Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Микробные сообщества: структура, функционирование и взаимодействие с антропогенными поллютантами 8
1 Л.Функционирование почвенных микробных сообществ 8
1.1.1. Свойства и состав естественных микробных сообществ 8
1.1.2. Анализ современных методов изучения почвенных микробных сообществ 12
1.1.3. Реакция почвенных микробных сообществ на антропогенное загрязнение 16
1.2. Литнинсодержащие отходы целлюлозно-бумажной промышленности как антропогенный поллютант 25
1.2.1. Химический состав сточных вод ЦБП 25
1.2.2. Технические лигнины - отходы ЦБП 32
1.2.3. Влияние сточных вод ЦБП на живые организмы 33
1.3.Ферменты, участвующие в деградации лигноцеллюлозных субстратов 34
1.3.1. Ферменты, разрушающие целлюлозу 34
1.3.2. Ферменты, разрушающие лигнин 35
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 47
2.1. Объекты исследований 47
2.2. Условия выделения микробных сообществ почвы 47
2.3. Питательные среды для выделения микроорганизмов и поддержания их в активном состоянии 48
2.4. Изучение морфофизиологических свойств штаммов 48
2.5. Качественные методы определения активности ферментов бактериальных штаммов 49
2.6. Условия и способы культивирования почвенных микробных сообществ 51
2.7. Определение концентрации редуцирующих веществ 52
2.8. Определение концентрации белка 52
2.9. Методы исследования химического состава л и гнинсо держащих субстратов до и после воздействия на них микробных сообществ и отдельных штаммов 53
2.9.1. Определение содержания фенолов 53
2.9.2. Спектральные методы анализа 54
2.9.2.1. УФ-спектроскопия 54
2.9.2.2. ИК-спектроскопия 54
2.9.2.3. Спектроскопия ЯМР 54
2.10. Методы определения активностей ферментов, участвующих в разложении лигноцеллюлозных субстратов 55
2.10.1 Определение активности целлюлазы 55
2.10.2. Определение активности лигнолитических ферментов 55
2.11. Статистическая обработка полученных результатов 56
ГЛАВА 3. Микробные сообщества почв, загрязненных сточными водами целлюлозно-бумажной промышленности: структура, свойства и взаимодействие с лигнинными веществами 57
3.1. Байкальские почвенные микробные сообщества 57
3.2. Влияние сточных вод БЦБК на рост и свойства микробных сообществ 63
3.3. Развитие микробных сообществ на средах с ячменной лузгой и глюкозой 69
3.4. Рост микробных сообществ на средах с лигнинами 70
3.4.1. Изменение структуры микробных сообществ 71
3.4.2. Воздействие микробных сообществ на лигнин 71
3.4.2.1. Химический состав лигнинсодержащих субстратов..72
3.4.2.2. Утилизация растворимой и нерастворимой фракций лигнина микросообществами 73
3.4.2.3. Количественная спектроскопия ЯМР растворимой фракции взорванного лигнина, 76
3.4.2.4. Исследование воздействия концентрации лигнина на микробное сообщество СБ 83
3.4.2.5. Развитие байкальских почвенных микросообществ на среде с лигнином, обработанным электрическим разрядом 85
3.4.2.6. Внеклеточные ферменты микробных сообществ при
росте на средах с лигнинами ...87
3.5. Воздействие отдельных компонентов микросообщества СБ на лигнинсодержащие субстраты 88
3.5.1. Изменения видового и количественного состава микробного сообщества , 89
3.5.2. Воздействие компонентов микробного сообщества на фенольные вещества культуральноЙ жидкости 90
3.5.3. Воздействие отдельных компонентов микробного сообщества на растворимые лигнинные вещества 92
3.5.4. Активность ферментов компонентов микробного сообщества СБ при культивировании на среде с ЛС-1 94
3.5.5. Влияние компонентов микросообщества на уровень кислотности среды 96
3.6. Взаимодействие компонентов СБ при культивировании на среде с ЛС-1 96
3.7. Обсуждение результатов 101
ВЫВОДЫ 107
Список литературы ,. 108
Приложения 120
- Анализ современных методов изучения почвенных микробных сообществ
- Питательные среды для выделения микроорганизмов и поддержания их в активном состоянии
- Развитие микробных сообществ на средах с ячменной лузгой и глюкозой
Введение к работе
Актуальность темы. Прогрессирующее снижение качества вод в результате сброса промышленных отходов в естественные водоемы является одной из важнейших экологических проблем современности. Основную роль в загрязнении водоемов Прибайкалья играют предприятия целлюлозно-бумажной промышленности и лесопереработки. Большие объемы сточных вод, образующиеся в результате их деятельности и сбрасываемые в водоемы, несмотря на применяемые методы переработки, содержат значительные количества токсических веществ и оказывают неблагоприятное действие на гидробионтов. Многотоннажные твердые отходы ЦБП - опилки, лигнин, кора и пр. - скапливающиеся в отвалах, занимают большие территории и также являются антропогенным поллютантом.
