Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Ctpolhhl, свойства и каталитический МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ЛАККАЗ 8
Локализация в клетке 10
Биохимические свойства лакказ 11
Строение активного центра лакказ 14
Каталитические свойства лакказ и механизм катализа 18
Факторы, определяющие окислительно-восстановительный потенциал
ТІ-центра лакказ 24
ЭЛЕКТРОКАТАЛИТИЧЬСКИР СВОЙСТВА ЛАККАЗ 27
УСИЛИТЬЛИ ДЬИСТВИЯ ЛАККАЗ И ЛАККАЗА-МЕДИАТОРНЫЕ СИСТЕМЫ 30
ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЛАККАЗ И ЛАККАЗА-МЕДИАТОРНЫХ СИСТЕМ В ЬИОТГХНОЛОГИИ 47
1.4.1. Использование лакказа-медиаторных систем в целлюлозно-бумажной
промышленности 48
1.4.2.Использование лакказ и лакказа-медиаторных систем в текстильной
промышленности 50
Возможности использования лакказ в пищевой промышленности 51
Использование лакказы в источниках тока 52
Лакказа в аналитической химии 52
Лакказа и окружающая среда 53
Другие области возможного использования лакказ 55
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 56
2.1. Материалы и объькты исследования 56
Штаммы грибов и ферменты 56
Реактивы 56
2.2. Выделение и очистка ферментов 57
Культивирование штаммов 57
Получение гомогенных препаратов ферментов 57
Определение концентрации белка 59
2.3. ОПРЩЕЛРНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ФЕРМЕНТОВ 59
Определение молекулярной массы и изоэлектрической точки 59
Определение содержания ионов меди 59
Определение состава углеводной части лакказ 59
Спектральные исследования лакказ 59
Исследование рН зависимости реакций и кинетические исследования 60
2.3.6. Термостабильность ферментов 60
2.4. Электрохимические исследования ферментов 61
Определение потенциала ТІ центра лакказ 61
Циклическая вольтамперометрия 62
2.4.3. Подготовка и модификация графитовых электродов 62
2.5. Исследования медиаторов лакказ 62
Стационарные кинетические измерения 62
Вольтамперометрические исследования 63
Спектральные исследования 64
ВЭЖХ исследования 64
Делигнификация лигноцеллюлозы 65
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 66
3.1. Выделение и основные физико-химические свойства лакказ 66
Trametes hirsuta, Trametes ochracea, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrena maxima 66
Получение гомогенных препаратов лакказ 66
Основные биохимические, спектральные и кинетические свойства лакказ 67
3.2. Электрохимические исследования лакказ 78
Определение редокс потенциала ТІ центра лакказ 78
Биоэлектрокаталитические свойства лакказ 81
3.3. Медиаторы - усилители действия лакказ 86
Принципы отбора медиаторов лакказ 86
Первичный отбор соединений на основе их структурных формул 87
Субстратная специфичность 89
Электрохимические исследования промежуточных соединений,
образующихся при окислении медиаторов 91
3.3.5. Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при
ферментативном окислении усилителей действия лакказ 98
Электрохимическое окисление вератрового спирта в присутствии медиаторов 102
Окисление вератрового спирта в системе лакказа/редокс-усилитель фермента 109
Использование лакказа-медиаторных систем для делигнификации
лигноцеллюлозы ИЗ
ВЫВОДЫ 116
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 117
Список сокращений
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ДДС - додецилсульфат натрия
ИЭФ - изоэлектрофокусирование
ЛМС - лакказа-медиаторная система
НВЭ - нормальный водородный электрод
ПЭП - прямой электронный перенос
ABTS - 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) аммония
ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ
НАВА - 3-амино-(6-гидрокси)-бензойная кислота
НВТ- 1-гидроксибензотриазол
HPI - N-гидроксифталеимид
HQ - гидрохинон
NHA - N-гидроксиацетанилид
pi - изоэлектрическая точка
РР- 1-фенил-3-мегилпиразолон-5
РРА - 1-фенил-2,3-диметил-4-аминопиразолон-5
PPA-Na - 1-фенил-3-метил-4-метиламинопиразолон-5-Ы(4)-метансульфонат натрия
mSPP - 1-(3'-сульфофенил)-3-метилпиразолон-5
pSPP - 1-(4'-сульфофенил)-3-метилпиразолон-5
TEMPO - 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилоксил
VA - вератровый спирт (3,4-диметоксибензиловый спирт)
VLA - виолуровая кислота
Введение к работе
В последнее время все большие масштабы приобретает использование биокаталитических технологий в промышленности, что, возможно, связано с экологической безопасностью производства на их основе [Call and Mucke, 1997; Kruus, 2000; Mayer & Staples, 2002; Couto & Herrera, 2006]. Промышленное получение биокатализаторов на основе технических ферментов является экономически выгодным. Об этом свидетельствует возрастающий объем продаж технических препаратов ферментов на мировом рынке, который в 2004 году составил почти 1,5 миллиарда долларов. Ферментные препараты находят широкое применение в промышленности - в качестве компонентов моющих средств, для обработки текстильных изделий, в производстве первичной и вторичной целлюлозы, в пищевой промышленности, в сельском хозяйстве для предобработки кормов, а также в аналитической химии.
