Введение к работе
Актуальность проблемы. Базидиомицеты - возбудители белой гнили древесины относятся к немногочисленной группе грибов, которые практически всегда существуют в условиях недостатка легкодоступного источника углерода. Поэтому в процессе эволюции у них сформировалась лигнинмодифицирующая система (ЛМС) -набор экстрацеллюлярных ферментов и низкомолекулярных медиаторов, благодаря которым эти грибы могут использовать в качестве источника углерода и / или азота труднодеградируемые субстраты. В частности, грибы рода Trametes способны разрушать лигнин и целлюлозу, которые являются предшественниками гуминовых веществ (ГВ) - преобладающей и наиболее устойчивой к микробной деградации фракции почвенного органического вещества. Таким образом, грибы белой гнили отвечают за вывод органического углерода из активного круговорота в недоступную для большинства живых организмов форму. С другой стороны, в настоящее время установленной считается роль этих грибов в разложении ГВ, т.е. возвращении выведенного из активного круговорота углерода обратно в цикл. Таким образом, базидиомицеты - возбудители белой гнили являются микроорганизмами, играющими ключевую роль в глобальном цикле углерода, а изучение их роли в этом процессе -актуальная проблема современной биохимии.
Используемые в большинстве случаев модельные системы, создаваемые для изучения взаимодействия грибных организмов с ГВ, основаны на т.н. «богатых» питательных средах, т.е. средах, содержащих глюкозу - легкодоступный источник углерода [Kate et al., 2011]. В то же время в природных условиях эти микроорганизмы функционируют при недостатке легкодоступных источников углерода, что, безусловно, влияет на грибной метаболизм и, как следствие, на их взаимодействие с ГВ. Поэтому такие исследования требуют создания модельных систем, адекватных природным условиям существования базидиальных грибов, где ГВ выступают в качестве единственного источника углерода. Для установления и понимания основных закономерностей процессов, протекающих в системе возбудители белой гнили - ГВ, изучение взаимодействий необходимо проводить не только на клеточном, но и на молекулярном уровнях.
Цели и задачи исследования. Целью работы было сравнительное изучение взаимодействия ГВ с грибами - возбудителями белой гнили Trametes hirsuta и Trametes maxima в условиях богатой питательной среды и при отсутствии легкодоступного источника углерода. Выбранные штаммы базидиомицетов являются продуцентами высокоактивных лакказ и пероксидаз. В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
изучить влияние ГВ на рост и развитие грибов на уровне организма;
на основании сравнительного анализа основных физико-химических характеристик ГВ до и после взаимодействия с грибами выявить основные пути деградации ГВ выбранными штаммами грибов;
провести количественную оценку поступления ГВ в клетки грибов;
на основании оценки изменений, наблюдаемых в физиологических процессах грибов под действием ГВ, установить основные метаболические пути, на которые влияют ГВ;
на основании оценки изменений, происходящих в протеоме грибов под действием ГВ, выявить молекулярные основы взаимодействия грибов - возбудителей белой гнили с ГВ.
Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное исследование взаимодействий, протекающих в системе возбудители белой гнили - ГВ и установлено влияние этих веществ на физиолого-биохимические и морфо-функциональные свойства грибных клеток. Впервые установлено поступление ГВ в клетки грибов и проведена количественная оценка этого процесса. Впервые показано, что в присутствии ГВ происходит уменьшение длины митохондрий и изменяется толщина клеточной стенки и полиглюканового чехла гиф базидиомицетов. Впервые установлено, что ГВ способствуют накоплению полифосфатов и увеличению концентрации глюкозы в цитозоле. Показано наличие альтернативного пути дыхания у базидиомицета Trametes maxima. Установлено, что внесение ГВ в питательную среду приводит к общей активизации дыхания и показано, что ГВ увеличивают скорость дыхания как по цитохромному, так и по альтернативному путям. На основании сравнительного анализа протеомных профилей впервые установлено, что в присутствии ГВ происходит увеличение количества внутриклеточных белков и показано повышение уровня биосинтеза белков семейства АТФаз, белков теплового шока и нуклеозидтрифосфатаз. При оценке влияния ГВ на дифференциальную экспрессию генов методом ПЦР в реальном времени впервые установлено, что ГВ влияют на уровень углеводного обмена: показано повышение экспрессии гена епо, кодирующего енолазу, участвующую в процессе гликолиза и снижение экспрессии гена pgd, кодирующего 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, участвующую в пентозофосфатном цикле.
Практическое значение работы. Биотестирование продуктов взаимодействия базидиомицетов с ГВ показало их детоксицифирующую способность по отношению к гербициду атразину и способность повышать уровень витамина С в редисе. Полученные продукты могут быть использованы для создания функциональных биоудобрений и в природоохранных технологиях.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на XIV конференции международного Гуминового общества (Москва-Санкт-Петербург, 2008), 5-ой международной конференции «Гуминовые вещества и фитогормоны в сельском хозяйстве» (Днепропетровск, 2009), 3-ей международной конференции «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 2010), VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010), 1-ой и 2-ой международных конференциях по гуминовым инновационным технологиям (Москва, 2010 и 2012), конференции «Молекулярная биология и биотехнология леса» (Брянск, 2011), 17-ой международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-
2011» (Москва, 2011); международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 статей в журналах, рекомендованных ВАК, а также 9 статей в сборниках и тезисов докладов.
Объем и структура работы. Работа изложена на 160 страницах печатного текста, содержит 32 рисунка и 27 таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 224 источника.
