Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
1.1 Лигнинолитическая система базидиальных грибов 9
1.1.1 Лигнинолитический комплекс грибов 9
1.1.2 Множественные формы лигиинолитических ферментов 10
1.1.3 Синергизм действия лигиинолитических ферментов, роль марганца в процессе деградации лигнина 13
1.2 Основные ферменты лигнинолитического комплекса базидиомицетов 18
1.2.1 Лакказа 18
1.2.2 Лигнинпероксидаза 34
1.2.3 Марганецпероксидаза 37
1.3 Базидиальные грибы рода trametes 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 45
2.1 Материалы и объекты исследования 45
2.1.1 Штаммы микроорганизмов и ферменты 45
2.1.2 Носители для хроматографии 45
2.1.3 Реагенты 45
2.2 Культивирование базидиомицета trametes pubescens 46
2.2.1 Культивирование на глюкозо-аммонийной среде 46
2.2.2 Культивирование на мелассе 47
2.3 Выделение и очистка ферментов 47
2.4 Определение молекулярной массы и изоэлектрофокусирование 48
2.5 Контроль активности ферментов 48
2.5.1 Контроль активности лакказы 49
2.5.2 Контроль активности лигнинпероксидазы 49
2.5.3 Контроль активности марганецпероксидазы 49
2.5.4 Определение активности целлобиозодегидрогеназы 49
2.6 Кинетические измерения и рн-зависимость 50
2.6.1 Регистрация окисления ионов Мп + до Мп +, катализируемого лакказой 50
2.6.2 Исследование продуктов реакции окисления ионов Мп +, катализируемой лакказой 51
2.7 Аналитические методы 51
2.7.1 Определение концентрации белка 51
2.7.2 Определение металлов 51
2.7.3 Определение углеводной части лакказ 52
2.8 Спектральные исследования 52
2.9 Масс-спектроскопические исследования 52
2.9.1 Расщепление белков 52
2.9.2 MALDI-массспектроскопия 53
2.9.3 Расчет данных 53
2.10 Электрохимические исследования 54
2.10.1 Приготовление электродов 54
2.10.2 Циклические вольтамперометрические измерения 54
2.10.3. Амперометрические исследования биосенсоров 55
2.10.4 Определение окислитиельно-восстановителъного потенциала ТІ центра лакказы 55
ГЛАВА 3. Результаты исследования 57
3.1 Выделение и очистка ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета trametes pubescens 57
3.2. Физико-химические свойства ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета trametes pubescens 61
3.2.1 Основные биохимические свойства ферментов 61
3.2.2 Основные спектральные свойства ферментов 64
3.3 Сравнительные исследования двух множественных форм лакказ базидиомицета trametes pubescens 70
3.3.1 Исследование субстратной специфичности, рН-оптимума и стабильности двух форм лакказ 70
3.3.2 Электрохимические исследования двух форм лакказ 73
3.3.3 Масс-спектроскопические исследования двух форм лакказ 79
3.4 Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов базидиомицета trametes pubescens при деградации модельных соединений лигнина 81
3.4.1 Ионы Мп + - нетрадиционный субстрат лакказы гриба Т. pubescens 81
3.4.2 Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов базидиомицета Trametes pubescens 88
3.5 Разработка амперометрического биосенсора для определения фенольных соединений на основе частично очищенного препарата культурального фильтрата базидиомицета trametes pubescens 90
ГЛАВА 4. Обсуждение... 96
Выводы 107
Список цитируемой литературы 108
- Синергизм действия лигиинолитических ферментов, роль марганца в процессе деградации лигнина
- Базидиальные грибы рода trametes
- Определение окислитиельно-восстановителъного потенциала ТІ центра лакказы
- Выделение и очистка ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета trametes pubescens
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди огромного разнообразия грибов, колонизирующих в природе древесные субстраты, ксилотрофы составляют одну из наиболее изученных групп, обладающую значительной ролью в превращении отмирающей древесины в природе. Кроме того, эти грибы, особенно, возбудители белой гнили, традиционно рассматриваются и как источники разнообразных ферментов для трансформации древесины.
