Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I . Микошльные грибы и возможность их использования в борьбе со ржавчиной хлебных злаков 9
I.I. Общая характеристика грибов данной экологической группы 9
1.2.Микофильные грибы - гиперпаразиты возбудителей ржавчины зерновых культур. 13
1.3.Образование микофильными грибами антибиотических веществ с противоржавчинным спектром действия... 22
ГЛАВА 2. Бактерии как естественные враги возбудителей ржавчины зерновых культур 26
ГЛАВА 3. Использование антибиотиков для защиты хлебных злаков от поражения возбудителями ржшчинных заболеваний 29
Экспериментальная часть 37
ГЛАВА 4 . Вьщеление cladoboiryum varium из природного региона 37
4.1. Материал и методы 37
4.2. Результаты и их обсуждение 38
ГЛАВА 5. Культивирование изолятов cladobotryum varium на твердых и жидких питательных средах 45
5.1. Материал и методы 45
5.2. Результаты и их обсуждение 47
ГЛАВА 6. Биологическая активность микошльного гриба cladobotryum varium к возбудителю стеблевой ржавчины пшеницы - puccinia gramihis f.sp.tritict 61
6.1. Материал и методы 61
6.2. Результаты и их обсузодение 66
ГЛАВА 7. Микошильшй гриб cladobotryum varium- продуцент антибиотика противоржавчинного спектра действия 79
7.1. Условия выращивания и хранения продуцента 80
7.1.1. Материал и методы 80
7.1.2. Результаты и их обсулщение 82
7.2. Биосинтез антибиотика в лабораторных условиях 88
7.2.1. Материал и методы 88
7.2.2. Результаты и их обсуждение 91
7.3. Выделение и химическая очистка антибиотика 97
7.3.1. Материал и методы 97
7.3.2. Результаты и их обсузвдение 99
7.4. Физико-химические свойства и антимикробный спектр действия антибиотика 104
7.4.1. Материал и методы 104
7.4.2. Результаты и их обсузщение 107
ГЛАВА 8. Получение препаративных форм антибиотика и биопрепа рата, приготовленного на основе живой культуры гриба cladobotryum varium 115
ГЛАВА 9. Шеішвюсть антибиотика полученного из культуры cladobotrytjm vahium и биопрепарата на основенивой культуры гиперпаразита в отношении подавления стеблевой ржавчины пшеницы в условиях теплицы и поля 120
9.1. Материал и методы 120
9.2. Результаты и их обсуящение 125
Выводы 133
Литература 135
Приложение 159
- Общая характеристика грибов данной экологической группы
- Материал и методы
- Результаты и их обсуждение
- Условия выращивания и хранения продуцента
Введение к работе
В решениях ХХУІ съезда КПСС, нашедших отражение в "Основных направлениях экономического и социального развития СССР на 1981--1985 годы и на период до 1990 года", а также в Продовольственной программе, принятой майским (1982 г.) Пленумом ЦК КПСС, указано на необходимость значительного увеличения сбора зерна пшеницы и доведения его среднегодового производства в 12-оЙ пятилетке до 250-255 млн.тонн.
Для достижения поставленной задачи, выполнение которой опирается на интенсификацию сельскохозяйственного производства, немаловажное значение приобретают внедрение научно-обснованной системы земледелия, эффективное применение удобрений и техники и использование высокоурожайных и засухоустойчивых сортов пшеницы. Существенным резервом повышения урожайности этой культуры является снижение потерь вызываемых инфекционными болезнями, особенно ржавчиной.
Мировой опыт борьбы со ржавчиной позволяет считать на данном этапе выведение и внедрение в практику устойчивых сортов наиболее эффективным и рентабельным средством защиты пшеницы от данной группы заболеваний. Важное значение имеют сортосмен, агротехнические и организационно-хозяйственные мероприятия, проведение которых направлено на ликвидацию или ограничение запасов патогена и повышение сопротивляемости растений к возбудителям. Другим направлением борьбы со ржавчиной пшеницы является протравливание семенного материала системными препаратами иммунизирующего действия - виплатом, беномилом, плантваксом, а также обработка растений фунгицидами - цинебом, манебом, поликарбацином, ровралом и рядом других ядохимикатов (Назарова, 1975 ; Поляков, Федоров, 1975 ; Мкртчян и qp., 1981 ; Fehrman, 1981 ; Rowell , 1981).