В естественных условиях трансформация лигноцеллюлозных субстратов осуществляется сообществами микроорганизмов. Деятельность микробных сообществ — особенно почвенных, - является одной из наименее изученных областей экологии, что связано с многочисленностью и разнообразием микроорганизмов естественных ассоциаций, а также с неоднородностью местообитаний. Исследовательская работа в области синэкологии позволит понять закономерности функционирования экосистем и оценить влияние различных факторов загрязнения, а также возможности компенсации и адаптации экосистем к каждому конкретному поллютанту.
Сообщества почвенных микроорганизмов длительное время считались более устойчивыми к антропогенным факторам, чем сообщества животных и растений (Одум, 1986). Однако в последнее десятилетие часто высказывалось прямо противоположное мнение - о пригодности почвенных микроорганизмов для мониторинга состояния почвы, подверженной антропогенному загрязнению (Гузев, Левин, 2001; Наплекова, 2002).
Результаты взаимодействия поллютантов с микробным сообществом могут быть неоднозначными и даже неожиданными (Емцев, 2001). Имеющаяся в литературе информация не дает возможности составить достаточно цельное представление об изменениях, происходящих в микробной системе почвы под влиянием загрязнения. В ряде случаев один и тот же агент может ингибировать, стимулировать и не оказывать никакого воздействия на микробиоту почвы (Гузев, Левин, 2001).
Изучение микробных сообществ, обитающих в условиях высокой антропогенной нагрузки, в частности, в условиях загрязнения сточными водами целлюлозно-бумажных предприятий, является актуальной задачей, поскольку позволяет оценить реакцию микробного сообщества на определенный длительно действующий фактор загрязнения, например, сточные воды. Микроорганизмы такого местообитания могут обладать полезными адаптациями и ферментными системами, позволяющими им избегать токсического действия стоков ЦБП и осуществлять деструкцию органических веществ сточных вод. Подобные свойства можно успешно применять и для промышленной переработки лигноцеллюлозных отходов.
Целью исследования являлось изучение структуры и функциональной активности микробных сообществ, обитающих в условиях загрязнения сточными водами целлюлозно-бумажных предприятий
В задачи исследования входило:
анализ структуры микробного сообщества почвы, длительно существовавшего в условиях загрязнения сточными водами ЦБП в сравнении с таковым из нативной почвы;
определение степени токсичности сточных вод для почвенного микробного сообщества;
выявление культур исследуемого сообщества, эффективно воздействующих на органические компоненты сточных вод;
- оценка возможности применения таких микроорганизмов для утилизации промышленных отходов целлюлозно-бумажных предприятий;
исследование взаимоотношений отдельных компонентов почвенного микробного сообщества для выявления закономерностей его жизнедеятельности. Научная новизна. Проведен сравнительный анализ микробных сообществ из загрязненных и естественных местообитаний Прибайкальского региона и определен уровень антропогенного стресса, оказываемого сточными водами ЦБП. Выявлены изменения структуры микробных сообществ, возникающие в ответ на новые условия культивирования и различные органические субстраты. Впервые с использованием методов ИК- и ЯМР-сттектроскопии исследованы качественные и количественные изменения, происходящие в растворимых лигнинных веществах под влиянием микробных ассоциаций и доминирующих в них штаммов. Установлена роль отдельных культур микробного сообщества при утилизации ими лигнина.
Практическая значимость работы. Результаты исследования могут
быть использованы как исходные для сравнительного анализа
почвенных микробных сообществ из местообитаний с различной
антропогенной нагрузкой. Полученные данные о преобладающей
роли культуры дрожжей в утилизации растворимых лигнинных веществ
выявляют новое перспективное направление для
скриннинга микроорганизмов-деструкторов лигнинсодержащих
отходов.
