Хеликон). Буфер для переноса: трис основной 47.9 мМ, глицин 38.6 мМ, ДДС 0.0385%, метанол 20%. После проведения электрофореза треки с интересующими белками вырезали, помещали на фильтр, смоченный в буфере для переноса, на нижний электрод прибора; на гель помещали нитроцеллюлозную мембрану, предварительно смоченную дистиллированной водой, а затем буфером для переноса, сверху помещали фильтр, смоченный в том же буфере. Перенос проводили при 250 мА, 30 В в течение 2 ч при 8С. После блотирования для проверки успешности переноса мембрану окрашивали понсо, затем отмывали и проявляли интересующими антителами.
Мембрану блокировали с помощью коммерческого препарата сухого обезжиренного молока (3%) (Nalgene, США) в течение ночи. Отмывали от блокирующего раствора 5 мин в фосфатно-солевом буфере с твином (0.01 М Na-фосфат, 0.15 М NaCl, и 0.05% по объему твин (ФСБТ)). Далее мембраны инкубировали в присутствии первичных антител (разведение 1:1000 в ФСБТ) при комнатной температуре на шейкере (Shaker PSU-2T plus, Biosan, Латвия) в течение 1 ч. Трижды промывали мембрану ФСБТ в течение 10 мин. Мембрану инкубировали с биотинилированным коньюгатом (антимышиные IgG, Имтэк, Россия) в течение часа при комнатной температуре на шейкере. Вновь трижды промывали. Затем инкубировали с коньюгатом стрептовидин-щелочная фосфатаза, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и проявляли с помощью субстрата 5-бром-4-хлор-З-индолил и голубой тетразолиум (Силекс, Россия).
Степень окрашивания субстратного раствора определяли визуально. В контрольных образцах использовали сыворотку интактных мышей. Мембраны сканировали на HP Perfection 4990 Photo 4800 9600.
Для приготовления ультратонких срезов небольшой участок флоэмной ткани из средней части стебля льна, конопли и древесины натяжения тополя фиксировали по традиционной методике (Vicre, 1998). Для пропитки растительных клеток использовали смолу LR White (TED PELLA, INC.). Ультратонкие срезы получали с помощью алмазного ножа на ультрамикротоме LKB Ultracut III и анализировали при помощи электронных микроскопов ЕМ ЮС/ЕМ CR (Carl Zeiss, Германия), 60 кВ и JEOL 1200 ЕХ, 80 кВ. Представленные в работе фотоснимки получены в результате применения одного метода фиксации растительной ткани.
Проведение иммуноцитохимических реакций осуществляли по классической схеме для работ с первичными и вторичными антителами с собственными модификациями (Salnikov et al., 2003). В качестве первичного антитела использовали полученные поликлональные мышиные антитела N1, специфичные к Р-галактозидазе, или моноклональные коммерческие антитела LM5 (Plant Probes), специфичные к тетрамерам Р (1—»4)-галактозе (Jones et al., 1997). Вторичные антитела при иммуномечении N1 - антимышиные, при иммуномечении LM5 — антикрысиные, конъюгированные с коллоидным золотом (размер частиц 5 нм, Amersham Pharmacia Biothech). Для двойного иммуномечения размер частиц золота для N1-5 нм, для LM5 - 20 нм. Для усиления сигнала коллоидного золота применяли Silver enhancement kit (SPI-Mark). Срезы просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе модели JEM -1200 EX (Япония). Исследования проводились при методической поддержке д.б.н., в.н.с. Сальникова В.В.