Однако, как показывает практика, наличие слабо поражаемых сортов пшеницы, проведение агротехнических и организационно-хозяйственных мероприятий и использование фунгицидов не гарантиру-от полностью от опасности возникновения эпифитотий ржавчины. В связи с этим, в научно-исследовательских лабораториях и на опытных станциях многих стран продолжаются изыскания и разработка новых способов и средств борьбы с этой вредоносной группой заболеваний важнейшей сельскохозяйственной культуры. Особое внимание уделяется научному обоснованию и практическому использованию микробиологического метода, основанному на применении гиперпаразитов и антибиотиков, внедрение которого, как наиболее безопасного для растений, животных и человека, позволило бы совместно с применением устойчивых сортов, проведением организационно-хозяйственных и агротехнических мероприятий решить проблему зашиты пшеницы от ржавчины.
Повышенный интерес у специалистов, работающих в направлении обоснования и разработки микробиологического метода вызывают ми-кофильные грибы, экология и специфические условия питания которых обусловили наличие среди них форм с гиперпаразитической и антибиотической активностью в отношении ряда фитопатогенных микроорганизмов, в том числе и возбудителей ржавчины хлебных злаков (Рудаков, 1981). Обнадеживающие результаты, полученные рядом исследователей по выяснению возможности использования микромицетов этой экологической группы в борьбе со ржавчиной зерновых культур позволяют считать актуальным проведение дальнейших исследований в направлении изучения микофильных грибов и отбора среди них перспективных форм.
Целью наших исследований явилось изучение микофильного гриба iladobotryum varium Nees ex Duby И Выяснение ВОЗМОЖНОСТИ ЄГО ИС-
7 пользования для разработки микробиологического метода борьбы со стеблевой ржавчиной пшеницы. Основанием для выбора объекта изучения и проведения с ним работы в этом направлении послужили имеющиеся в литературе указания о возможности паразитирования ciado-jotryum varium на ржавчинных грибах и продуцирования им антибиотика тернатина с противоржавчинным спектром действия. Сведений об эффективности антибиотика в отношении подавления стеблевой ржавчины и данных по условиям его получения в публикациях не приводится.
В соответствии с выбранной целью нами были определены следующие конкретные задачи исследований:
I. ВыделИТЬ ИЗ ПРИРОДНОГО региона ИЗОЛЯТЫ Cladobotryum vari- mf изучить их культурально-морфологические признаки и свойства, потребность в основных источниках питанжя и уровень естественной изменчивости;
2. Оценить изоляты гриба по характеру и степени проявления
ИМИ бИОЛОГИЧеСКОЙ актИВНОСТИ К Puccinia graminis f.sp.tritici и отобрать среди них формы с высокой антибиотической активностью и гиперпаразитической агрессивностью к фитопатогену ;
Разработать условия биосинтеза, выделения и химической очистки продуцируемого ciadobotryum varium антибиотика и провести изучение его физико-химических свойств и спектра действия;
Наработать опытные образцы препаративных форм антибиотика и биопрепарата, полученного на основе живой культуры ciadobotryum rarium и оценить эффективность их применения в условиях лаборатории, теплицы и поля в отношении подавления возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы и снижения развития заболевания.