Апробация работы
Результаты исследований доложены на международной конференции «Человек. Земля. Вселенная» (Иркутск, 1997), Всероссийской конференции «Проблемы природопользования и ресурсосбережения
Прибайкалья» (Иркутск, 1998), Всероссийской конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе» (Иркутск, 2002), Всероссийской конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2002), Всероссийской конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2002). Публикации
По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Структура и объем работы
Работа изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы об объектах и методах исследования, главы о полученных результатах и их обсуждении, выводов, списка использованной литературы и 13 приложений. Список литературы включает 140 источников, из них 94 работы зарубежных авторов. Диссертация содержит 27 таблиц и иллюстрирована 26 рисунками.
Автор приносит искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н., профессору Саловаровой В.П. за постоянное внимание и помощь в организации исследований.
Автор благодарит к.б.н. Андрееву И.С. и д.б.н. Огаркова Б.Н. за оказанную помощь в определении таксономической принадлежности изученных микроорганизмов, к.х.н. Анненкова В.В., к.х.н. Рохина А.В., д.х.н. Каницкую Л.В. - за сотрудничество при исследовании субстратов методами ИК- и ЯМР-спектроскопии, а также сотрудников кафедры физико-химической биологии за оказанную поддержку при обсуждении результатов работы.
Анализ современных методов изучения почвенных микробных сообществ
Изучение почвенных микробных сообществ сопряжено с немалыми трудностями, на что имеется ряд объективных причин. Во-первых, в почве, как ни в одной другой природной среде, аккумулируются покоящиеся формы (споры, цисты), а также микробы, попавшие из других местообитаний - с листьев растений, из кишечника животных. В почве эти микроорганизмы не находят условий для существования, но зато быстро растут на обогащенных лабораторных средах, маскируя собственно почвенные микроорганизмы (Гузев, Левин, 2001). Во-вторых, большое разнообразие почвенной микрофлоры в совокупности с высокой трудоемкостью традиционных методов выделения и культивирования приводят к тому, что можно выделить и изучить не более 1-2% от общего числа микроорганизмов (Ritchie et al., 2000).
Традиционными методами изучения почвенных микроорганизмов являются методы субстрат-индуцированного дыхания, определения ферментативной активности почв, общей биомассы микробов в почве. Однако эти методы недостаточно специфичны, поскольку они отражают воздействие на микробное сообщество комплекса экологических условий, таких как содержание влаги в почве, температуру, доступность углерода и рН, влияние поллютантов (Pennanen et at, 1996; Благодатская, 2001).
В в последние годы активно развиваются альтернативные методы изучения микробного разнообразия: анализ метиловых эфиров жирных кислот (FAME), анализ фосфолипидов жирных кислот (PLFA), анализ профиля утилизации Biolog-субстратов, анализ соотношения Г+Ц, анализ изменчивости длины концевых рестрикционных фрагментов (T-RFLP) и анализ гетерогенности длины PCR (LH-PCR) (Ritchie et al., 2000). Два последних метода очень похожи, разница между ними в том, что Т- RLPF метод основывается на вариабельности сайта рестрикции PCR-фрагментов, тогда как LH-PCR анализ идентифицирует разные организмы, основываясь на присущих им различиях в длине 16S рибосомальной ДНК. Метод, основанный на анализе экстрагируемых из почвы метиловых эфиров жирных кислот (FAME) и фосфолипидов жирных кислот, был признан высокоэффективным в связи со своей относительной легкостью и быстротой, и в последние годы широко использовался для характеристики почвенных микробных сообществ (Ritchie et al., 2000).