В последнее десятилетие большое число работ посвящено поиску и изучению новых штаммов базидиальных грибов - продуцентов лигнинолитических ферментов, и нахождению ферментов с новыми физико-химическими свойствами, что связано с широкими прикладными аспектами их использования. Например, получение биопластика, биотопливных элементов, биодеградации ксенобиотиков, производстве антимикробных средств, синтетических моющих и косметических средств, использовании ферментов в органическом синтезе, аналитических системах (биосенсоры и иммуноанализ), текстильной, пищевой и целлюлозно-бумажной промышленностях. Практический интерес к изучению ферментов обусловлен, прежде всего, их каталитическими характеристиками: активностью и специфичностью действия.
Известно, что лакказа является одним из основных ферментов лигнинолитического комплекса и продуцируется дереворазрушающими грибами, наиболее изученным из которых является базидиомицет Trametes versicolor. Однако, несмотря на значительное число публикаций, касающихся фундаментальных исследований этого фермента, роль лакказы в деградации лигнина до конца не ясна. Современные исследования базидиальных грибов в этой области показали, что лакказа в сочетании с другими ферментами лигнинолитического комплекса - марганецпероксидазой (МпР) или лигнинпероксидазой (UP), может выполнять существенно более значимые функции при деградации лигнина, чем простое окисление его фенольных подструктур [Higuchi, 2004; Shleev et. al., 2006].
В последние 20 лет в мире активно разрабатываются биотехнологические способы удаления лигнина с помощью дереворазрушающих грибов либо посредством лигнинразлагающих ферментов этих организмов. Особый интерес представляет проблема механизма регуляции активности лигнинолитических ферментов в грибах. Возможное ее решение, на наш взгляд, состоит в выделении отдельных ферментов лигнинолитического комплекса и выяснение роли каждого их них в составе данного ферментативного комплекса, исходя из результатов детального исследования свойств индивидуальных ферментов.
Состояние проблемы. Способность к глубокому разложению и усвоению лигнина встречается у грибов различных таксономических групп, в частности, у аскомицетов [Rodriguez et. al., 1997; Bergbauer and Newell, 1992], но особенно выражена она у базидиомицетов [Eriksson et. al., 1990; Palmieri et. al., 1993]. Внеклеточные ферментные системы этих грибов построены наиболее сложно и, как правило, включают спектр множественных форм оксидоредуктаз следующих трех основных структурных типов: гемм-содержащие, флавинсодержащие и медьсодержащие ферменты [Farmer et. al., 1960; Kuwahara et. al., 1984; Tien and Kirk, 1984; Kirk and Shimada, 1985; Kersten and Kierk, 1987; Bourbonnais and Paice, 1990; Болобова с соавт., 2002].
Для лигнинразрушающих грибов, например, Phanerochaete chrysosporium, Ceriporiopsis subvermispora и Trametes gallica, характерно образование множественных форм лакказ и других ключевых ферментов разрушения лигнина -МпР и LiP. Это явление образования множественных форм ферментов широко распространено среди лигнинолитических грибов, хотя его физиологическая роль до настоящего времени точно не установлена [Karahanian et. al., 1998; Larrondo et. al., 2003; Palmieri et. al., 2003]. По известному изоферментному составу можно успешно идентифицировать множество различных микроорганизмов, в частности грибов, таких как эктомикоризальные грибы [Sims et. al., 1999], дейтериомицеты [Buddie et. al., 1999] и базидиомицеты [Zervakis et. al., 2001].
Вызывает интерес также исследование возможных взаимосвязей, возникающих между отдельными ферментами, входящими в состав лигнинолитического комплекса базидиальных грибов. Из литературных данных
известно, что наличие ионов металлов переменной валентности в древесине является необходимым условием для нормального функционирования грибных окислительно-восстановительных ферментов. Особенно важным в этом отношении является наличие ионов марганца. Именно двухвалентный марганец является основным субстратом МпР, а также играет значительную роль в каталитическом цикле UP [Рорр et. al., 1990; Болобова с соавт., 2002].
Ранее было показано, что лакказа из базидиомицета Trametes versicolor катализирует окисление ионов Мп2+до Мп3+в присутствии хелатирующего агента -Na-пирофосфата [Hofer and Schlosser, 1999]. Использование анионов оксалата и малоната в качестве комплексующих агентов ионов Мп3+ ведет к образованию супероксиданион радикала с последующим его превращением в пероксид водорода [Schlosser and Hofer, 2002]. В этой связи важным представляется выявление возможности протекания этих реакций с лакказами из других источников для установления роли этого фермента при функционировании лигнинолитического комплекса дереворазрушающих грибов и изучение кооперативного действия лакказы с другими лигнинолитическими ферментами. Кроме того, изучение согласованного действия основных ферментов лигнинолитического комплекса (лакказы, LiP и МпР) в присутствии ионов марганца, как природного редокс-медиатора, может прояснить ферментативный и неферментативный механизмы деградации лигнина грибами белой гнили..