Работа выполнялась в период с 1973 по 1983 год во Всесоюзном сельскохозяйственном институте заочного образования (ВСХИЗО) и
8 Всесоюзном научно-исследовательском институте микробиологических средств защиты растений и бактериальных препаратов (ВНИИбакпре-парат), а также в теплице и лаборатории искусственного климата биологического факультета МГУ под руководством доцента кафедры микробиологии, физиологии растений и фитопатологии ВСХИЗО, кандидата биологических наук Н.П.Яковлевой. При проведении исследований по разработке условий выделения и химической очистки антибиотика пользовались консультацией зав.химико-технологической лабораторией ВШИбенпрепарат, кандидата биологических наук Е.Б.Круг-ляк.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Общая характеристика грибов данной экологической группы
В основу понятия термина "микофильность" положена способность организмов развиваться в природе за счет грибов. Известны мико-фильные виды вирусов, бактерий, актиномицетов, но грибы значительно превосходят их по числу видов и по биологической активности. К настоящему времени в литературе описано свыше 3,5 тысяч видов микофильных грибов, половину из которых, по-видимому, следует считать синонимами. Большинство видов сосредоточено в систематических группах, где наблюдается затухание полового процесса и массовое развитие конидиального спороношения. Так, если к сумчатым и базидиальным грибам относится в общей сложности около 600 видов микофилов, то среди деутеромицетов их почти в 2 раза больше (Рудаков, 1981).
Микофильные грибы описаны, в основном, на макромицетах, что объясняется, вероятно, сложностью их поиска и выделения. Они больше встречаются в естественных ботанических формациях, чем на сельскохозяйственных посевах, поскольку приемы земледелия и применение фунгицидов приводят к нарушению биологических циклов (Рудаков, 1978). Многие грибы из этой экологической группы обнаружены в средних широтах с умеренным климатом и в последнее время в тропиках, где преобладают,соответственно, деутеромицеты и аско 10 иицетные микофильные виды (Рудаков, 1981; Rao , Salam, I960 ; Deigton , Pirozynski, 1972). Микофильные грибы неравномерно рас-[фостранены и по территории Советского Союза. Значительно чаще они встречаются в Молдавии, Центральной полосе России, во влажных районах Закавказья, на Сахалине ;реже-в Сибири и Средней Азии (Мазелайтис, 1961 ; Коваль, 1964 ; 1968 ; Сидорова, Горленко, 1969 ; Рудаков, 1971, 1972, 1981 ; Баймакова, 1974 ; Хасанов, 1974 ; Пуза-нова, 1981). В северных широтах интенсивно развиваются только некоторые виды (Пылдмаа, 1966).
Выяснению специализации микофильных грибов посвящено ряд экспериментальных исследований, выполненных в лабораторных и полевых условиях. Установлено, что большинство видов мало специализировано и поражает широкий круг грибов - хозяев из различных систематических групп. Однако, имеются и узкоспециализированные вицы, как, например, ПОЛусапрофИТНЫЙ МИКОфил РЄПІСІІІІШІ notatum, Приуроченный К отдельным Видам ржавчины ЗЛаКОВ ( Bahadur, Sinha, 1974). Высокая специализация характерна, в первую очередь, для эндогенных ВИДОВ Cnytridiales (Karling, 1942, 1960; Wynn, Epaton, 1979).
Повышенный интерес специалистов, особенно в последние годы, к изучению микофильных грибов объясняется тем, что в силу специфических пищевых и экологических связей среди них встречаются формы, обладающие резко выраженными паразитическими свойствами и способностью продуцировать физиологически активные вещества (антибиотики, токсины, дрожжелитические и другие ферменты).
