Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Мицелиальные грибы как неотъемлемый компонент биоценоза и фактор почвообразования и плодородия почв ,.7
ГЛАВА 2. Применение триазиновых гербицидов в сельском хозяйстве 16
ГЛАВА 3. Триазиновые гербициды в почве ...25
3.1. Поведение атразина в почве. Абиотическая составляющая 25
3.2. Атразин ибиотапочв 30
3.3. Влияние триазинов на почвенные грибы 31
ГЛАВА 4, Пути превращения атразина в почве 38
4.1.Фиторемедиация 38
4.2. Атразин и почвенные микроорганизмы 41
4.3. Деградация атразина грибами 45
Экспериментальная часть , 50
ГЛАВА 5. Материалы и методы 50
Объекты исследования 50
Выделение и характеристика микроорганизмов 52
Идентификация компонентов сообщества неспорулирующих мицелиальных грибов ИНБИ 2-26 54
Методы изучения внеклеточных ферментов грибов ..57
Культивирование грибов в присутствии атразина 59
Анализ содержания атразина 60
Анализ содержания атразина с помощью ИФА 60
и его производных с помощью офВЭЖХ 61
Адсорбция целлюлаз и ЦДГ на аморфоной целлюлозе. 63
Разложение атразина бес клеточной системой 63
ГЛАВА 6. Результаты и их обсуждение 64
6.1. Влияние атразина на термофильные микромицеты, выделенные из саморазогревающегося растительного компоста 64
6.1.1. Компонентный состав сообщества термофильных микромицетов 64
6.1.2. Влияние атразина на отдельные штаммы термофильных микромицетов , 71
6.2. Влияние атразина на мезофильные мицелиальные грибы - компоненты сообщества ИНБИ 2-26 и базидиальные грибы 74
6.2.1. Влияние атразина на базидиальные грибы - возбудители «белой гнили» древесины 75
6.2.1.1. Идентификация компонентов сообщества неспорулирующих мицелиальных грибов ИНБИ 2-26, выделенного из загрязненных ксенобиотиками тропических почв 78
6.2.2. Влияние атразина на компоненты сообщества ИНБИ 2-26 82
6.2.2.1 .Развитие грибов на плотных средах с атразином 82
6.2.3. Разложение атразина грибами в жидкой культуре 85
6.3.Секреция ферментов мицелиальными грибами-компонентами сообщества ИНБИ 2-26 и влияние на нее атразина 88
6.3.1. Синтез лакказы грибом ИНБИ 2-26+
и его стимулирование атразином 89
6.3.2. Синтез целлобиозодегидрогеназы и целлюлаз на бесцеллюлозных средах грибом Chaetomium sp. ИНБИ 2-26- и его стимуляция атразином 93
6.4.Возможные пути разложения атразина почвенным грибом Chaetomium sp. ИНБИ 2-26- 99
6.4.1.Синтез грибом метаболита, аналогичного дехлорированному гидроксипроизводному атразина 987
6.4.2. Разложение атразина модельной системой 101
Выводы 102
Благодарность 105
Список литературы 106
4 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
КМЦ, КМ-целлюлоза - натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, растворимая
ДТТ - дитиотреитол
ДФИ - дихлорфенолиндофенол
ЦФБ - цитратно-фосфатный буфер
ABTS - 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)
AZCL-оксиэтил целлюлоза — сшитая оксиэтилцеллюлоза, ковалентно
модифицированная азурином
CDH, ЦЦГ — целлобиозодегидрогеназа
3-НАА - 3-оксиантраниловая кислота
GSH, GS - глутатион
FMN - флавинмононуклеотид
LiP, ЛП - лигнинпероксидаза
МпР, Мп-П - марганецпероксидаза
NADH — никотинамидадениндинуклеотид
SOD - супероксиддисмутаза
VA — вератровый спирт (вератрол)
- Влияние триазинов на почвенные грибы
- Атразин и почвенные микроорганизмы
- Методы изучения внеклеточных ферментов грибов
Введение к работе
Актуальность проблемы. В условиях возделывания монокультур невозможно обойтись без агрохимических методов повышения урожайности, в том числе применения гербицидов. Постоянный рост вносимого количества препаратов приводит к накоплению в почвах и грунтовых водах гербицидов в количествах, значительно превышающих предельно-допустимые концентрации (ПДК). Среди используемых препаратов для борьбы с сорняками, болезнями и вредителями сельскохозяйственных культур стойкие и кумулятивные гербициды представляют особую опасность. К ним относятся триазиновые гербициды (атразин, его метаболит диэтилатразин, третбутилазин и др.), остаточные количества которых обнаруживаются в почве спустя 10 и более лет после применения. По трофическим цепям эти токсичные ксенобиотики попадают в организм человека. В настоящее время обнаружены такие негативные аспекты их воздействия на биологические объекты, как мутагенный, аллергенный, канцерогенный [Лозановская И.Н., 1998]. Поэтому первоочередная задача современной стратегии охраны окружающей среды в области сельского хозяйства - постоянное снижение остаточных количеств гербицидов и возвращение в оборот загрязненных сельскохозяйственных угодий. С экологической точки зрения восстановление таких земель с помощью естественной микрофлоры является наиболее эффективным подходом.
