Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. CLASS Обзор литератур CLASS ы 7
2.1. Распространение 1,3-р-0-глюканаз, их роль в природе 7
2.2. Субстраты 1,3-Р-О-глюканаз 10
2.3. Представления о механизмах действия 0-гликозилгидролаз 15
2.4. Классификация О-гликозилгидролаз 22
2.5. Сведения оструктуре 1,3-Р-0-глюканаз 28
2.6.1,3-Р-О-Глюканазы грибов 33
2.6.1. Морские грибы как продуценты ферментов 33
2.6.2. Локализация глюканаз в грибах и их роль в образовании клеточной стенки 34
2.6.3. Культивирование грибов, выделение и очистка 1,3-Р-0-глюканаз 38
2.6.4. Свойства 1,3-Р-0-глюканаз грибов 40
3. Материалы и методы исследования 49
3.1. Объекты исследования 49
3.2. Реагенты 49
3.3. Аналитические методы 50
3.4. Определение активности 0-гликозилгидролаз 52
3.5. Выделение и очистка 1,3-р-О-глюканаз 52
3.5.1. 1,3-Р-0-Глюканаза Chaetomium indicum 52
3.5.2. 1,3-Р-О-Глюканаза Trichoderma aureviride 53
3.6. Исследования свойств 54
4. Результаты и их обсуждение 57
4.1. Распространение 0-гликозилгидролаз в морских мицелиальных грибах 57
4.2. Влияние источника углерода в питательной среде на синтез 1,3-Р-0-плюканазы морским грибом Ch. indicum 68
4.3. 1,3-р-0-Глюканаза морского гриба Ch. indicum 70
4.3.1. Выделение и очистка фермента 70
4.3.2. Свойства 1,3-Р-Б-глюканазы Ch. indicum 74
4.4. 1,3-Р-О-глюканаза морского гриба Т. aureviride 82
4.4.1. Выделение и очистка фермента 82
4.4.2. Свойства 1,3-р-0-глюканаз Т. aureviride 86
4.5. Сравнение свойств 1,3-Р-0-глюканаз Ch. indicum и Т. aureviride. Сравнительная оценка трансгликозилирующей активности 1,3-Р-Б-глюканаз морских и наземных организмов 93
4.6. Регуляция активности и состава О-гликозилгидролаз в морских и наземных организмах под действием различных факторов 100
4.6.1. Влияние метаболитов морских грибов на активность О-гликозилгидролаз морских моллюсков 100
4.6.2. Влияние белкового ингибитора 1,3-Р-0-глюканаз морских моллюсков, выделенного из бурой водоросли L. cichorioides, на синтез О-гликозилгидролаз морскими грибами 106
4.6.3. Влияние вируса мозаики сои на активность О-гликозилгидролаз в листьях сои разных по устойчивости сортов 107
Выводы .111
Список литературы... 113
- Сведения оструктуре 1,3-Р-0-глюканаз
- Влияние источника углерода в питательной среде на синтез 1,3-Р-0-плюканазы морским грибом Ch. indicum
- Выделение и очистка фермента
- Влияние метаболитов морских грибов на активность О-гликозилгидролаз морских моллюсков
Введение к работе
Значительный интерес к О-гликозилгидролазам и, в частности, к 1,3-P-D-глюканазам связан с их важной ролью в жизнедеятельности микро- и макроорганизмов. 1,3-Р-0-Глюканазы входят в состав пищеварительных ферментов морских и наземных беспозвоночных, PR-белков высших растений, участвуют в репродуктивных процессах и защитных реакциях различных организмов. Способность этих ферментов расщеплять клеточные глюканы определяет не только их прямое участие в утилизации углеводсодержащих биополимеров различными организмами, но и регуляторную функцию в клетке. Еще одной важной причиной внимания к 1,3-Р-0-глюканазам является возможность их применения в качестве новых катализаторов для различных биотехнологических процессов. Расширение общих знаний о глюканазах и, особенно, получение новых ценных препаратов для биотехнологии может дать изучение ферментных систем морских мицелиальных грибов.