Первые сведения о микопаразитизме относятся к концу прошлого - началу нынешнего столетия (Bre-f eld , 1872 ; bindau , 1907). Хотя к настоящему времени по этому вопросу опубликовано большое количество работ, паразитические свойства установлены лишь у небольшой части видов, что объясняется недостаточной изученностью микофильных грибов в этом направлении. Особенно большой вклад в изучение проблемы микопаразитизма внесли Е.Гойман ( Gaumann , 1947, 1954), М.Бусалис ( Boosalis , 1956), Х.Барнет ( Barnett , 1958, 1963, 1964, 1973), Е.Батлер (Butler , 1957), Х.Дерпукс ( Багроошц: I960), Х.Форрер ( Forrer , 1977, 1981) и ряд других зарубежных авторов, а из советских исследователей - О.Л.Рудаков (1965, 1971, 1972, 1974, 1977, 1978, 1981) и И.Й.Сидорова с сотрудниками (1964, 1969, 1974, 1975, 1977а, б, 1980). С учетом общности основных пищевых связей, с одной стороны, и определенного различия в контактах с грибом - хозяином, с дру гой, Е.Гойман (1954), а затем Х.Барнет ( Barnett , 1963) подраз делили микофильные грибы на физиологические подгруппы: биотрофов и некротрофов, подразумевая, что первые паразитируют на живых грибах-хозяевах (сбалансированные микопаразиты), а вторые предва рительно убивают их клетки (деструктивные микопаразиты). Разделе ние микофильных грибов на биотрофные и некротрофные подгруппы от ражает наиболее крупные физиологические различия организмов, име ющих и морфологические особенности. Граница между физиологически ми группами биотрофов и некротрофов является нечеткой и включает ряд промежуточных форм. Переход от биотрофов к некротрофам хоро шо выражен, например, у Darluca filum . Как показал Дж.Карлинг с сотрудниками ( Kariing , I960), гифы этого гриба внед ряются в клетки хозяина, разрушая их оболочку ферментами, затем паразитируют биотрофно и, наконец, вызывают некроз клетки. На основании более детального изучения физиологического различия микофильных грибов и характера взаимоотношений с грибом-хозяином предложено подразделение их на шесть групп: биотрофы, факультативные некротрофы, факультативные биотрофы, некротрофы, полусапрофитные микофилы и сапрофитные ассоцианты (Rudakow , 1978).
В процессе приспособления грибов к микопаразитизму у них выработалась способность отнимать у хозяина продукты питания, как путем погружения органов (или всего таллома) внутрь клеток гриба--хозяина, так и с помощью образования экзогенных органов. По вопросу механизма проникновения гиф микопаразита в мицелий или плодовые тела хозяина в науке нет единого мнения. Имеются факты, указывающие, что внедрение гиф обусловлено либо действием ферментных систем, с помощью которых происходит разрушение клеточной стенки гриба-хозяина, либо механически. Некоторые специалисты рассматривают механизм проникновения микопаразита как совокупность механической силы с разрушительным действием выделяемых грибом энзимов: ксиланазы, хитиназы, пектиназы, глюконазы (Тиуно-ва И др., 1973 ; Siegle , 1961 ; Durrell , 1968 ; Dennis , Webster, 1971 ; Jones et al. , 1974; Hoch , Puller , 1977).
Материал и методы
Объектом поиска служил МИКОфильныЙ гриб Cladobotryum varium» С целью обнаружения этого микромицета на шляпочных грибах и трутовиках в конце июля - начале августа были предприняты маршрутные экспедиции в лесные массивы северных, западных, южных и восточных районов Московской области. Такая приуроченность поиска гриба ко времени и субстрату основывалась на литературных сведениях относительно развития C.varium во второй половине лета преимущественно на плодовых телах представителей этих групп мак-ромицетов (Рудаков, 1971, 1972 а). В те же сроки обследовали пораженные возбудителями ржавчины хозяйственные посевы зерновых культур для выявления C.varium на фитопатогене, поскольку в литературе, за исключением сообщения Б.А.Хасанова (1974), данных по заселению этим грибом спороношений ржавчины не приводится.