В почвах разложение стойких ксенобиотиков осуществляется, главным образом, бактериями и почвенными грибами. По последним оценкам вклад в разложение гербицидов почвенными бактериями и грибами примерно одинаков [Ostrofsky, 2002]. Механизмы детоксикации триазиновыч гербицидов бактериями изучены весьма подробно [Wacket et al., 2002, Ralebitso et al., 2002, Головлева Л.А., 2003]. В свою очередь, разрушению триазиновых гербицидов мицелиальными грибами посвящено крайне мало работ. Известно [Мицевич и др., 2000], что видовое разнообразие
микромицетов в загрязненных почвах заметно снижается. Это позволяет говорить об адаптации отдельных видов грибов к повышенному содержанию стойких ксенобиотиков и о возможности поиска среди них перспективных видов деструкторов.
Цели и задачи исследования: Целью работы являлось изучение влияния модельного ксенобиотика атразина (2-хлор-4-(К-этил)-6-(>1-изопропил)-1,3,5-триазина), одного из наиболее распространенных триазиновых гербицидов, на мицелиальные грибы различных экологических ниш. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
выделить чистые культуры термофильных и мезофильных микромицетов, принимающих участие в процессах детоксикации ксенобиотиков в почве и поверхностных почвенных слоях;
охарактеризовать систематическую принадлежность выделенных штаммов и их физиолого-биохимические особенности;
оценить способность штаммов к деградации атразина;
изучить механизм деградации атразина мицелиальными грибами.
Влияние триазинов на почвенные грибы
Большая часть гербицидов, используемых в сельском хозяйстве, попадает в почву, где они и продукты их трансформации накапливаются и по-разному взаимодействуют с микромицетами.
Исключительное значение для оценки и мониторинга токсического действия гербицидов имеет выбор показателей и методов, характеризующих структуру и функциональное состояние почвенной микобиоты. Здесь возможны три подхода. Первый, культуральный, исследует воздействие ксенобиотиков на микромицеты в чистой культуре. В этом случае исследуемые вещества вносятся в питательные среды, и изучается их влияние на развитие микроорганизмов.
Второй подход, производственный, при выборе основных показателей исходит из «агрономической ценности» тех или иных микроорганизмов. Он достаточно условный, поскольку само понятие «агрономической ценности» весьма относительно и со временем может изменяться в соответствии с изменением технологии производства. Так, минерализация органического вещества - «агрономически ценный» процесс, но при условии полного воспроизводства гумуса и восстановления структуры почвы. В противном случае рано или поздно произойдет дегумификация почвы со всеми её отрицательными последствиями.
В основе третьего, экологического подхода лежит представление о микрофлоре почвы как части наземной экосистемы. Почвенная микрофлора имеет хорошо развитую пищевую сеть и мощный компенсационный механизм, основанный на функциональной взаимозаменяемости одних видов другими. Микроорганизмы занимают различные трофические уровни, но основной поток энергии идет через сапротрофов. Главная сторона их деятельности -минерализация и гумификация продуктов экзоосмоса и мертвого органического вещества животных и растений, попадающего в почву, тесно связана с процессами почвообразования и питания растений. [Круглов, 1991]
Следует обратить внимание на культуральный и экологический подходы при оценке воздействия ксенобиотиков на почвенные микромицеты, так первый может быть использован в качестве первичного скрининга гербицидов в отношении микроорганизмов, а второй для более полной оценки влияния на микробиоценоз в целом.