Обитатели моря являются самой мало изученной среди экологических групп
* грибов. Морфологические признаки и биохимические свойства морских грибов
обусловлены влиянием таких специфических факторов среды обитания, как
высокая концентрация солей, относительная гипоксия, гидростатическое давление,
слабо щелочное рН, низкие температуры. Исследованиями микологов показано,
что основная численность экологической группы грибов моря представлена
вторичными морскими грибами. Адаптацию грибов в море, в первую очередь,
щ обеспечивают ферментные системы, свойства которых могут отличаться от
ферментных систем наземных видов. Морские грибы, обладающие эффективным и разносторонним ферментным аппаратом, активно участвуют в жизни моря и являются одним из звеньев пищевых цепей. Большая часть работ по ферментам морских грибов традиционно посвящена целлюлазам. Однако показано, что грибы, обитающие в морской среде, способны продуцировать и другие О-гликозилгидролазы: 1,3-Р-0-глюканазы, амилазы, гликозидазы. Исследования, касающиеся распространения О-гликозилгидролаз в морских грибах, их свойств, структуры, специфичности, механизма действия, практически не проводились.
Нами проведены систематические исследования распространенности О-гликозилгидролаз в морских грибах, собранных в различных регионах Тихого океана, выделены и охарактеризованы 1,3-Р-0-глюканазы из двух видов морских мицелиальных грибов, исследованы некоторые аспекты взаимного влияния метаболитов водорослей, морских грибов и беспозвоночных.
Так как изучены 1,3~Р-В-глюканазы (и особенно продуцируемые морскими грибами) значительно меньше, чем целлюлазы, амилазы, лизоцимы, в обзоре литературы некоторые вопросы рассмотрены на примере наиболее близких к 1,3-0-D-глюканазам ферментов - целлюлаз, даются общие представления о классификации и механизме действие всей группы Огликозилгидролаз.
7 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Сведения оструктуре 1,3-Р-0-глюканаз
В ряду известных 90 семейств, объединяющих О-гликозилгидролазы по сходству аминокислотной последовательности, 1,3-(3-В-глюканазы присутствуют в семействах GH-5, GH-16, GH-17, GH-55, GH-64, GH-81. Среди представителей этих семейств, в которые входят так же целлюлазы, ксиланазы, маннозидазы и др., 1,3-P-D-глюканазы составляют около 22 % (Coutinho, Henrissat, 1999). Дефицит изученности этих ферментов особенно заметен в сравнении с амилазами, целлюлазами, лизоцимами. В то же время, возможно в силу своей многофункциональности, 1,3-Р-0-глюканазы сочетают в себе все многообразие свойств, присущее О-гликозилгидролазам, что делает эту группу ферментов несомненно интересной для изучения механизмов действия карбогидраз.
В структурном отношении наиболее изучены 1,3-р-0-глюканазы высших растений (Linthorst et al., 1990; Hrmova et al., 1995). В последние годы установлены структуры целого ряда 1,3-P-D-глюканаз высших растений, входящих в состав PR-белков и играющих ключевую роль в механизме защиты растений. Определена последовательность генов, кодирующих кислые и основные 1,3-Р-О-глюканазы табака (Linthorst et al., 1990), картофеля (Beerhues, Kombrink, 1994), риса (Yamaguchi et al., 2002). Проведено сравнение субстратной специфичности, деталей трехмерной структуры молекул и положения каталитических аминокислот двух групп p-D-глюканаз ячменя: 1,3- и 1,3;1,4-Р-0-глюканаз. Показана высокая гомология структуры ферментов, сделаны некоторые предположения об эволюции субстратной специфичности этих двух классов 1,3-P-D-глюканаз (Hoj, Fincher, 1995).
В 1996 г. установлена первая структура 1,3-Р-Б-глюканазы животного происхождения из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа S. purpuratus (Bachman, McClay, 1996). Анализ базы данных показал существешгую гомологию аминокислотной последовательности с 1,3-Р-0-глюканазами из двух видов бактерий и фактора системы свертывания крови из подковообразного краба Tachypleus tridentatus (рис. 5). Недавно сотрудниками ТИБОХ ДВО РАН проведено клонирование 1,3-Р-0-глюканазы из кристаллического стебелька морского моллюска S. sachalinensis. Аминокислотная последовательность 1,3-р-Э-глюканазы этого моллюска имеет около 40 % сходства с последовательностью 1,3-p-D-глюканазы из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа S. purpuratus и отнесена к семейству GH-16 О-гликозилгидролаз (неопубликованные данные).