Во время маршрутных экспедиций был собран растительный материал в виде плодовых тел шляпочных грибов, трутовиков и злаки с пустулами ржавчины, на которых наблюдалось наличие мицелиально-го налета. Такая предварительная, по внешним признакам, экспер -тиза значительно облегчала последующую работу по выделению мико-филов с грибов-хозяев. При сборе макромицетов и возбудителей ржавчины хлебных злаков, хранении и выделении с них микофильных грибов пользовались методическими рекомендациями О.Л.Рудакова (1972 а) и Б.А.Хасанова (1974). Грибы выделяли на среду Чапека с добавлением 1% кукурузного экстракта. За исключением представите 38 лей Cladobotryum , все выделенные микромицеты определяли до рода. При идентификации грибов руководствовались определителями Л.И.Курсанова (1954), А.С.Боццарцева (1953) и Х.Барнетта (Ваг-nett , 1965). 4.2. Результаты и их обсуждение Итоги работы по выделению микофильных грибов с плодовых тел макромицетов и со спороношений ржавчины зерновых культур приведены в таблице I. В общей сложности с грибов - хозяев выделено 756 культур микромицетов, из которых 85 представлены грибами рода Clado botryum . Ццентификация последних позволила отнести 52 изолята к C.varium , а остальные - к Cbinatum . Культуры C.varium были изолированы исключительно с трутовиков и шляпочных грибов, причем с плодовых тел Russula sp. было выделено 26 изолятов. На возбудителях ржавчины хлебных злаков c.varium не обнаружен. На спороношениях этой группы фитопатогенов развива лись преимущественно представители родов Fusarium, Cladosporium, Penicillium, Verticillium u Darluca . 0 наличии на возбудите лях ржавчины зерновых культур микофильных грибов указанных выше родов сообщается в работе Б.А.Хасанова (1974). Выделение микофильных микромицетов с плодовых тел шляпочных грибов и трутовиков и их идентификация показали, что большинство из них принадлежат К родам Irichoderma, Penicillium, Botrytis u Fusarium, Таким образом, в результате поиска C.varium и выделения его из природного региона была собрана коллекция культур этого микофильного гриба насчитывающая 52 изолята. Таблица I Изучение особенностей роста продуцентов биологически активных веществ на агаризированных и жидких питательных средах и потребности культур в основных источниках питания имеют большое значение для выяснения условий получения продуктов метаболизма или живой накопительной культуры микроорганизма. В отношении c.varium такая работа проводиласьізпервне.
Объектом исследований служили выделенные из природного региона 52 изолята микофильного гриба c.varium. С целью изучения культурально-морфологических признаков и свойств, естественной изменчивости и потребности в основных источниках питания изоляты выращивали на твердых и жидких питательных средах. В качестве твердых сред использовали среду Чапека, среду Чапека с 1% кукурузного экстракта, картофельный и сусловый агары. РН сред (после стерилизации) - 6,2 - 6,4. В чашки Петри заливали по 15 мл агаровой среды, которую засевали 2-х недельной культурой гриба. Посев проводили "уколом" в центр чашки Петри. Чашки помещали в термостат (Т=25 + 0,5С). На 6-е и 8-е сутки роста визуально и под микроскопом просматривали выросшие на средах колонии гриба. Изоляты оценивали по характеру и интенсивности роста, окраске воздушного и субстратного мицелия, пигментации среды, размерам конидий и по продуктивности спорообразования и накопления биомассы. При описании окраски мицелия использовали шкалу цветов А.С. Бондарцева (1954). У каждого изолята промеряли по 500 конидий, показатели размера которых подвергали статистической обработке по В.Вольфу (1966). Для отделения биомассы агаровую среду расплавляли с последующим добавлением в нее 10 мл воды (Т=+40С). Отфильтрованную и помещенную на бумажный диск биомассу доводили до постоянного веса при +105С. Продуктивность изолятов по биомассе ПО с оценивали»весу сухого мицелия 15 мл среды (мг/15 мл). Для характеристики изолятов по спорообразованию конидии гриба смывали с поверхности культуры дистилированной водой. Конидиальную суспензию фильтровали через двойной слой марли для удаления крупных конгломератов. Подсчет конидий проводили в камере Горяева. Продуктивность изолятов по спорообразованию оценивали по количеству спор с 15 мл среды (млрд /15 мл).
Результаты и их обсуждение
При выяснении особенностей роста изолятов c.varium на агаризированных средах было установлено, что морфолого-культураль-ная их характеристика соответствует, в основном, видовым особенностям гриба (І даков, 1981). Микофил образовывал колонии белого, серовато-белого или кремового цвета ; субстратный мицелий - бесцветный ; среда не пигментировалась. Изоляты формировали конидиа-льное спороношение: конидионосцы прямостоячие, септированные, му-товчато-ветвистые 11-28 х 2-4 мкм. Конидии, собранные в цепочки, элиптические, с оттянутой бородавочкой у основания, двуклеточные, размером 10-23 х 6-9 мкм.