Базидиомицет Trametes (Coriolus) pubescens (Schumach.) Pilat может секретировать несколько внеклеточных ферментов, в частности: лакказу, пероксидазу и целлобиозодегидрогеназу [Galhaup et. al., 2001; Galhaup et. al., 2002; Ludwig et. al., 2004]. Он также известен как лекарственный гриб. Штамм Т. pubescens 923-2 является продуцентом биомассы - субстанции для получения биологически активной добавки. Из мицелия и плодовых тел Т. pubescens экстрагируют связанные с белками полисахариды с противоопухолевой и иммунизирующей активностями [Горшина с соавт., 2003]. После отделения биомассы фильтрат культуральной жидкости не используется, и потенциально он может служить источником внеклеточных ферментов.
Понимание роли лигнинолитических ферментов в процессе деградации лигнина, во-первых, открывает возможные пути оптимизации переработки этого полимера. Во-вторых, исследование множественных форм ферментов лигнинразрушающих грибов на примере базидиомицета Т. pubescens представляет несомненный интерес как с точки зрения изучения метаболизма грибов белой гнили, так и с позиции применения данных микроорганизмов для получения ферментных препаратов, которые могут использоваться в различных областях биотехнологии.
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании свойств и закономерностей действия основных компонентов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Т. pubescens - лакказы, UP и МпР. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- Разработка метода очистки и получение гомогенных препаратов основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Т. pubescens: лакказы, UP и МпР.
- Изучение основных физико-химических свойств выделенных ферментов.
- Проведение сравнительных исследований множественных форм лакказ базидиомицета Т. pubescens.
- Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов базидиального гриба Т. pubescens при деградации модельных соединений лигнина. Установление роли каталитического окисления ионов Мп2+ до Мп3+ лакказой в присутствии хелатирующих агентов в данном процессе.
- Разработка биосенсора на основе ферментного препарата лакказы из базидиомицета Т. pubescens.
Синергизм действия лигиинолитических ферментов, роль марганца в процессе деградации лигнина
Основываясь на данных о комплексной структуре макромолекулы лигнина, трудно представить, что этот биополимер может эффективно деградироваться под действием одного единственного фермента. Логично предположить наличие кооперативного взаимодействия между несколькими индивидуальными ферментами в процессе биодеградации лигнина. Хорошо известно, например, что целлюлоза, биополимер с первичной структурой, родственной лигнину, требует для своей трансформации большое количество ферментов, действующих последовательно в процессе гидролиза. Ситуация может быть похожей в случае полимера лигнина. Однако исследователи редко работают с природными образцами лигнина в связи с очень сложной его структурой, а чаще используют модельные низкомолекулярные соединения лигнина (метоксифенольные димеры или олигомеры). После открытия LiP и исследования ее непосредственного действия на макромолекулу лигнина стало ясно, что деполимеризация последнего при участии одного фермента не врзможна. С другой стороны, стало известно, что необходимо присутствие перексида водорода для проявления активности LiP. Поэтому начались исследования систем генерации этого соединения в грибах. Интересно, что одним из основных ферментов, которые генерируют пероксид водорода, является МпР. По этой причине Пасзинский с соавт. предположил наличие кооперации между МпР и LiP при трансформации модельных соединений лигнина [Paszczynski et. al., 1985].
Пять лет спустя Керстен с соавт. предложил использовать вератровый спирт в качестве медиатора в процессе разложения лигнина и, таким образом, упїемил возможность кооперации UP с двумя другими ферментами: глиоксальоксидазой и МпР [Kersten et. al., 1990]. Впервые был продемонстрирован синергетическии эффект при деградации лигнина МпР и лакказой в работе Галиано с соавт. [Galliano et. al., 1991].