1,3-Р-0-Глюканаза, обладающая уникальной специфичностью, т.к. основным продуктом ферментативного гидролиза 1,3-Р-Б-глюканов является ламинарипентаоза, была обнаружена в бактерии S. matensis (Nakabayashi et al., 1998). Клонирован ген этого фермента и определена его первичная структура, согласно которой 1,3-Р-0-глюканаза S. matensis отнесена к семейству GH-64 О-гликозилгидролаз. Установлена гомология участка полипептидной цепи 1,3-р-D-глюканазы 5!. matensis с последовательностью каталитических доменов 1,3-P-D-глюканаз О. xanthineolytica и Arthrobacter sp. штамма YCWD3. Было показано, что 1,3-р-0-глюканаза S. matensis существует в растворе в виде мономера и гидролизует субстрат с обращением конфигурации расщепляемой связи (Nishimura et al., 2001). Это первая информация о механизме действия О-гликозилгидролазы, относящейся к семейству GH-64 и первая структурная характеристика «обращающей» 1,3-Р-Б-глюканазы. Одной из наиболее глубоко изученных 1,3-p-D-глюканаз является экзо-1,3-р-0-глюканаза патогена человека - дрожжей С. albicans. Фермент катализирует гидролитическое отщепление глюкозного остатка с невосстанавливающего конца 1,3-Р-0-глюкана и в меньшей степени - 1,6-p-D-глюкана с сохранением конфигурации расщепляемой связи. Экзо-1,3-р-0-глюканаза С. albicans обладает также трансфертной активностью, т.е. имеет свойства, нехарактерные для ферментов экзо-типа действия. Молекула фермента состоит из 400 аминокислотных остатков и по данным первичной последовательности отнесена к семейству GH-5 О-гликозилгидролаз.
Как мы упоминали ранее (раздел "Современная классификация О-гликозилгидролаз"), это семейство включает многие бактериальные целлюлазы (эндо-1,4-Р-0-глюканазы). Представители этого семейства, несмотря на определенные различия в первичной структуре, обладают общим механизмом действия и имеют 8 консервативных аминокислотных остатков, формирующих активный центр. Методом направленного мутагенеза в активном центре экзо-1,3-Р-D-глюканазы С. albicans идентифицированы каталитические остатки Glu 192 (протон-донорная группа) и Glu 292 (нуклеофильная группа). Пространственные структуры экзо-1,3-рМ глюканазы в свободной форме и ее комплексов с ингибиторами установлены рентгеноструктурным анализом с разрешением 1,9 А. Показано, что основой структуры фермента является (Ра)8-бочка (ТИМ-бочка) с активным центром, расположенным в глубоком кармане. Рентгеноструктурный анализ экзо-1,3-Р-Б-глкжаназы, связанной с ингибиторами, взаимодействующими с ней по различным механизмам: 2,4-динитрофенил-2-дезокси-2-фтор-Р-В 31 глюкопиранозидом с образованием ковалентной связи и полигидроксилированным индолизиновым алкалоидом кастаноспермином без образования ковалентной связи, показал, что связывание происходит на -1 подцентре молекулы фермента. Главную роль в связывании водорода играет остаток Glu 27. Только при условии изменения конформации концевого остатка глюкозы из формы кресла в форму лодки возможно проникновение молекулы глюкана в карман 1,3-р-0-глюканазы. Второй глюкозный подцентр расположен на входе в карман и зажат между двумя антипараллельными боковыми цепями остатков фенилаланина. Этот подцентр не только направляет субстрат в карман, но также может связывать и молекулу акцептора, участвующую в реакции переноса (Cutfield et al., 1999).