По характеру и интенсивности роста, степени спорообразования и уровню накопления биомассы вьщеленные из природного региона изо ляты c.varium были отнесены нами к одному из трех культураль-ных типов: спорулирующему ("С"), мицелиальному ("М") или мице-лиально-спорулирующему ("МС").
Культуры спорулирующего типа образовывали на средах колонии с равномерно развитым, прижатым, плотным воздушным мицелием светло-кремового цвета. Обильное спороношение придавало колониям гриба порошистую консистенцию (рис.1). Изоляты мицелиального культурального типа отличались от описанных выше форм наличием пышного, воздушного мицелия белого цвета, без порошистого налета на его поверхности из-за слабой спо-руляции (рис.2).
Отнесенные к промежуточному типу культуры c.varium формировали на средах неровные колонии, местами с плотным, прижатым, спорулируюшим мицелием светло-кремового цвета, а участками - с пышным аспорулирующим или слабоспорулирующим белым или светло-серым мицелием (рис.3). Изоляты данного типа характеризовались высокой интенсивностью роста на среде Чапека: на 6-ой день колония занимала всю поверхность среды в чашке, в то время как для культур двух других типов подобная картина наблюдалась лишь на 8-е сутки. Наиболее четко разделение изолятов на три культуральных типа проявлялось на среде Чапека, а затем, по степени снижения, на среде Чапека с 1% кукурузного экстракта, картофельном и сусловом агарах.
Большинство выделенных из природного региона изолятов с. varium отнесены нами к мицелиально-спорулирующему культурально-му типу (55,7$ от общего их количества). О преимущественном наличии в популяции некоторых видов микромицетов изолятов промежуточного культурального типа имеются данные в литературе (Васин, 1966 ; Hooker, 1957). Обоснованность разделения изолятов с.varium на три культуральных типа при росте на агаризованных средах подтвердилась при проведении оценки их продуктивности по конидиообразова-нига и биомассе. Полученные данные представлены в таблице 3. Таблица З Средняя продуктивность по биомассе (мг/15 мл) и конидиообразованию (млрд/15 мл) изолятов ciadobotryum varium разных культуральных типов при росте на агари-зованных средах аль Чапека !кукурузным экстрактом Кулы тип _Cp e aj, агар ІЧапека с Картофель-ТСусловнїї і ный агар Спорули-рующий Биомасса 152,6 Конидии 6,320 168,6 6,860 206,1 3,540 221,9 3,160 Мицелиально-спорулирую-ший Биомасса 198,6 Конидии 3,830 225,4 3,940 278,1 1,186 312,6 1,084 Мицелиаль-ный Биомасса 218,3 Конидии 0,270 259,8 0,340 296,4 0,09 347,1 0,08 Для изолятов всех трех типов максимальное накопление биомассы отмечено на сусло-агаре, а затем, по мере снижения, на картофельном агаре и средах Чапека. В отношении конидиообразования наблвдалась обратная зависимость: гриб лучше спорулировал на среде Чапека с 1% кукурузного экстракта, чем на картофельном и сусловом агарах. По-видимому, высокая интенсивность спорообразования изолятов Сvarium на менее богатых по составу средах обусловлена обеднением их питательными веществами, в результате чего стимулировался переход гриба к формированию репродуктивных органов. Как и предполагалось, для изолятов спорулирующего культу-эального типа характерна высокая продуктивность образования кони-j ций. Культуры мицелиально-спорулирующего типа, уступая мицелиаль-ным формам по накоплению биомассы, превосходили их по спорообразованию. Наряду с культуральными, выяснились и морфологические особенности, а именно изменение размеров конидий в зависимости от сре-цы выращивания и принадлежности изолятов к определенному культу-ральному типу. Было установлено, что существенной вариабильности по изменению размеров конидий у изолятов разных типов не наблюдается. Отмечено лишь увеличение конидий при выращивании гриба на сусло-агаре (табл.4). Отсутствие морфологических различий у изолятов, выделенных из одного региона - явление закономерное. Что касается c.varium, то по данным О.Л.Рудакова у этого гриба изоляты разного географического происхождения слабо различаются по величине формируемых ими конидий (Рудаков, 1981).