PLFA-анализ основан на том, что крупные группы микроорганизмов отличаются друг от друга характерным набором фосфолипидов клеточной мембраны, как это показано в табл. 1 (Ibekwe et al., 2001). Так, жирные кислоты П6:0, 10mel6:0, brl7:0, а17:0, су17:0, 18:1о 5, 10mel8:0, 19:1, су19:0 означают грам-положительные и анаэробные грам-отрицательные бактерии. Жирная кислота 18:2со6 распространена в разных филогенетических группах, но вообще ее относят на счет эукариотных микробов; жирная кислота 16:1а 7 соответствует аэробным грам-отрицательным бактериям в условиях метаболического стресса. Наличие 114:0, і 15:0, а14:0, і 16:0 означает присутствие бактерий типа Bacillus. 20:4ш6, 20:5шЗ, 20:2ш6, 20:1 ю9 показывают присутствие гетеротрофных микроэукариотов. 18:1ш7 - это аэробные грамотрицательные бактерии. 16:3ю4, 16:1ш9, I6:Itol3t, 18:4шЗ, 20:5to3, 22:6оЗ - маркеры эукариотических метаболического стресса Фосфолипиды экстрагируются из образцов почв и затем быстро и точно анализируются на масс-спектрометре и газовом хроматографе. PLFA-анализ обладает значительными преимуществами по сравнению с другими методами, поскольку его можно провести довольно быстро. Кроме того, фосфолипиды входят в состав плазматической мембраны всех организмов, не накапливаются и потому по их количеству можно достоверно судить о количестве клеток. После гибели организма происходит их быстрый распад и потому исключаются ошибки, связанные с учетом отмерших клеток (Noble et al., 2000). Метод достаточно чувствителен для выявления небольших изменений в почвенном микробном сообществе. Однако PLFA-анализу свойственны и недостатки: во-первых, определяются лишь крупные группы микроорганизмов - актиномицеты, грибы, грамположительные бактерии и т.д., а не роды и виды, во-вторых, с помощью метода нельзя определить архебактерии (Konopka et al., 1999; Noble et al., 2000).
Также в настоящее время широко применяются методы, основанные на прямой амплификации и анализе генов 16S rRNA. Этот ген имеет консервативный участок, общий всех прокариотных микроорганизмов. Используя его в качестве затравки, можно амплифицировать ДНК, полученные ПЦР-продукты расщепить рестриктазами и проанализировать в градиентном геле (градиент мочевины или формамида — DGGE (электрофорез в денатурирующем градиентом геле), градиент температуры — TGGE) (Greene et al., 2000). Метод не является более точным, чем методы культивирования, но это быстрый метод, позволяющий достоверно выявить отличия в составе микробного сообщества и пригодный для экспресс-диагностики (Dunbar et al., 1999).
Питательные среды для выделения микроорганизмов и поддержания их в активном состоянии
Ввиду сложности состава почвенных микробных сообществ для выделения отдельных штаммов использовались агаризованные среды следующего состава:
- среда LB для бактериальных штаммов: пептон - 10 г/л, NaCI — 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, агар — 17 г/л, дистилированная вода - 1л, рН доводили до 7,0; стерилизовали при 1 атм;
- среда сусло-агар для штаммов дрожжей и микромицетов: пивное сусло разводили в два раза, добавляли 20% агара и автоклавировапи при 0,75 атм.
Для поддержания чистых культур применяли среду LB для бактерий, среду сусло-агар для микромицетов и — для дрожжей - среду Сабуро, содержащую глюкозу — 1,0 г/л; пептон — 1,0 г/л; дрожжевой экстракт 0,5 г/л; NaCI - 0,5 г/л; К2НР04 - 0,3 г/л; агар - 2,5 г/л (Бабьева, Голубев, 1979).
Способность бактерий образовывать эндоспоры определяли при высеве на агаризованную среду следующего состава: пептон —5 г/л; мясной экстракт- 3 г/л, MnSC 4-0,005 г/л, агар - 15 г/л, вода—1л.
2,4. Изучение морфофизиопогических свойств штаммов.
Морфологические признаки клеток изучали с помощью световой микроскопии живых и фиксированных клеток с использованием светового микроскопа Jenamet (Германия). Для получения микрофотографий штаммов применяли атомно-силовой микроскоп Solver Р47ВЮ NT-MDT (Russia).
Способность бактериальных штаммов расти в присутствии кислорода изучали в условиях глубинного культивирования на среде LB.
Физиологическая активность микроорганизмов характеризуется их способностью к утилизации различных субстратов. Утрата ферментативных активностей, как правило, свидетельствует о подавлении жизнедеятельности клеток. В ходе экспериментов ферментативная активность бактериальных штаммов определялась с помощью удобных и экономичных качественных тестов.