Известно, что лакказа катализирует окисление концевых_ароматических кодец, содержащих свободные фенольные гидроксилы. Образующиеся феноксирадикалы могут служить в качестве источника кислорода для глюкозооксидази [Szklarz and Leonowicz, 1986] и арилалкогольоксидазы [Marzullo et. al., 1995], препятствуя полимеризации лигнина [Szklarz and Leonowicz, 1986; Marzullo et al., 1995]. В результате образуется пероксид водорода, который является необходимым субстратом лигнинолитических пероксидаз. ( ТакиМ образом, источником пероксида водорода может служить реакция дисмутации супероксида:
Реакция ускоряется супероксиддисмутазой, которая может промотировать аутоокисление семихинонов. В присутствии ионов Мп2+ супероксиданион-радикал способен также восстанавливаться до пероксида:
Марганец является одним из наиболее распространенных металлов в лигноцеллюлозных материалах, уступая лишь макроэлементам Са, К и Мд [Болобова с соавт., 2002]. Возбудители белой гнили накапливают его в виде МпОг в ходе роста на лигноцеллюлозе и откладывают в черных линиях ксилостромы, содержащих в 100 раз больше Мп, чем здоровая древесина [Blanchette, 1984]. Кроме того, марганец может являться природным медиатором, общим как для МпР, так и для LiP, обеспечивая возможность их кооперации.
Двухвалентный марганец может по-разному влиять на превращение органических субстратов LiP. Он восстанавливает пероксирадикалы до гидропероксидов, служит ловушкой супероксида [Cheton and Archibald, 1988; Coassin et. al., 1992; Tampo and Yonaha, 1992] и, наконец, восстанавливает соединение I UP [Khindaria et. al., 1995; Sutherland et. al., 1995; 1996]. Однако вопрос о том, может ли LiP, подобно МпР, использовать ионы Мп2+ в качестве единственного восстановителя, обеспечивающего полный каталитический цикл фермента, долгое время оставался предметом острых дискуссий. Последние данные свидетельствуют о том, что, в отличие от МпР, LiP, видимо, не осуществляет полный каталитический цикл в присутствии только пероксида водорода и ионов Мп2+. Однако это не исключает превращения двухвалентного марганца на первой стадии каталитического цикла, а также непрямого окисления в каскаде неферментативных реакций, запускаемых LiP. Таким образом, LiP, как и МпР, может в определенных условиях образовывать высокоактивный окислитель в виде иона Mn3+ [Khindaria et. al., 1995; Sutherland et. al., 1995; 1996; Болобова с соавт., 2002].
Ионы трехвалентного марганца извлекаются из активного центра МпР органическими хелаторами и способны непосредственно окислять нефенольные подструктуры лигнина. Дикарбоновые или ст-оксикарбоновые кислоты являются оптимальными комплексонами ионов Мп2+ и Мп3+ и одновременно обеспечивают необходимый рН среды благодаря своим буферным свойствам [Wariishi et. al., 1992; Kuan et. al., 1993]. Образование алифатических органических кислот, в частности, оксалата, de novo [Dutton and Evans, 1996] или в качестве продуктов деградации лигнина [Roy and Achibald, 1993; Hammel et. al., 1994] является характерной особенностью ряда лигнинразрушающих грибов. Такао наблюдал накопление малата, фумарата и сукцината при росте базидиомицетов на среде с СаСОз [Такао, 1965]. Наиболее частым метаболитом является оксалат [Kuan and Tien, 1993; Urzua et. al., 1995; Dutton and Evans, 1996].
Трехвалентный марганец может также окислять карбоновые кислоты с образованием радикалов [Khindaria et. al., 1994; Hofrichter et. al., 1998]. Примером может служить неферментативное циклическое окисление глиоксиловой кислоты, которое ведет к образованию муравьиной кислоты и радикала, последний реагирует с дикислородом, в результате чего образуются диоксид углерода и супероксид (рис. 1) [Urzua et. al., 1998]. Супероксид в свою очередь может окислять ионы Мп2+ до Мп3\ образуя при этом Н202 (см. реакцию 2) [Kuan and Tien, 1993]. В цикле окисления щавелевой кислоты ионами Мп также образуется диоксид углерода и радикал, последний включается в серию таких же неферментативных реакций с образованием ионов Мп3+ (рис. 1) [Urzua et. al., 1998]. Кроме того, комплекс трехвалентного марганца, стабилизированный органическим анионом, может диффундировать в глубь вторичной клеточной стенки и разрушать там определенные нефенольные ароматические структуры
Базидиальные грибы рода trametes
Как отмечалось выше, дереворазрушающие базидиомицеты отличаются высоким содержанием окислительно-восстановительных ферментов, в первую очередь пероксидаз и лакказ. Изучение оксидоредуктаз грибов рода Trametes, как и других грибов белой гнили, связано в первую очередь с их лигнинолитической способностью [Kawai et. al., 1988; Bourbonnais et. al., 1995]. Особенно хорошо изучены наиболее распространенные виды: Т. versicolor, Т. ochracea, Т. hirsuta, Т. trogii.