Условия выращивания и хранения продуцента
Материалом исследований служила отобранная нами в качестве продуцента антибиотика культура Cvarium (изолят MC-I6). Содержание антибиотика в культуральной жидкости определяли как методом серийных разведений с диффузией в агар и уредоспора-ми Puccinia graminis f.sp.tritici в качестве теста, так и по способу, разработанному Е.Б.Кругляк с сотрудниками (1980), основанному на общеизвестном принципе тонкослойной хроматографии. Чувствительность биологического метода - 20 м г/мл, химического -2мкгв нанесенной пробе. Срок определения активности культуральной жидкости биологическим методом - 20 час. ; химическим - 2 часа. Точность химического метода + 10$. С целью изучения условий получения жидкой посевной культуры (инокулята) проводили исследования по выяснению возрастных изменений гриба в процессе глубинного его выращивания на 3-х средах. Прописи сред были составлены по результатам проведенной нами предварительной работы: среда I - сахароза - 3$, NaN03 - 0,3$, КН2Р04 - 0,1$, MgS04 -0,05$, KCl-0,05$, PeS04 - 0,001$, кукурузный экстракт - 1$ (по весу сухого мицелия среда 2 - глюкоза - 4$, соевая мука - 1,3$ ; ШірРО - 0,1$, 1 - 0,01$, Mg304 - 0,01$, кукурузный экстракт - 0,5$ (повесу сухого мицелия среда 3 - глюкоза - 5$, соевая мука - 1,5$, Mgs04 - 0,02$, KgSO - 0,02$, КНрРОд - 0,2$. Колбы Эрленмейера, содержащие по 100 мл среды (РН сред после стерилизации - 6,2-6,4) засевали 2-недельной культурой продуцента и помещали на 48 часов на роторную качалку (V =200 об/мин; Т=26+0,5С). На 8-й и 12-ый час после посева, а в дальнейшем через каждые 6 часов проводили отбор проб культуральной жидкости для визуального наблюдения за характером роста культуры, микроскопирования и определения веса биомассы. Живые и фиксированные гифы гриба окрашивали метилен-блау (по Лёффлеру, с целью определения степени базофильности цитоплазмы), Суданом Ш (для установления наличия в цитоплазме запасных веществ), а также раствором гемотоксилина (для окрашивания ядер). При приготовлении и применении красителей руководствовались монографией Пирса (1962).
Посевной материал вносили в ферментационную среду в количестве Ъ% по объему. В качестве ферментационной использовали среду, содержащую пептон - 1%, глюкозу - 2,5% и кукурузный экстракт мицелия 0,3% (повесу сухогс\ & которая является модификацией среды, применяемой нами в исследованиях по отбору изолятов c.varium , проявляющих биологическую активность к возбудителю стеблевой ржавчины пшеницы. Методика и экспериментальные данные по получению указанной выше среды приводятся в следующем разделе. Биосинтез антибиотика вели в течение 5 суток в колбах Эрленмейера (со 150 мл среды), помещенных на роторную качалку ( V = 200 об/мин; Т= 26 + 0,5С). Качество переданного на ферментацию инокулята оценивали по активности культуральной жидкости, которую определяли спустя 72 часа после начала ферментации, а затем через каждые 8 часов.
При проведении работы с продуцентом варианты каждой серии опытов закладывали в 10-кратной повторности. В таблицах приведены данные, являющиеся средними результатами из десяти повторностеи. 7.1.2. Результаты и их обсудцение В итоге многократно проведенных экспериментов было установлено, что антибиотическая активность продуцента (изолят MC-I6) при оптимальных условиях проведения процесса биосинтеза на ферментационной среде указанного выше состава равна 18 единицам разведения (360мкґ/мл), причем воспроизводимость такого уровня активности высокая ( % 95$).