Для анализа стуктуры клеточной стенки волокон трансгенных растений фиксировали отрезки из середины стебля (0.5% глутаральдегидом + 2% параформальдегидом с постфиксацией в 0.5% OSO4) и заключали в LR White (Ted Pella Inc.). Для оценки толщины слоев клеточной стенки волокон делали поперечные срезы стебля толщиной 2-3 мкм на ульратоме LKB 8800. Срезы просматривали и фотографировали с помощью конфокального микроскопа Axiovert 200М (Carl Zeiss, Германия). Толщину слоев клеточных стенок волокон измеряли при помощи программы AimlmageBrowser. Анализ распределения эпитопов антитела LM5 с помощью электронной микроскопии проводили как описано выше. При иммуномечении LM5 для анализа с помощью конфокальной микроскопии использовали вторичное антитело, коньюгированное с флуоресцентной меткой FITC (разведение 1:100, кроличье антикрысиное IgG FITC, Sigma, США). Срезы просматривали и фотографировали на конфокальном микроскопе Axiovert 200М (Carl Zeiss, Германия). Исследования трансгенных линий льна проводились при методической поддержке к.б.н., н.с. Снегиревой А.В. Для изучения экспрессии гена р-галактозидазы с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили выделение тотальной РНК с использованием кита RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия) (http://www l.qiagen.com/literature/render.aspx?id=352). Затем с помощью проведения реакции обратной транскрипции нарабатывали кДНК, которую, в свою очередь, использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР в реальном времени. Для проведения реакции обратной транскрипции в пробирке, помещенной в лед, смешивали 2 мкл тотальной РНК (0.1 - 5 мкг), 1 мкл случайный гексапраймер (0.5 нг), 15 мкл воды, свободной от РНКаз (MilliQ). Смесь перемешивали, осаждали капли кратковременным центрифугированием. Инкубировали смесь 5 мин при +70С, переносили пробирку в лед и собирали капли кратковременным центрифугированием. Помещали пробирку в лед и добавляли следующие компоненты: 2.5 мкл -xl0-кратный буфер для обратной транскрипции (Силекс, Россия), 4 мкл - 1.5 тМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dGTP, dATP, dCTP, dTTP), 0.5 мкл M-MLV обратная транскриптаза. Инкубировали смесь в течение 60 мин при +37С.
Анализ выявленного во фракции высокомолекулярного галактана белка методами протеомики и биоинформатики
Если до повторного хроматографирования это соотношение составляло 14, то через 5 ч снижалось до 10, а через 48 — до 3.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что продуктом реакции анализируемого фермента является мономерная галактоза, а его субстратом может служить тканеспецифичный Р (1— 4)-галактан волокон.
Таким образом, на основании а) выявления фрагмента белка, гомологичного р-галактозидазе, б) наличия в геноме льна соответствующего гена, экспрессия которого активируется в ходе интенсивного синтеза галактана, в) демонстрации галактозидазной активности с помощью искусственных субстратов, г) отщепления мономерной галактозы при гидролизе высокомолекулярного галактана анализируемый белок может быть идентифицирован как р-галактозидаза, а тканеспецифичный галактан — как ее нативный субстрат.
Р-Галактозиды достаточно широко распространены в растительных тканях (Singh, Knox, 1985; Dopico et al., 1990; Raghothama et al., 1991; Ross et al., 1994; Buckeridge, Reid, 1994). Растительные р-галактозидазы -гликозидгидролазы (GH35, E.C. 3.2.1.23), которые катализируют отщепление терминальной галактозы с невосстанавливающего конца P-D-галактозидов. р-Галактозидазы вовлечены в деградацию компонентов клеточной стенки во время ее растяжения, клеточного старения, созревания фруктов и мобилизации запасных веществ (Singh, Knox, 1985; Dopico et al., 1990; Raghothama et al., 1991; Veau et al., 1993; Buckeridge, Reid, 1994; Ross et al., 1994; Buckeridge et al., 2005).
В первичных и вторичных клеточных стенках галактоза может входить в состав различных полимеров. В рамногалактуронане I [3-(1—»4)-галактоза составляет боковые цепочки галактана, который, как предполагают, вовлечен во взаимодействие с другими пектинами и сохранение пористости клеточной стенки (Willats et al., 2001). Галактозные остатки могут быть присоединены к остову ксилоглюкана и служить мишенью для фукозилирования ксилоглюкана (Репа et al., 2004). Галактоза - основной компонент гликановой части арабиногалактановых белков. Все перечисленные галактозосодержащие полимеры могут служить субстратом для действия р-галактозидазы. Для ряда растений было описано наличие мультигенных семейств р-галактозидаз. Так, например, для Lycopersicon esculentum было описано семь членов суперсемейства (Smith, Gross, 2000), для Carica papaya - три (АН et al., 1998). В полностью сиквенированном геноме резуховидки (Arabidopsis thaliana) было выявлено 18 генов, продуктами которых предположительно являются Р-галактозидазы 35 гликозидгидролазного семейства (GH35), 12 из них, вероятно, секретируются в клеточную стенку. В базе данных по геному Oryza sativa фигурирует 7 Р-галактозидаз. Неудивительно, что для этих ферментов характерна экспрессия на разных стадиях развития растений, в различных тканях, а также разнообразие используемых субстратов (АН et al., 1998; Smith, Gross 2000; Esteban et al, 2005).
