Введение к работе
Актуальность проблемы
В эукариотической клетке все процессы, определяемые ДНК (репликация, транскрипция, рекомбинация и т.д.), происходят на матрице, единицей которого является нуклеосома (Komberg R. D., and Lorch Y., 1999). Упаковка ДНК в нуклеосому существенно ограничивает возможности реализации ее потенциала: репрессируется узнавание нуклеотидной последовательности специфичными к последовательности белками, в том числе факторами, регулирующими транскрипцию, взаимодействие их с ДНК, ограничиваются процессы инициации и элонгации синтеза мРНК. В настоящее время стало понятным, что клетка обладает механизмами, которые позволяют преодолеть эти ограничения.
Более того, стало ясно, что сама нуклеосома является единицей модуляции
активности генов в ходе экспрессии. В отдельных нуклеосомах при этом происходит
глобальное их ремоделирование, включающее несколько десятков точечных энзиматических
модификаций гистонов или замену канонических гистонов их субтипами. Следствием этого
является как изменение структуры октамера гистонов, так и его взаимодействие с ДНК, что
приводит к изменению доступности ДНК для узнавания и взаимодействия с факторами
транскрипции. *
Свой значительный вклад в регуляцию экспрессии генов вносит феномен позиционирования нуклеосом. Позиционирование нуклеосом означает неслучайный характер распределения нуклеосом по последовательности ДНК или по отдельным участкам гена. На первом этапе изучения позиционирования нуклеосом было выявлено, что позиционирующим сигналом обладает сама последовательность ДНК. Выявлен ряд особенностей первичной структуры ДНК, благоприятствующих связыванию октамера или затрудняющих его. Показано, что по своей аффиности разные последовательности ДНК отличаются на порядки. Затем стало ясно, что нуклеосомы неслучайным образом расположены по гену, в частности, наиболее выражено позиционирование на промоторных участках гена. В настоящее время существуют несколько моделей, объясняющих как позиционирование нуклеосом на промоторах, которое блокирует узнавание ТАТА-боксов, преодолевается в ходе индукции гена. Практически не исследованы вопросы о возможных других сигналах позиционирования, в частности, наличие соседних нуклеосом, влияние соседствующих последовательностей ДНК и иных пограничных факторов.
Мы предложили тактику исследования этих проблем на дрожжевых плазмидах, в которых генно-инженерным путем осуществили смену последовательностей ДНК, соседствующих с той, на которой позиционирована нуклеосома.
Такой подход позволяет ответить на вопрос о роли самой последовательности ДНК или участка гена и возможном взаимовлиянии соседствующих нуклеосом на их позиционирование. Поскольку для исследования был выбран индуцибельный ген неомицинфосфотрансферазы, это позволило также связать позиционирование нуклеосом с функциональным состоянием гена.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы было исследование позиционирования нуклеосом на индуцибелыюм гене неомицинфосфотрансферазы (NPTII) в составе дрожжевых плазмид. В процессе работы решались следующие задачи:
1. Выявить позиционирование нуклеосом на отдельных участках гена:
промоторе, структурной части, на вставке последовательности FRT и на вставке в ген
мономера сателлитной ДНК мыши.
2. Создать генно-инженерные конструкции, в которых для отдельных участков
гена менялись соседи, и оценить возможное влияние смены соседней последовательности
(и нуклеосом на них) на позиционирование нуклеосом на изучаемом участке гена.
3. Выявить возможное изменение позиционирования нуклеосом на промоторе
и других частях гена при индукции экспрессии гена галактозой.
4. Проверить возможный вклад гиперацетилирования гистонов при
ингибировании гистондеацетилаз трихостатином А в изменение позиционирования
нуклеосом.
Научная новизна работы
Предложен новый способ оценки взаимного влияния соседних последовательностей (и наличия нуклеосом на них) на позиционирование нуклеосом. Смену соседних последовательностей осуществляли генно-инженерным путем.
Показано, что нуклеосомы позиционированы на разных участках гена индивидуально и их положение не зависит от соседних последовательностей, соседних нуклеосом, и определяется позиционирующими трансляционным и пограничным сигналами.
Показано, что все нуклеосомы позиционированы поливариантно, что предполагает скольжение октамера гистонов относительно последовательности ДНК.
Установлено, что на промоторе гена NPTII в неактивном состоянии нуклеосомы закрывают ТАТА-бокс. При экспрессии гена нуклеосома смещается с ТАТА-бокса и репозиционируется. Новое положение этой нуклеосомы обеспечивает пространственное сближение энхансера и ТАТА-бокса.
Такой же эффект без воздействия активатора достигается при ингибировании деацетилаз гистонов.
Выявлена возможность двойного характера экспрессии одного и того же гена NPTII: индуцибельной с GALCYC-промотора и базальной с ТАТА-элемента FRT.
Практическая значимость работы
Результаты работы могут быть использованы в практике научных исследований в области молекулярной биологии.
Апробация работы
Основные результаты работы докладывались и обсуждались на Международном симпозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург,2003).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Структура работы
Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы».