Оксидазная активность бактериальных штаммов определялась по развитию фиолетовой или пурпурной окраски на влажной фильтровальной бумаге, пропитанной 1% раствором дигидрохлорида тетраметил-п-фенилендиамина (Sigma Chemical Co.), при нанесении на нее выросшей на агаризованной среде культуры (Методы общей бактериологии, 1984).
Активность лецитиназы определялась по наличию мутных зон осветления желточного агара вокруг колоний микроорганизмов. Для этого готовили среду следующего состава (г/л): пептон - 20; ШгНРС 4 - 2,5; NaCl - 1; глюкоза - 1; агар - 25; MgS04 - 5 X 10 3, вода дистиллированная 1 л, рН среды доводили до 7,3 —7,4, стерилизовали автоклавированием и охлаждали до 60С в водяной бане, после чего в асептических условиях добавляли яичный желток, тщательно перемешивали суспензию и разливали в чашки. Культуры высевали штрихом на поверхность среды и инкубировали в течение 3-5 суток. Образование маслянистого с переливами или перламутрового слоя над колонией или вокруг нее на поверхности желточного агара свидетельствует об активности липазы.
Для определения казеинолитической активности штаммов использовали молочный агар. С этой целью голодный 3%-ный агар (стерилизованный при 1 атм в течение 30 мин) смешивали при температуре 50-5 5С со стерильным (0,6 атм 20 мин) 12%-ным обезжиренным молоком. Положительная реакция протеиназы выражалась в появлении зон осветления молочного агара вокруг колоний.
Активность желатиназы выявляли по разжижению столбика мясо-пептонной желатины (10-15%-ный раствор желатина в мясопептонном бульоне).
Амилолитическую активность определяли по зонам гидролиза крахмала при выращивании микроорганизмов на крахмало-аммиачном агаре следующего состава (г/л): растворимый крахмал - 10; (NH SO, MgCb — 1; К2НР04 - 1; MgS04 7 Н20 - 1; СаСОз - 3; агар - 20; вода - 1 л. Среду разливали по чашкам Петри и высевали исследуемые культуры штрихом. Гидролиз крахмала обнаруживали при обработке агаровой пластинке раствором Люголя, после чего среда с крахмалом окрашивалась в синий цвет, а зона гидролиза оставалась бесцветной или приобретала красно-бурую окраску.
Для определения активности фермента уреазы штаммы высевали на среду LB с 10 г/л мочевины и 2 мл/л 1,6%-ного спиртового раствора крезолового красного. О наличии фермента судили по появлению красного окрашивания среды через 20-24 ч роста при 37С .
Способность штаммов утилизовать цитрат определяли, высевая культуры на среду Симонса (Методы общей бактериологии, 1984) следующего состава (г/л): NaCl - 5; MgS04 - 7 Н20 - 0,2; (NH4)H2P04 - 1; К2НР04 - 1; Na-цитрат - 3; агар - 20; бромтимоловый синий - 0,08; вода 50 л. Штаммы высевали штрихом на чашки Петри со средой Симонса. При разложении цитрата среда окрашивается в ярко-синий цвет.
Развитие микробных сообществ на средах с ячменной лузгой и глюкозой
Среды с легкодоступными углеводами являются относительно благоприятными для роста и развития микроорганизмов. Изучение их влияния на ассоциации микроорганизмов позволило сравнить развитие почвенных микробных сообществ в различных условиях.
При выращивании микробного сообщества СБ на среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода наблюдалось развитие сообщества, состоящего из дрожжей, мицелиального гриба рода Trichoderma и бактерий, и сходного в общих чертах с микробным сообществом, развивающимся на сточных водах (рис. 15). увеличение 100 X 15 При культивировании СБ и сахалинского микробного сообщества СЮ на жидкой среде с лузгой наблюдали преобладание бактериальной флоры, и отсутствие дрожжей и мицелия грибов. В процессе культивирования отмечалось интенсивное пенообразование, кислотность среды культивирования достигала рН 9,7-9,8. Активность целлюлазы и фенолоксидазы при культивировании микробных сообществ на данных средах отсутствовала и не проявлялась даже после исчерпания свободных Сахаров из культуральной жидкости. Это свидетельствует о том, что дефицит источников углерода не индуцирует синтез ферментов. Контрольный высев на среду с лузгой монокультуры штамма Trichoderma longibrachiatum выделенной из микросообщества СБ, показал успешное развитие микромицета и секрецию им внеклеточных целлюлаз, активность которых по гидролизу фильтровальной бумаги (АФБ-активность) достигала 5 ед/мг белка.