Несмотря на такую широкую представленность р-галактозидаз в растениях, для большинства изоформ фермента роль в метаболизме полимеров клеточной стенки на сегодняшний день остается неизвестной. Наличие мультигенных семейств Р-галактозидаз в растениях (АН et al., 1998; Smith, Gross, 2000) предполагает, что различные продукты соответствующих генов должны экспрессироваться на разных этапах метаболизма клеточной стенки. Достаточно подробно охарактеризованы Р-галактозидазы Cicer arietinum, в котором было выявлено, по меньшей мере, 4 изоформы Р-галактозидазы и с помощью антител установлена локализация в тканях. Так, было показано, что одна из изоформ р-галактозидазы участвует в формировании клеточной стенки в ходе дифференциации сосудистой системы растений, а именно в деградации первичной клеточной стенки ксилемных сосудов. Другая изформа участвует в разрыхлении клеточной стенки клеток эпидермиса, предваряя их растяжение (Konno, Tsumuki, 1993; Valero, Labrador, 1993). Авторы предполагают важную роль этой Р-галактозидазы в деградации клеточной стенки клеток вегетативных органов Cicer arietinum, таких как эпикотиля и корня, что определяет структурные изменения клеточной стенки, а именно ее пористость. В целом, большинство существующих на сегодняшний день работ по изучение р галактозидаз соотносят экспрессию генов этих ферментов либо с созреванием плодов и фруктов, где деградация галактана связана с процессами разрыхления клеточных стенок (показано для томатов и других плодов, Brummell, Harpster 2001), либо с ростом клеток растяжением, где действие Р-галактозидазы приводит к увеличению пористости клеточной стенки и обуславливает доступность субстратов для ферментов, в дальнейшем модифицирующих компоненты клеточной стенки (Esteban et al., 2003).
Некоторую информацию, характеризующую исследуемый белок можно получить при анализе его аминокислотной последовательности с помощью специализированных программ, имеющихся в открытом доступе электронных ресурсов. Характеристика транслированной аминокислотной последовательности гена выявленной Р-галактозидазы осуществлялась с помощью программ TargetP и SignalP, которые позволяют установить возможную локализацию белка на основе наличия в аминокислотной последовательности сигнального пептида.
Особенности структуры клеточной стенки волокон льна с пониженной экспрессией гена Р-галактозидазы
Полученные в представленной работе результаты позволяют ответить на ряд вопросов, касающихся процессов формирования вторичной клеточной стенки желатинозного типа, обозначить возможные механизмы создания ее особой структуры и выявить ключевых участников этого процесса. Клеточную стенку желатинозного типа формируют только волокна — клетки с наиболее выраженной механической функцией. Создаваемое в клеточных стенках желатинозного типа натяжение необходимо для формирования ответа на различные механические стимулы. Оно способствует, например, развитию отрицательного гравитропизма при образовании реакционной древесины, или формированию устойчивости к сгибанию стебля у травянистых растений с тонким длинным стеблем.
