Введение к работе
Актуальность темы. Среди различных классов мобильных генетических злементов, обнаруженных в клетках эукариот, особый интерес представляют ретротранспозоны, сходные по ряду признаков с провнрусами ретровнрусов позвоночных и использующие для своей транспозиции механизм обратной транскрипции. Благодаря этому сходству ретротранспозоны таких широко используемых в генетике организмов, как Drosophila melanogaster и дрожжи Saccharomyces cerevisiae, могут служить моделью для исследования механизмов регуляции основных энзиматическнх процессов, обеспечивающих жизненный цикл ретроэлементов - образования вирусоподобных частиц (ВПЧ) и обратной транскрипции. В настоящее время изучение этих механизмов стало особенно актуальным в связи с распространением вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и других патологических ретровнрусов, поиском путей борьбы с ними. Кроме того, сами ретротранспозоны достаточно широко распространены в природе (они описаны у большинства генетически изученных эукариотическнх организмов) и играют важную роль в эволюции геномов.
Для исследования цикла транспозиции дрожжевого Туї-элемента в 1985 году двумя независимыми группами исследователей была предложена модельная система, которая позволяет искусственно индуцировать его транспозиции путем трансформации дрожжевых клеток рекомбинантнымн плазмидами, содержащими Ту1-элемснт под контролем сильного дрожжевого промотора (Boeke ct al., 1985; Mellor et al., 1985). При этом в клетке индуцируется цикл ретротранспозицин Туї, связанный с образованием ВПЧ, содержащих интермедиаты обратной транскрипции Туї и активность обратной транскриптазы. Ранее ВПЧ были обнаружены в культурах клеток дрозофилы; в настоящее время есть основания предполагать, что их образование связано с транспозиционным циклом ретротранспозонов дрозофилы. Но изучение экспрессии индивидуальных ретротранспозонов дрозофилы представляет ряд проблем, поскольку в ее геноме содержится множество семейств разнообразных мобильных элементов. В последнее время для изучения экспрессии реіротранспозоиов дрозофилы разрабатываются методические подходы, основанные на использовании в качестве модельных систем культур клеток других видов дрозофилы И дрожжей-сахаромицетов. Такие исследования несколько лет назад были начаты в лаборатории молекулярной генетики высших организмов (ЛМГВО) НО Ген РАИ (Резник и др., 1988; 1990) и продолжаются в настоящее время. Было показано, что реіротранспозон дрозофилы вызывает активацию образования в дрожжевой клетке ВПЧ Туї-элемента (Резник и др., 1988, 1990). Механизм индукции
ретротранспозицин Туї к настоящему времени недостаточно исследован. В связи с этим представляется актуальным исследование роли конкретных белков, в частности, обратной транскриптазы п индукции ретротранспозицин. Одним из распространенных методов иіучспия механизмов ретротранспозицин является использование генетически маркированных Ту-элсмснтов. Предпринятое нами исследование экспрессии гена люциферлы Phoiinus pyralis, клонированного под начало второй открытой рамки считывания (ОРСП) ТуІ-злеменіа, аналогичной рої-гену рстровирусов, представляет как научный, так и практический интерес. Настоящая работа входит в общий цикл исследовании, посвященных механизмам ретротранспозицин, которые проводятся в ЛМПЮИОГснРЛН.
Цель и зялячи исследования. Целью работы являлось изучение экспрессии регрогранспозонов дрозофилы в клетках дрожжей-сахаромнцстов и гетерологичной активации экспрессии дрожжевого ТуІ-злемоіпа. поиск возможных механизмов этой активации. Конкретной задачей было исследование ИПЧ. образующихся в клетках, трансформированных плазмнднымн векторами, содержащими рстротранспоэоны дрозофилы. Для изучения роли обратном транскриптазы в механтме гетерологичной нндумшн экспрессии дрожжевого Tyl-элемеМта было предпринято исследование индукции транспозиционного цикла Туї-элемента ретропнрусной обратной транскрнптазон, эффективно экспресснрующеися в дрожжевой клетке. Специальной задачей работы являлось исследование экспрессии в дрожжах тема люцнферазы, клонированного под начало второй открытой рамки считывания (ОРСІI) Ту I-элемента, и упаковки люциферлы в транспоэон-несущне Ы1Ч.
Научная повний работ. Мами было предпринято ніучсние экспрессии в дрожжевой клетке трех различных рстротранспоэонов дрозофилы - соріа. 17.6 и gypsy. Мы показали, что все три исследованных нами рстротрансіюзоші дрозофилы индуцируют в клетках дрожжей образование ВИЧ, содержащих Ту|-элемент, независимо от типа дрожжевого промотора (конститутивною или нндуцнбельного). направляющего их экспрессию. >го позволяет предположить, что гетерологнчная индукция образования ВИЧ ТуІ-»лечеімом - закономерное явление для регрогранспозонов дрозофилы несмотря на значительные различия в их структуре. Таким образом, данные по гетерологичной индукции экспрессии Туї ретротранспозоном дрозофилы gypsy (Резник и др., I4S8: IW0) были подтверждены нами на более обширном материале. Кроме того, мы показали, что пмерологичная индукция образования ІІІІЧ является результатом экспрессии ретротранспозонов дрозофилы.
Нами впервые была покатана активация транспозиционного цикла ТуІ-злемента в клетках дрожжей, эксмрсссирующнх обратную транскриптаэу III 14. Выло установлено, что в клетках, трансформированных вектором, содержащим последовательность обратной транскрнптазы ВИЧ под высокоэффективным дрожжевым промотором GAP, индуцируется не только образование ВПЧ, содержащих полноразмерный Туї-элемент, но и собственно транспозиция геномных Туї-элементов.
В работе впервые было предпринято исследование упаковки в ВПЧ гетерологнчного белка, синтезируемого под контролем ОРСІ1 Tyl-элемента, хотя подобные конструкции ранее создавались (Mellor ei al., 1985). Было показано, что ген люциферазы светляка Photinus pyralis, клонированный под начало OPCII Tyl-элемента. успешно экспрессируется в дрожжах. При этом активность люциферазы регистрируется в клеточных фракциях, содержащих ВПЧ.
Научно-практическое значение. Результаты работы могут быть использованы в практических разработках по созданию эффективных систем гетерологнчной экспрессии в дрожжах. Результаты исследования активации транспозиционного цикла Tyl-элемента гетерологичнымн ретротранспозонами и обратной транскриптазой ВИЧ Могут быть использованы в дальнейших исследованиях механизма индукции ретротранспознции. Методический подход к экспрессии в дрожжах индивидуальных ретротранспозонов дрозофилы требует развития, перспективы которого обсуждаются ниже.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на 11 Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (ноябрь-декабрь, 1991 года, Пущино-на-Оке), IV Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (ноябрь-декабрь 1992 года, Пущино-на-Оке) и на семинаре лаборатории молекулярной генетики высших организмов ИОГен РАН 18 декабря 1995 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 pa6of ы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 1, 2, 3 И 4), методической части (глава 5), результатов экспериментов (главы б И 7) и их обсуждения (глава 8), выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах и включает 5 таблиц и 13 рисунков. Список литературы содержит 137 наименований, из них 10 на русском языке.