В работе Томсовского и Хомолка исследована лакказная продукция восьмидесяти трех штаммов, принадлежащих к трем видам одного рода Trametes FR. (Г. versicolor, Т. ochracea и Т. hirsuta), собранных в различной местности и растущих на разных субстратах [Tomsovsky and Homolka, 2003]. Продукция других лигнинолитических ферментов - МпР и UP - детектировалась лишь в 21 штамме. Авторами была обнаружена корреляция между источником штамма гриба (местность произрастания и субстрат) и продукцией ферментов [Tomsovsky and Homolka, 2003].
Наиболее подробно в литературе описаны лигнинолитические ферменты базидиомицета Т. versicolor. Выделено шестнадцать форм LiP и пять форм МпР, среди них охарактеризованы главные изоферменты по основным биохимическим признакам (молекулярная масса, изоэлектрическая точка и субстратная специфичность). Показано наличие некоторых отличий в субстратных специфичностях различных форм как LiP, так и МпР [Johansson and Nyman, 1993]. Исследован кластер, состоящий из трех структурных генов и кодирующий главные изоферменты LiP и МпР гриба Т. versicolor. Показано, что гены, кодирующие LiP и МпР, могут быть близко связаны в хромосоме, и процесс их транскрипции происходит координировано [Johansson and Nyman, 1996]. Выделены и очищены также изоферменты лакказы базидиомицета Т. versicolor, изучены кристаллические структуры данных белков [Antorini et. al., 2002].
Хорошо описан лигнинолитический комплекс базидиомицета Т. trogii. Показано, что данный гриб продуцирует в среду культивирования большое количество лигнинолитических ферментов: лакказу, UP, MnP, CDH, глюкозооксидазу и глиоксальоксидазу [Levin et. al., 2001]. Грибы рода Trametes рассматриваются как продуценты активных ферментов и ферментных комплексов, которые могут найти применение в медицине, промышленности и сельском хозяйстве. Базидиальные грибы-трутовики рода Trametes являются традиционным средством народной медицины Японии (порошок плодовых тел заваривают как чай) и сырьем для выделения лекарственных препаратов. Препараты грибов рода Trametes обладают также антивирусной активностью, усиливают резистентность организма к некоторым инфекционным заболеваниям, оказывают антиатерогенное, антисклеротическое, гиполипидемическое, антиревматическое действие, снижают содержание сахара в крови, повышают приток крови в коронарные сосуды, снижают артериальное давление, оптимизируют содержание белка в крови, а также регулируют образование простагландинов [Горшина с соавт., 2003а]. Trametes pubescens (Schum. ex Fr.) Quel, является сапрофитом на лиственных породах, вызывает белую гниль древесины, растет во вторую половину вегетационного периода (рисунок 8). Новый базидиомицет Т. pubescens сравнительно недавно был идентифицирован как ранее не описанный прекрасный промышленный гриб-продуцент лигнинолитических ферментов [Galhaup and Haltrich, 2001], имеющий широкие биотехнологические возможности [Бирюков с соавт. 2002; Горшина с соавт., 2003; 2003а; Baminger et. al., 2001; Marzorati et. al., 2005].
Австрийской группой ученых был изолирован штамм Т. pubescens MB 89 (=CBS 696,94), изучена генетическая структура гриба, показано, что в геноме присутствуют два гена лакказы и один ген LiP [Galhaup et. al., 2002; GenBank Database, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]. Выделены до гомогенного состояния и частично охарактеризованы одна изоформа лакказы [Galhaup et. al., 2002] и целлобиозодегидрогеназа [Ludwig et. al., 2004], продуцируемые данным штаммом гриба Т. pubescens. Из литературных данных известно, что сухая биомасса лекарственного гриба Т. pubescens обладает противоопухолевым и иммунизирующим действиями, по некоторым данным превышающими по эффективности крестин, наиболее известный и хорошо исследованный высокоочищенный препарат Т. versicolor (L.) С. G. Loyd (каваратаке), выпускаемый японской биотехнологической фирмой «Sankyo Со Ltd.» [Горшина с соавт., 2003а].