Была установлена структура внеклеточной эндо-1,3-р-В-глюканазы микопаразитического гриба Т. harzianum (de la Cruz et al., 1995). Это первая структура, описанная для 1,3-Р-0-глюканаз мицелиальных грибов. Фермент расщепляет ламинаран по эндо-типу с образованием низкомолекулярных продуктов: глюкозы, ламинарибиозы и ламинаритетраозы, а также действует на периодатно-окисленный ламинаран. Сравнение с аминокислотными последовательностями других P-D-глюканаз бактерий, дрожжей и растений показало, что структура молекулы эндо-1,3-Р-0-глюканазы Т. harzianum имеет два основных отличия. Во-первых, в молекуле отсутствует высоко консервативный участок, который окружает остатки глутаминовои кислоты, участвующие в каталитическом акте. С другой стороны, в молекуле фермента из Т. harzianum имеется обогащенная цистеином область, отсутствующая у других p-D-глюканаз, но обнаруженная в белках, связывающих специфические компоненты мембраны. Согласно полученным данным, эндо-1,3-р-Б-глюканаза Т. harzianum отнесена к новому классу 1,3-Р-О-глюканаз, а в дальнейшем по современной классификации (Nishimura et al., 2001) была включена в семейство GH-55.
Для некоторых 1,3-Р-Б-глюканаз грибов установлены только элементы структуры. Показано, что 1,3-р-О-глюканазы грибов часто являются гликопротеинами (Халмуратов и др., 1996; Galan et al., 1999). В молекуле 1,3-P-D-глюканазы Aspergillus saitoi на долю белкового компонента приходится более чем 60 %, а углеводного - 11 %. Аминокислотный анализ 1,3-Р-Б-глюканазы из культуралыюй жидкости С. utilis выявил высокое содержание кислых аминокислот. Молекула этого фермента содержит около 20 % углеводов (Villa et al., 1976). Экзо-1,3-Р-0-глюканаза, выделенная из клеточных стенок С. utilis, представляет собой кислый гликопротеин, в составе которого преобладают углеводы (68 %) (Notario et al., 1976). Гликозилированы эндо- (Fontaine et al., 1997) и 2 формы (мономер и димер) экзо-1,3-Р 0-глюканаз A. fumigatus (Fontaine et al., 1997). Было показано, что в эндо-1,3-p-D-глюканазе углеводная компонента, состоящая из остатков маннозы, связана с молекулой белка О-гликозидной связью, а в экзо-ферментах N-гликозидной связью.
Для литического фермента из Rhizopus chinensis R-69 (Yamamoto et al., 1974) определены N-концевая аминокислота (Val) и С-концевая последовательность (Asphr-Ala-Gly-Ser). Отсутствие связывания с конканавалином А свидетельствует о том (Biely et al., 1976), что эндо-1,3-р-0-глюканаза S. cerevisiae не содержит высокоразветвлённого маннана в своей структуре, хотя 3K3o-l,3-p-D-глюканаза из этого же источника являлась гликопротеином. Была установлена N-концевая последовательность (40 аминокислотных остатков) литической термоактивной 1,3-Р-0-глюканазы из актиномицета О. xanthineolytica, которая показала высокую гомологию с N-концевой последовательностью двух 1,3-p-D-глюканаз: Rhodothermus marinus (51 %) и В. circulans (41 %) (Parrado et al., 1996). После установления полной аминокислотной последовательности все глюканазы были отнесены к семейству GH-16 О-гликозилгидролаз.
Влияние источника углерода в питательной среде на синтез 1,3-Р-0-плюканазы морским грибом Ch. indicum
Для углубленного исследования была выбрана 1,3-Р-ГЗ-глюканаза морского факультативного гриба Ch. indicum. Систематическое положение морского гриба представлено ниже (Ainsworth and Bisby s Dictionary of the Fungi, 2001): і Отдел Ascomycota Класс Ascomycetes Подкласс Sordariomycetidae Порядок Sordariales Семейство Chaetomiaceae Род Chaetomium Chaetomium indicum Corda Известно, что уровень продуцирования ферментов микроорганизмами в значительной степени зависит от источника углерода в питательной среде (Pitson et al., 1991; Stahmann et al., 1993; Pitson et al., 1997; El-Katatny et al., 2000; Noronha et al., 2000). Глюкоза и некоторые легкоусвояемые источники углерода могут быть причиной торможения синтеза гидролаз, а трудно усвояемые источники питания являются эффективными индукторами биосинтеза. Было показано, что при внесении в питательную среду для культивирования морской бактерии Alteromonas sp. 40 МС ламинарана биосинтез щелочной фосфатазы увеличивался в 15 раз и индуцировался синтез активной 1,3-р-0-глюканазы (Сова и др., 1995). В зависимости от условий культивирования (рН среды и источника углерода) факультативный морской гриб A. /Iavipes продуцировал различные формы амилолитических ферментов (Фролова и др., 2002).