Считается, что реализация механических свойств клеточной стенки желатинозного типа может осуществляться за счет разницы пассивного набухания желатинозного и ксиланового слоев, что связывают либо с различиями в ориентации микрофибрилл целлюлозы (Burgert et al., 2007), либо с наличием гигроскопичных полимеров матрикса (рамногалактуронан I) (Clair et al., 2008). Однако ряд данных позволяет предположить, что натяжение в клеточной стенке желатинозного типа возникает в результате латерального взаимодействия микрофибрилл целлюлозы и захвата полисахаридов матрикса (Mellerowicz et al., 2008). Было показано, что микрофибриллы целлюлозы в волокнах, формирующих клеточную стенку желатинозного типа, характеризуются большими размерами кристаллических участков, по сравнению с большинством других растительных объектов (Vietor et al., 2002, Sturcova et al., 2004). Это дало основание предполагать наличие в желатинозных слоях латерального взаимодействия микрофибрилл целлюлозы, чему способствует их одинаковая ориентация, а также отсутствие лигнина и значительных количеств полисахаридов матрикса, разделяющих микрофибриллы друг от друга. Е. Mellerowicz с соавторами (Mellerowicz et al., 2008) высказана идея, что микрофибриллы целлюлозы, взаимодействуя латерально, «захватывают» матриксные полисахариды. Этими же авторами, применительно к желатинозным волокнам древесины, использован термин «мускулы» на основании обнаружения у них контрактильных свойств (Clair et al., 2006). В качестве «запечатанного» полисахарида у волокон разных видов растений выступают, возможно, различные полисахариды. Присутствие в клеточной стенке желатинозного типа волокон ряда растений ткане- и стадия-специфичного галактана, обладающего особыми свойствами, метаболизм которого напрямую связан с формированием желатинозных слоев (Gorshkova, Morvan, 2006; Salnikov et al., 2008), позволяет предположить наличие активной метаболической составляющей в создании натяжения в клеточной стенке желатинозного типа ряда растений. На основании полученных в нашей лаборатории данных по исследованию метаболизма и структуры тканеспецифичного галактана сформирована следующая гипотеза участия этого полисахарида в формировании надмолекулярной структуры клеточной стенки желатинозного типа (Биогенез растительных волокон,... 2009) (рис. 14). Тканеспецифичный галактан волокон (2000 кДа), имеющий длинные галактозные цепочки, секретируется с помощью особых производных аппарата Гольджи за пределы плазмалеммы, где встраивается между микрофибриллами целлюлозы и предотвращает их латеральное взаимодействие сразу после формирования. Именно эта часть галактана извлекается при экстракции оксалатом аммония и обеспечивает видимость «рыхлой» структуры недавно отложенных слоев клеточной стенки Gn. По мере развития волокна «рыхлая» структура постепенно трансформируется в более плотную (G-слой), при этом «новые» порции Gn слоя продолжают откладываться со стороны плазмалеммы. Постепенно толщина внешнего слоя увеличивается, и в зрелом волокне Gn-слой исчезает, целиком трансформируясь в G-слой. Эти процессы сопряжены с изменением кристалличности целлюлозы и с постсинтетической модификацией тканеспецифичного галактана (Andeme-Onzighi et al., 2000; Gorshkova, Morvan, 2006). При этом модификации галактана должны проходить таким образом, чтобы появилась возможность латерального взаимодействия микрофибрилл целлюлозы. Латеральное взаимодействие микрофибрилл целлюлозы обуславливает повышение ее кристалличности и создание более плотного G-слоя.
Постсинтетическая модификация полисахарида предполагает наличие в клеточной стенке соответствующих ферментов, поиск и характеристика которых являлись задачами представленной работы. Нами было установлено присутствие в волокнах льна тканеспецифичной 0-галактозидазы, секретируемой во вторичную клеточную стенку желатинозного типа. Продемонстрирована активация экспрессии гена этого фермента на соответствующей стадии развития волокон. Показано, что нативным субстратом для выявленной Р-галактозидазы может служить ткане- и стадия-специфичный галактан сложной структуры.
Дополняя высказанную выше гипотезу, мы предполагаем, что после встраивания в клеточную стенку Р-галактозидаза гидролизует длинные боковые цепочки галактана, что позволяет микрофибриллам целлюлозы латерально взаимодействовать. Оставшийся между микрофибриллами «запечатанный» полисахарид приводит к их изгибу, что создает в клеточной стенке некоторое натяжение (рис. 42).
Окончательно убедиться в том, что идентифицированная р-галактозидаза участвует в модификации тканеспецифичного галактана, которая обуславливает трансформацию Gn-слоя в G-слой клеточной стенки, помог анализ изменений, происходящих в структуре клеточной стенки волокон, в которых понижена экспрессия тканеспецифичной 0-галактозидазы. Подавление активности Р-галактозидазы приводит к нарушению нормального хода трансформации слоев клеточной стенки. Увеличение содержания в клеточной стенке волокон галактана, слабо связанного с целлюлозой, сопровождается увеличением доли Gn-слоя от общей толщины клеточной стенки в трансгенных растениях. Это доказывает, что отличительные особенности структуры Gn-слоя связаны с наличием галактана именно этой фракции. Подавление активности р-галактозидазы приводит к снижению эффективности гидролиза боковых цепочек галактана, слабо связанного с микрофибриллами целлюлозы, вследствие чего микрофибриллы целлюлозы не могут латерально взаимодействовать, а, следовательно, и формировать более плотный, кристалличный слой G.