Е.С. Горшиной с соавт. разработана и апробирована в заводских условиях отечественная технология получения биологически активной субстанции Т. pubescens, представляющей собой сухую мицелиальную массу монокультуры штамма-продуцента, выращенную в условиях глубинного культивирования на жидкой среде [Бирюков с соавт., 2002; Горшина с соавт., 2003].
Этим же автором изучены 6 штаммов Т. pubescens, по результатам сравнения штамм 923-2 являлся наиболее продуктивным на сахаросодержащих средах, в том числе на наиболее промышленно доступной мелассе, и при этом проявлял высокую стабильность и благоприятный характер роста в глубинной культуре и имел четкие идентификационные признаки [Горшина, 2003]. В настоящее время в промышленности широко применяются технологии безотходного производства. Поэтому, логично предложить возможность комплексного использования глубинной культуры грибов, то есть использование биомассы для пищевых целей, а культурального фильтрата для биотехнологических. Однако несмотря на широко освещенные микробиологические аспекты исследования базидиомицета Т. pubescens, вопросы биохимии и ферментного состава данного штамма гриба Т. pubescens остаются открытыми. Так, не изучен состав ферментного комплекса, не выделены и не охарактеризованы образующие его ферменты, не известна взаимосвязь строения, свойств и функционирования ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Т. pubescens. Исследование, проведенное в рамках настоящей диссертационной работы, было направлено на выяснение данных вопросов.
Определение окислитиельно-восстановителъного потенциала ТІ центра лакказы
Многочисленные исследования как отдельных лигнинолитических ферментов, так и самих грибов белой гнили, до настоящего времени не дают ясной и полной картины процесса деградации лигнина. Общепринятым является положение о том, что детальное исследование механизма функционирования лигнинолитических ферментов и их взаимодействия в составе лигнинолитического комплекса является основой для создания эффективных биотехнологий, моделирующих высокоэффективные и селективные природные процессы [Хи, 1999]. На основании анализа имеющихся литературных данных о новом базидиомицете Т. pubescens, являющимся промышленным грибом-продуцентом лигнинолитических ферментов [Горшина, 2003], имеющим широкие биотехнологические возможности [Горшина с соавт., 2003; Baminger et. al., 2001; Marzorati et. al., 2005], было выдвинуто предложение о необходимости комплексного использования глубинной культуры данного гриба. То есть использование биомассы для пищевых целей, а культурального фильтрата для выделения ферментов. Предыдущими исследованиями было показано, что штамм 923-2 базидиомицета Т. pubescens являлся наиболее продуктивным продуцентом лигнинолитических ферментов на сахарозосодержащих средах, в том числе на наиболее промышленно доступных (например, мелассе), и при этом проявлял высокую стабильность и благоприятный характер роста в глубинной культуре [Горшина, 2003].
Для изучения физико-химических и биохимических характеристик ферментов лигнинолитического комплекса выбранного для исследования штамма гриба, а также для исследования возможности их практического применения в области биотехнологии, необходимо было разработать методы получения ферментов в достаточных для решения поставленных задач количествах.
С этой целью было предпринято сравнительное исследование качественного состава ферментов лигнинолитического комплекса при глубинном культивировании базидиомицета Т. pubescens, штамм 923-2, на базовой минеральной среде с кукурузным экстрактом, в качестве стимулирующего рост фактора, и на комплексной промышленной среде (мелассе).
Показано, что при глубинном культивировании гриба Т. pubescens на глюкозо-аммонийной среде продуцируются значительные количества лакказной и LiP-активности и обнаруживаются лишь следовые количества МпР-активности. Однако при глубинном культивировании того же штамма гриба на мелассе наблюдается максимум лакказной и МпР-активности, в то время как LiP-активность практически не детектируется. В связи с этим для выделения основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета Т. pubescens (лакказы, UP и МпР) были использованы культуральные фильтраты двух типов, полученные при выращивании данного штамма гриба на вышеописанных средах.
Необходимо также заметить, что используемый штамм базидиомицета Т. pubescens при выбранных условиях культивирования продуцировал лишь следовые количества CDH, которая также является одним из основных компонентов лигнинолитического комплекса. Однако из литературных данных известно, что этот гриб является хорошим продуцентом CDH, но лишь при выращивании на среде с целлюлозой в качестве источника углерода [Ludwig et. al., 2004].