С целью выбора оптимальных условий для роста культуры мицелиального гриба Ch. indicum и синтеза 1,3-р-Б-глюканазы нами была исследована зависимость синтеза фермента от используемого источника углерода. Культивирование штамма проводили в течение 16 дней на средах, содержащих в качестве источника углерода вещества, приведенные в таблице 5. Пробы культуральной жидкости для тестирования 1,3-Р-0-глюканазной активности отбирали с интервалом в 24 ч. На рисунке 9 приведены наиболее характерные кривые изменения активности 1,3-р-В-глюканазы в культуральной жидкости Ch. indicum в процессе роста на трех различных средах. Результаты эксперимента показали, что продуцирование фермента начиналось на пятый день роста культуры и проходило с различной интенсивностью в течение исследуемого периода роста гриба. Максимальный выход фермента во всех вариантах опыта отмечался на 14-15 день, затем наблюдался спад ферментативной активности, который связан с истощением питательной среды. Продуцирование 1,3-Р-0-глюканазы происходило при использовании всех источников углерода, что позволяет считать ее конститутивным ферментом. В таблице 5 приведены значения уровня 1,3-P-D-глюканазы на 12 сутки культивирования.
Максимальная удельная активность фермента обнаружена в культуралыюй жидкости при добавлении в питательную среду ламинарана в концентрации 2 г/л, концентрация 0,5 г/л оказалась недостаточной для эффективного синтеза 1,3-P-D-глюканазы (табл. 5). Согласно опубликованным данным (Noronha et al., 2000), ламинаран оказался также наилучшим источником углерода для синтеза 1,3-Р-0-глюканазы грибом Т. harzianum. Можно предположить, что синтез 1,3-Р-0-глюканазы морским грибом СИ. indicum подвержен катаболической репрессии. Свойства репрессоров в данном эксперименте проявили глицерин и хитозан. Катаболическая репрессия синтеза 1,3-Р-0-глюканазы под влиянием глицерина, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, галактозы, фруктозы, сахарозы, яблочной кислоты описана для разных видов грибов (Тиунова и др., 1983; Pitson et al., 1991; Pitson et al., 1993; Pitson et al., 1997; Ramot et al., 2000).
Выделение и очистка фермента
Нами была исследована 1,3-р-О-глюканаза факультативного гриба Т. aureviride - одного из лучших продуцентов данного фермента среди штаммов, собранных в донных осадках Южно-Китайского моря. Систематическое положение Т. aureviride представлено ниже (Ainsworth and Bisby s Dictionary of the Fungi, 2001):
Отдел Anamorfic fungi Род Trichoderma Trichoderma aureviride Rifai Присутствие 1,3-р-0-глюканазы и других О-гликозилгидролаз (амилазы, пустуланазы, М-ацетил-Р-О-глюкозаминидазы, p-D-глюкозидазы и p-D-галактозидазы) было обнаружено нами как в культуральной жидкости Т. aureviride (внеклеточные или секретируемые ферменты), так и в мицелии (внутриклеточные) этого вида. Однако в мицелии содержалось не более 5-Ю % от общего количества единиц активности каждого фермента.