В настоящее время в промышленных биокаталитических процессах широко используются различные ферменты, такие как протеазы, липазы, ксиланазы, гидролазы, оксидоредуктазы и др. Среди оксидоредуктаз особое место занимает лакказа, обладающая широкой субстратной специфичностью и высокой удельной активностью. Каталитические и электрокаталитические свойства лакказы дают возможность ее широкого использования в целлюлозно-бумажной промышленности для делигнификация бумажной пульпы [Cheng et al., 2003а; Peder-sen et al., 2001; Lund & Felby, 2003; Jetten et al., 2004], в текстильной промышленности для отбеливания тканей [Barfoed et al., 2004; Damkhus et al., 2003], в пищевой [Huang et al., 2001; Si, 2001] и косметической промышленностях [Onuki et al., 2000; Aaslyng ye al., 2002; Lang & Cotteret, 2006], для детоксикации и обесцвечивания сточных вод [Jonsson et al., 1998; Michizoe et al., 2005], в органическом синтезе [Echido et al., 2001; Karamyshev et al., 2003], для биодеградация ксенобиотиков [Johannes et al., 1996; Shintaro et al., 2001], для создания антимикробных композиций [Johansen et al., 2003], при получении древесноволокнистых плит, древесных блоков и картона без применения токсичных связующих [Боло-бова и др., 2002; Viikari et al., 2001], при производстве моющих средств [Boutique et al., 2004; Gardner et al., 2006], при разработке катодов биотопливных элементов [Heller et al., 2003, 2006] и других областях. Так, например, фирма «No-
vozymes» (Дания) выпускает на основе лакказы коммерческие препараты предназначены для отбеливания и обработки текстильных изделий, делигнификации бумажной пульпы и обработки корковой пробки [].
Помимо использования лакказ в различных биотехнологических процессах этот фермент представляет большой интерес с точки зрения фундаментальных исследований его структуры и механизма катализа. Это обусловлено строением активного центра лакказ, в который входят четыре иона меди трех различных типов, координированное взаимодействие которых в процессе каталитического акта одноэлектронного окисления доноров электронов или водорода, позволяет осуществлять восстановление молекулярного кислорода непосредственно до воды, минуя стадию образования пероксида водорода. Большой интерес как в фундаментальном, так и прикладном плане, представляет субстратная специфичность лакказ, способных окислять широкий круг органических (в первую очередь фенольных) и неорганических соединений. Окисление органических соединений протекает по свободно-радикальному механизму, который в настоящее время до конца не изучен. Кроме того, лакказа является одним из важнейших компонентов лигнолитического комплекса дереворазрушающих грибов белой гнили, осуществляющих разложение (а в некоторых случаях и синтез) одного из наиболее распространенных природных полимеров - лигнина, и роль лакказы в этих процессах до конца неизвестна.
Интерес к практическому использованию лакказ возрос в середине 90-х годов XX века, после открытия медиаторов - соединений, «усиливающих» действия лакказ [Bourbonnais, Paice, 1990], что позволило существенно расширить область их практического применения. Медиаторы лакказ представляют собой субстраты этих ферментов, в процессе окисления которых образуются высоко потенциальные и химически активные продукты. Последние могут вступать в реакцию с соединениями, которые не подвергаются окислению одними лакказа-ми. Кроме того, в процессе окисления органических субстратов образуются свободные радикалы, которые могут модифицировать другие соединения. Это позволяет существенно расширить область использования лакказ.
Таким образом, создание высокоэффективных лакказа-медиаторных систем для использования в биотехнологии является в настоящее время весьма актуаль-
ным. Для этого необходимо изучить физико-химические характеристики лакказ из различных базидиальных грибов с целью выбора наиболее высокопотенциальных ферментов для использования в различных биотехнологических процессах, разработать методологию отбора и исследования потенциальных редокс-медиаторов лакказ и провести апробацию лакказа-медиаторных систем на реальных объектах.