Разработан метод выделения и очистки основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Т. pubescens в гомогенном состоянии. Он включал в себя следующие стадии: осаждение белков из культуральной жидкости сульфатом аммония в диапазоне насыщения 0-90% и ионообменную хроматографию низкого давления на носителях Сервацел ДЕАЕ 52 и Toyopearl DEAE 650М. В результате был получен препарат «голубой» лакказы (в дальнейшем Lc1), а также комплекс ферментов, обладающих оксидазной и пероксидазной активностями.
Комплекс ферментов удалось разделить введением дополнительных стадий очистки с использованием гельфильтрационной, адсорбционной и гидрофобной хроматографии (детально описано в параграфе 2.3 Главы 2). В результате, после стадии гидрофобной хроматографии, были получены гомогенные препараты второй формы лакказы (по тексту 1_с2) и LiP или МпР в зависимости от типа исходного культурального фильтрата. Схема очистки ферментов лигнинолитического комплекса гриба Т. pubescens представлена на рисунке 9.
Таким образом, при использовании глюкозо-аммонийной среды для выращивания базидиомицета Т. pubescens из соответствующего культурального фильтрата удавалось выделить и очистить три фермента, два из которых обладали оксидазной активностью в реакциях окисления АБТС, гидрохинона и пирокатехина, а третий фермент имел LiP-активность. При выращивании того же гриба на мелассе из культурального фильтрата также удавалось выделить и составил 10,7% (таблица 3). Вторая форма лакказы (Lc2) была также очищена до гомогенного состояния и имела удельную каталитическую активность 75,1 мкмоль/мин на 1 мг белка. Общий выход Lc2 по активности (по пирокатехину) в результате очистки составил 14,6% (таблица 3). Лигнинпероксидаза (по тексту LiP) и марганецпероксидаза (по тексту МпР) были очищены до гомогенного состояния и имели следующие удельные каталитические активности: 15,5 мкмоль/мин (по ВС) на 1 мг белка и 40,0 мкмоль/мин на 1 мг белка (по Мп2+) соответственно.
Таким образом, использованный в настоящей работе штамм базидиального гриба Т. pubescens 923-2 при соответствующих вышеописанных условиях культивирования продуцировал три лигнинолитических фермента: лакказу, LiP и МпР. Из образцов культурального фильтрата в гомогенном состоянии были выделены две формы лакказы, а также впервые получены гомогенные препараты LiP и МпР. Было показано, что Lc2, в отличие от Lc1, образует весьма прочный комплекс с LiP или же МпР (в зависимости от условий культивирования), который удавалось разрушить только с использованием гидрофобного носителя на последней стадии очистки.
Выделение и очистка ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета trametes pubescens
В настоящее время незначительное число работ посвящено исследованию свойств и взаимосвязей всех ферментов, входящих в состав лигнинолитического комплекса одного штамма гриба [Srinivasan et. al., 1995; Vares et. al., 1995], так как трудно подобрать культуру, которая бы одновременно продуцировала все интересующие ферменты с достаточно большими активностями. Поэтому в качестве источников лигнинолитических ферментов чаще всего выбирают разные виды базидиальных грибов [Беккер и Синицин, 1992]. По этой же причине затруднено изучение взаимосвязей и взаимодействий между отдельными ферментами внутри одного лигнинолитического комплекса того или иного гриба.
Базидиомицет Trametes pubescens является хорошим объектом исследования, так как может секретировать в культуральную жидкость сразу несколько внеклеточных ферментов в детектируемых количествах, в частности: лакказу, UP, и CDH [Galhaup et. al., 2002; Ludwig et. al., 2004]. Известно также, что штамм 923-2 лекарственного базидиального гриба Т. pubescens является промышленным штаммом-продуцентом биомассы, из которой получают биологически активные добавки [Бирюков с соавт., 2002; Горшина с соавт., 2003]. Из мицелия и плодовых тел Т. pubescens экстрагируют связанные с белками полисахариды с противоопухолевой и иммунизирующей активностями [Горшина с соавт., 2003а]. После отделения биомассы фильтрат культуральной жидкости не используют. Потенциально он может служить источником внеклеточных ферментов. Таким образом, было интересно изучить строение, свойства и функции ферментов лигнинолитического комплекса выбранного штамма базидиального гриба 7 pubescens 923-2, а также предложить возможный вариант их использования в биотехнологии для создания биосенсоров. Для этого было необходимо выделить и очистить ферменты, являющиеся компонентами данного лигнинолитического комплекса, и выяснить роль каждого из них в его составе, исходя из детального исследования свойств индивидуальных ферментов.