Последовательность стадий очистки 1,3-Р-Б-глюканаз морского гриба Т. aureviride представлена на рисунке 22. Комбинацией методов ультрафильтрации, гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе 6 Fast Flow (рис. 23, 24) и ионообменной хроматографии на 15 Q РЕ и 15 S РЕ (FPLC) (рис. 25,26) с выходом 1-2 % были получены препараты 1,3-р-0-глюканаз, не содержащие сопутствующих О-гликозилгидролаз, из культуральной жидкости (3 ед. активности) и мицелия (около 0,5 ед. активности). Хроматографическое поведение внеклеточной и мицелиальной 1,3-р-О-глюканаз было одинаковым, поэтому приводятся данные, полученные при очистке внеклеточной формы (рис. 23-26).
Рехроматография 1,3-Р-Б-глкжаназы Т. aureviride на колонке (1 4,7 см) с Phenyl-Sepharose 6В в линейном градиенте концентрации (NH SCU (0,5-0 М) в 0,05 М сукцинатном буфере, рН 5,2, скорость элюции 0,8 мл/мин.
Исследованы свойства выделенных 1,3-р-0-глюканаз (Бурцева и др., 2003). Глюканазы имели различные температурные оптимумы: внеклеточная 1,3-p-D-глюканаза - 40С, а внутриклеточная - 55С (рис. 27). Значения температурных оптимумов известных 1,3-р-0-глюканаз грибов лежат в пределах от 30 до 65С (Reichelt, Fleet, 1981; Pitson et al., 1995).
Внеклеточная 1,3-р-Б-глюканаза была заметно стабильней (рис. 28) по отношению к температуре, хотя рН-стабильность ферментов была одинаковой. Известно, что для большинства 1,3-р-0-глюканаз грибов характерны оптимумы рН
в диапазоне от 4 до 6 (Brown, Embil, 1987; Wang, Yin, 1998), и лишь некоторые имеют нейтральные значения (Fontaine et al., 1997 а). Как показали исследования зависимости активности внеклеточной и мицелиальной 1,3-р-0-глюканаз Т. aureviride от рН, значения оптимумов рН ферментов лежали в слабо кислой области (рис. 29). Особенностью зависимости активности внеклеточной 1,3-p-D-глюканазы от рН явилось наличие двух максимумов: при рН 5,2 и 6,2 (рис. 29 а), что, как и в случае с 1,3-р-0-глюканазой Ch. indicum (Бурцева и др., 2000), не исключает присутствия в высокоочищенном препарате двух форм фермента. Многокомпонентность 1,3-р-О-глюканаз грибов хорошо известна, и не всегда эти множественные формы удается разделить (Vazquez-Garciduenas et al., 1998). Предварительные эксперименты показали, что характер накопления продуктов при гидролизе ламинарана внеклеточной 1,3-р-Э-глюканазой Т. aureviride при рН 5,2 и 6,2 полностью идентичен, поэтому все дальнейшие исследования свойств 1,3-р-Б-глюканаз из культуральнои жидкости проводились нами при значениях рН 5,2.
При комнатной температуре 1,3-Р-0-глюканазы были стабильны в диапазоне рН от 4,5 до 7,5 в течение суток, при рН 3 и 4 ферменты полностью теряли активность за 6 ч. Величины Km для 1,3-р-Э-глюканаз из культуральной жидкости и мицелия Т. aureviride при гидролизе ламинарана полностью совпадали (0,3 мг/мл) и были близки полученным для 1,3-р-Б-глюканаз других грибов (рис. 30). Согласно опубликованным данным, Km для трех внеклеточных экзо-1,3-р-0-глюканаз мицелиального гриба A. persicinum имели значения 0,1; 0,23 и 0,22 мг/мл, а для эндо-1,3-р-В-глюканазы A. fumigatus - 0,3 мг/мл (Pitson et al., 1995; Fontaine et al., 1997 a).