Приведенные данные демонстрируют значительные изменения, происходящие в составе и свойствах микробных сообществ в зависимости от типа субстрата, и наводят на мысль, что преимущественное развитие бактериальной компоненты в условиях избытка углеводов тормозит рост дрожжей и микромицетов.
Лигнинные вещества являются основным компонентом сточных вод ЦБП и технических лигнинов и способны оказывать негативное воздействие на живые организмы. Исследование воздействия, оказываемого почвенными микробными сообществами на разные виды лигнинсодержащих субстратов, представляет интерес в плане использования микроорганизмов для быстрой и полной утилизации отходов ЦБП. Изучение влияния лигнина на почвенную микробиоту позволит точнее оценить его потенциальную токсичность для различных экосистем, а также поможет пролить свет на жизнедеятельность сложного биологического объекта - ассоциации микроорганизмов - в условиях антропогенного загрязнения.
Для выявления влияния, оказываемого почвенным микросообществом на лигнинные компоненты сточных вод, были проведены исследования по культивированию исследуемых сообществ микроорганизмов (СБ-В, СБ-К, СЮ) на жидкой среде с различными видами лигнина: гидролизным, предобработанным паровым взрывом, подвергнутом электрообработке. Результаты экспериментов показали снижение видового разнообразия микробов до нескольких видов, увеличение доли дрожжей и мицелиальных грибов в микробном сообществе (рис.16). Из грибов в подавляющем большинстве случаев развивались представители рода Trichoderma: Т. longibrachiatum, Т. hamatum, Т. viride, Т. koningii.
Лигнинные вещества составляют основную часть органических компонентов сточных вод ЦБП. Их воздействие на микроорганизмы приводит, как правило, к снижению уровня жизнедеятельности последних. Ориентировочно безопасный уровень вредности лигнинных веществ для водных микросообществ Байкала составляет 0,1-1 мг/л (Новикова и др., 19946). Почвенная микробиота может сильно отличаться от водной в своей реакции на загрязнение лигнинными веществами, поэтому и было исследовано взаимодействие сообществ СБ, СБ-К и СЮ с различными видами лигнинов и исследован химический состав последних до и после воздействия почвенных микробных сообществ.
Исходные лигнинсодержащие субстраты — ЛС-1 и ЛС-2 — несколько отличались по химическому составу. Так, по результатам ИК-спектроскопии было установлено, что твердая фракция ЛС-1 по сравнению с таковой ЛС-2 имеет более выраженный пик 1030 см"1 и 1270 см" , характерный для гваяцилпропановых единиц, и содержит больше полисахаридов, о наличии которых свидетельствуют пики 1450 см 1 и 890 см 1 (приложения 4, 5). Также у образца ЛС-1 больше полоса около 1365, что говорит о большем количестве фенольных ОН-групп. ЛС-2 характеризуется относительно высоким содержанием алифатических альдегидов и кетонов, о чем свидетельствует величина сигнала в области 1698 см"1, и низким — сирингилпропановых единиц с полосой 1330 см"1. Соотношение алифатических и ароматических сигналов (А293б/Аі5іо) примерно одинаково в обоих образцах твердой фракции лигнинов. Соотношение S/G (А]3з /Аі2б9) чуть больше у ЛС-1, чем у ЛС-2. Также оба образца содержат весьма небольшое количество эфирных СО-групп, о присутствии которых можно судить по полосе 1761 см" и 1086 см 1 (Licon, Perdih, 1999).
В среде культивирования с ЛС-1 субстратом выявлялись две фракции лигнина: нерастворимая (мелкие твердые частицы) и растворимая. Фракции имели несколько отличающийся состав, что было выяснено при изучении их ИК-спектров. Более ярко выраженные полосы поглощения около 1608 и 1510 см" свидетельствуют о большем количестве ароматических соединений в твердой фракции ЛС-1. Соотношение пиков А2936/А1510» а также увеличение полосы поглощения около 1460 см"1 в спектре растворимой фракции ЛС-1 указывает на относительно более высокое содержание в ней алифатических групп (приложения 4, 6) (Licon, Perdih, 1999).