Поэтому на первом этапе нашей работы была разработана схема очистки лигнинолитических ферментов базидиального гриба Т. pubescens. Показано, что использованный в настоящей работе штамм базидиомицета Т. pubescens 923-2 при выбранных условиях культивирования продуцировал в детектируемых количествах следующие лигнинолитические ферменты: две формы лакказы (названные Lc1 и Lc2), UP и МпР, которые были выделены и очищены до гомогенного состояния. Впервые получены гомогенные по данным градиентного SDS-электрофореза препараты LiP и МпР базидиомицета Т. pubescens.
Необходимо отметить, что разделение и очистка второй множественной формы лакказы (Lc2) и LiP (или МпР, в зависимости от условий культивирования) сильно затруднена в связи с образованием названными ферментами прочного комплекса, который удавалось разделить только с использованием гидрофобной хроматографии. Проведено комплексное исследование оксидоредуктаз базидиомицета Т. pubescens, включающее изучение биохимических, спектральных, каталитических и электрохимических свойств ферментов.
Основное внимание в работе уделяли изучению лакказ базидиомицета Т. pubescens, так как лакказа является необходимым ферментом при утилизации лигнина базидиальными грибами. Недавние исследования показали, что мутантные грибы, лишенные лакказного гена, полностью теряют способность деградировать лигнин [Eggert et. al., 1997; Bermek and Eriksson, 1998]. Факт обязательного присутствия лакказы для утилизации лигнина имеет две противоположные стороны. С одной стороны, лакказа участвует в процессах деградации лигнина, используя природные редокс-медиаторы [Eggert et. al., 1997; Leontievsky et. al., 1997], в то же время сам фермент возможно способен к прямому окислению природного лигнина с помощью механизма ПЭП [Shleev et. al., 2006]. С другой стороны, лакказа может также катализировать процессы конденсации и полимеризации продуктов деградации лигнина грибных лакказ. Роль этих процессов конденсации и полимеризации заключается в защите гиф гриба от токсичных продуктов разложения лигнина [Болобова с соавт., 2002; Rochefort et. al., 2002]. К сожалению, механизм трансформации лигнина в природе является очень сложным и комплексным, и роль лакказы в нем до конца не выяснена. Кроме того, в последнее время значительное число работ посвящено сравнительным исследованиям множественных форм или изоформ лакказ различных базидиомицетов [Bonomo et. al., 1998; Farnet et. al., 2000; Saparrat et. al., 2002; Palmieri et. al., 2003]. Явление образования множественных форм ферментов широко распространено среди лигнинолитических грибов, хотя его физиологическая роль до настоящего времени не известна [Karahanian et. al., 1998; Larrondo et. al., 2003; Palmieri et. al., 2003].
Тот факт, что все конститутивные формы лакказ базидиомицетов рода Trametes, охарактеризованные не так давно, включая две множественные формы лакказы, представленные в данной работе, являются высокоредокс-потенциальными ферментами с похожими биохимическими, спектральными и электрохимическими свойствами [Klonowska et. al., 2002; Saparrat et. al., 2002; Shleev et. al., 2004] наводит на мысль о том, что их продукция в грибе имеет определенную физиологическую роль. Во-первых, высокоредокс-потенциальные лакказы способны окислять как высоко-, так и низкоредокс-потенциальные субстраты, что существенно расширяет способность грибов к деградации лигнина. Во-вторых, для всех высокоредокс-потенциальных лакказ была показана возможность к биоэлектровосстановлению молекулярного кислорода на графитовых электродах, основанная на реакции ПЭП между электродом и ферментом [Ярополов, 1986; Ярополов с соавт., 1986; Yaropolov et. al., 1996; Shleev et. al., 2005; Shleev et. al., 2005a], как и для двух множественных форм лакказ, представленных в данной работе (Таблица 9).
В действительности, не только лакказа, но и все другие лигнинолитические ферменты базидиальных грибов (LiP, МпР и CDH) проявляют свойства ПЭП [Gorton et. al., 1999; Christenson et. al., 2004; Shleev et. al., 2005]. Данный факт может объяснять необходимость внеклеточных редокс-ферментов непосредственно воздействовать на твердую матрицу (лигнин) в случае ее деградации при первичном взаимодействии гифов гриба с древесиной [Gorton et. al., 1999; Christenson et. al., 2004].