Влияние метаболитов морских грибов на активность О-гликозилгидролаз морских моллюсков
Большой интерес вызывают как природные, так и синтетические эффекторы ферментов, катализирующих гидролиз О-гликозидных связей в углеводсодержащих соединениях. Наиболее исследованы ингибиторы гликозидаз и амилаз, которые уже нашли применение, например, для лечения болезней, связанных с нарушением углеводного обмена (Winchester, Fleet, 1992; Morrison et al., 2000). 1,3-Р-0-Глюканазы также широко распространены в природе, как амилазы, однако изучены в гораздо меньшей степени. Ингибиторы и активаторы 1,3-3-0-глюканаз различной химической природы обнаружены нами в морских беспозвоночных и бурых водорослях (Сова и др., 1992; Звягинцева и др., 1998). Проводятся исследования свойств этих эффекторов, их структурных характеристик и влияния на процессы, в которых участвуют О-гликозилгидролазы (Бакунина и др., 1991; Yermakova et al., 2002). В последние годы возрастает интерес к изучению морских грибов в связи с обнаружением у них новых метаболитов, отсутствующих у наземных видов (Kobayashi, Ishibashi, 1993; Liberra, Lindeauist, 1995). Эти метаболиты могут проявлять биологическую активность. Показано, например, что морские грибы продуцируют метаболиты, токсичные по отношению к одноклеточной морской водоросли Dunaliella sp. (Jenkins et al., 1998). Нами был проведен поиск эффекторов О-гликозилгидролаз среди метаболитов морских грибов.
Для обнаружения в морских грибах метаболитов, способных влиять на активность пищеварительных ферментов морских моллюсков, были выбраны: эндо-1,3-р-0-глюканаза из кристаллического стебелька двустворчатого моллюска S. sachalinensis - катализирующая гидролиз полимерного глюкана ламинарана и f$-D-глюкозидаза из гепатопанкреаса брюхоногого моллюска Littorina kurila -действующая на гликозиды и олигосахариды. Проанализированы культуральные жидкости 62 штаммов, принадлежащих к 18 родам морских грибов, собранных в Японском море и в районе Курильских островов (табл. 12).
Как для эндо-1,3-Р-0-глюканазы, так и для P-D-глюкозидазы получены аналогичные результаты. Большая часть образцов культуральной жидкости морских грибов обладала активирующим действием на ферменты: 66 % и 71 % образцов активировали, 18 % и 7 % ингибировали, 16 % и 22 % не влияли на активность эндо-1,3-3-0-глюканазы и P-D-глюкозидазы, соответственно (рис. 35).
Метаболиты грибов из разных мест обитания: из грунта и ассоциированные с морскими беспозвоночными, имели практически одинаковый спектр действия на активность эндо-1,3-р-0-глюканазы S. sachalinensis (рис. 36а). В случае P-D-глюкозидазы L. kurila этот спектр заметно менялся (рис. 366). В таблице 12 представлены только те морские грибы, метаболиты которых оказали влияние на активность ферментов морских моллюсков. Величины этих эффектов не были значительными. Максимальный ингибирующий эффект (около 60 %) на 1,3-P-D-глюканазу проявили вещества, продуцируемые грибами: Fusarium sp., С. brevi-compactum и С. sphaerospermum. Наибольшим активирующим действием на 1,3-Р-D-глюканазу обладал культуральный фильтрат морского гриба F. oxysporum var. orthoceras (на 132 %), а на p-D-глюкозидазу - О. truncatum (на 65 %).
Было установлено, что практически для всех активных образцов культуральных фильтратов наблюдалась зависимость эффекта действия от концентрации метаболитов в пробе. В некоторых случаях максимальный процент ингибирования наблюдался при низких концентрациях, а при более высоких концентрациях ингибирующий эффект снижался. Подобная зависимость была замечена при исследовании экстрактивных веществ из бурых водорослей
Продуцирование морскими грибами метаболитов, влияющих на активность О-гликозилгидролаз в зависимости от места обитания, а - эндо-1,3-Р-0-глюканазы S. sachalinensis; б - P-D-глюкозидазы L. kurila. Цифры в скобках - число штаммов.
(Ермакова, 2002). Возможно, это свидетельствует о присутствии в экстрактах водорослей и культуральнои среде морских грибов как ингибиторов, так и активаторов ферментов, и мы наблюдаем лишь результирующий суммарный эффект. На рисунке 37 приведена одна из кривых для штаммов, культуральные фильтраты которых проявили ингибирующее действие. Подобная зависимость (увеличение эффективности действия при более низких концентрациях) наблюдалась и для штаммов, метаболиты которых показали активирующее действие (рис. 38).