Определение активности у 100 моноконидиальных клонов, полученных в результате рассева культуры продуцента, показало наличие среди них как плюс ("+"), так и минус ("-") вариантов, причем общее их количество не превышало 10$. Отклонения по уровню антибиотической активности от исходной культуры составляли не более + 15$. Полученные данные свидетельствуют об относительной гетерогенности изолята МС-І6 по признаку антибиотикообразования. В связи с этим, при работе с продуцентом применялся монокони-диальный рассев и отбор вариантов с наибольшей антибиотической активностью к возбудителю стеблевой ржавчины пшеницы.
Изучение зависимости уровня активности продуцента от среды культивирования (среда Чапека, среда Чапека с 1% кукурузного экстракта, картофельный и сусловый агары), условий и сроков его хранения в пробирках на косяках позволило установить, что лучшей из испытанных сред является среда Чапека с кукурузным экстрактом. Выращенный в течение 2-х недель на этой среде при температуре 25 - 0,5С изолят проявлял антибиотическую активность в пределах исходной его характеристики (360 мкг/мл), в то вреіля как при культивировании на других средах активность сни 83 жалась. При хранении культуры в холодильнике (Т =+3 - +4С) в течение б месяцев заметного падения уровня антибиотикообразова- ния не отмечалось. Установлено, что при культивировании изолята не следует проводить более 3-х его пассирований на среды во избежание снижения у продуцента биосинтетической способности. Наличие продуцента и выяснение условий культивирования и хранения его в пробирках на косяках позволили приступить к разработке способа лабораторного получения антибиотика. Начальным этапом исследований в этом направлении явилось изучение условий выращивания и хранения жидкой посевной культуры (инокулята). При проведении работы по получению инокулята были использованы как результаты наших исследований и литературные сведения относительно потребности микофильных грибов (в том числе и c.varium ) в основных источниках питания, так и данные по изучению нами возрастных изменений продуцента в процессе его культивирования в жидкой аэрируемой среде (Муромцев, 1969 а, 1970а, 1971 ; Рудаков, 1971, 1972, 1981 ; Нурахтанова, 1972 ; Васин и др., 1975 ; Алешина и др., 1976 ; Acha,fi at., 1955).
Наблюдения за возрастными изменениями в мицелие и цитоплазме клеток продуцента при росте его на 3-х различных по составу посевных средах позволили условно разделить весь цикл развития гриба на 4 фазы. 0 возрастных изменениях у грибов при культивировании их на средах имеются данные в литературе (Смирнова, Бек-кер, 1954 ; Беккер и др., 1956 ; Дмитриева, 1966 ; Лихачев и др., 1977 ; Кононова, 1979).
По нашим наблюдениям, первая фаза развития C.varium при росте на посевных средах, в основном, заканчивается к 12 часам. К этому времени завершается массовое прорастание конидий одной-двумя ростовыми гифами, интенсивно и равномерно окрашивающимися метиленблау в голубовато-синий цвет. За счет роста и переплетения гиф образуются отдельные округлые микроколонии про- ; дуцента.
К 24 часам гриб вступает во вторую возрастную фазу, отличительной особенностью которой является формирование зерновидной биомассы, состоящей из тонких, сильно ветвящихся, молодых гиф ; содержание ее в среде относительно невелико и не превышает 600 мг на 100 мл среды. Протоплазма и ядра клеток интенсивно окрашиваются красителями. Вакуолей и жира в клетках не образуется.
В течение последующих 12-16 часов продуцент завершает переход в третью возрастную фазу. Биомасса, состоящая из молодых, тонких, сильно ветвящихся и более крупных, слабо ветвящихся гиф -хлопьевидная ; нарастание ее замедляется. Протоплазма клеток характеризуется высокой базофилией. Лишь в некоторых клетках наблюдается образование мелких вакуолей.