Почвенные грибы по-разному реагируют на внесение гербицида: одни из них угнетаются, другие, наоборот, стимулируются, третьи — остаются индифферентыми к такого рода воздействиям. Например, в условиях полевых опытов устойчивыми к атразину являются Penicillium nigricans, Fusarium sambiciunm [Лебедева, 1990]. Установлено, что триазиновые гербициды не влияют на численность целлюлозоразрушающих микроорганизмов [Мал иченко, 1971 Helmeczi, 1977, Lewis 1978, Simon, Bergerova 1984]. В опытах с чистыми культурами чувствительными к атразину являлись Penicillium paxili, P.vermiculatum. Ни одного случая гибели почвенных грибов при обработке триазинами, применяемыми в производственных дозах, не отмечено. Дозы триазинов, при которых отмечалось начало угнетения, очень широко варьировали для грибов различных видов - от 0,01 кг/га {Penicillium jenseni) до 100 кг/га {Trichoderma koningii). Для таких видов грибов как
Aspergillus flavus, A.fumigatus, P.vermiculatum отмечена стимуляция малыми дозами [Лебедева, 1990]. При изучении сравнительного действия однолетних и повторных применений прометрина на почвенные грибы наблюдали ингибирование численности микромицетов при 2-х и 3-кратном внесении. При повторном внесении гербицида происходили изменения в составе почвенного микробиоценоза, увеличилось число видов, способных расти при дефиците органического вещества. Это связано с тем, что при систематическом внесении гербицида уничтожение проростков сорняков вызывает уменьшение поступления энергетического материала в почву и создает дефицит легкодоступного для почвенных микромицетов органического вещества [Лебедева и др., 1990]. Ю.В.Круглов с соавторами изучали влияние гербицидов на микрофлору [Круглов, 1991]. Используя стекла обрастания, они обнаружили неоднородное распределение микрофлоры на частицах ксенобиотика. В зависимости от физико-химических свойств почвы, формы и дозы внесенного препарата, характера распределения в почве (в виде пленок, гранул, капель и т.п.) наблюдали различное действие гербицида на микробный пейзаж. Если ксенобиотик оказывает стерилизующий эффект на микрофлору, то вокруг частицы образуется стерильная зона, а далее с уменьшением концентрации начинают развиваться наиболее устойчивые формы микроорганизмов. По мере удаления от частицы препарата возрастали не только численность, но и видовой состав микрофлоры. Возможен и другой тип взаимодействия вносимых препаратов с почвенными микроорганизмами. В этом случае, как правило, частица гербицида обрастает монокультурой, которая вследствие положительного хемотаксиса первой колонизирует его. Более чувствительные микроорганизмы по-прежнему располагаются на некотором удалении от частицы препарата. Таким образом, влияние пестицидов на микрофлору носит локальный характер. Далее эти авторы исследовали влияние ксенобиотиков на изменение численности и видового состава в различных почвах, в опытах использовали производственные дозы трех пестицидов, относящихся к различным классам органических соединений, в том числе и атразин (рис. 1, .
Динамика токсического действия изучаемых препаратов на микрофлору дерново-подзолистой супесчаной почвы (рис.1) имела вид U-образной кривой: после обработки численность чувствительных микромицетов резко падала, затем постепенно восстанавливалась, то есть влияние носило обратимый характер. Это обусловлено рядом причин — неравномерностью распределения препарата в почве, детоксикациеи препарата со временем, гетерогенностью естественной популяции микроорганизмов (летальные дозы ксенобиотика для разных штаммов одного вида могут различаться в несколько раз).
Атразин и почвенные микроорганизмы
Исследования, посвященные деградации атразина бактериями были начаты еще в 60-е годы прошлого столетия, но на протяжении двадцати лет так и не были найдены организмы, способные использовать атразин в качестве единственного источника энергии [Sheets, 1970; Erickson & Lee, 1989], в то же время в почвах обнаружен целый ряд микроорганизмов, способных разлагать такие сходные по структуре с атразином соединения как циануровая кислота, меламин, циклопропилмеламин и даже дезэтилсимазин [Cook & Hutter,1981, Cook & Hutter, 1984, Cook et al, 1984; Cook et al., 1985]. Предполагалось, что трансформация атразина, в частности дехлорирование, происходит скорее химическим путем, нежели при участии микробиоты почвы [Armstrong & Chesters 1968; Li & Felbeck, 1972]. Вместе с тем, в почвах обнаруживались деалкилированные производные атразина, что предполагает наличие ферментов, способных осуществлять окислительное деалкилирование триазинов. Это предположение было подтверждено двумя независимыми научными группами в 90-х гт. XX века. Независимо друг от друга в лаборатории Беки, а также Наги с соавторами было показано, что бактерии Rhodococcus sp. продуцируют цитохром Р-450 монооксигеназу, которая катализирует реакции деалкилирования атразина [Behki & Khan, 1994; Nagy et at., 1995]. В свою очередь, атразин может подвергаться и дехлорированию атразинхлоргидролазой [Mulbry, 1994]. Так, de Souza [1998] на примере Pseudomonas sp. ADP показано, что разложение атразина происходит гидролитическим путем и включает четыре стадии: дехлорирование, N-деалкилирование, дезам инирование и распад кольца (рис. 5). Атразинхлоргидролаза превращает атразин в гидроксиатразин, гидроксиатразингидролаза гидроксиатразин - в циануровую кислоту, которая под воздействием N-изопропиламидогидролазы превращается в СО2 и NH3. Все три фермента принадлежат семейству амидогидролаз. Таким образом, детоксикация атразина микроорганизмами происходит либо путем окислительного деалкилирования под действием цитохром Р450 монооксигеназ, либо гидролитическим путем при участии гидролаз и амидогидролаз.
В середине 90-х гг. XX столетия несколько научных групп независимо друг от друга выделили ряд бактериальных микроорганизмов, использующих атразин в качестве единственного источника азота и полностью минерализующие ксенобиотик. [Radosevich et. al., 1995, Mandelbaum et al., 1995; Struthers et al., 1998; Topp et al., 2000] Выделенные микроорганизмы Pseudaminobacter sp,, Pseudomonas sp., Agrobacterium sp., Rhizobium strain PATR [Bouquard et al.1997], Agrobacterium radiobacter J14a [Struthers et al. 1998], Ralstonia picketii strain D [de Souza et al. 1998] превращали атразин в гидроксиатразин Топп сравнивал способность разлагать атразин у представителей различных родов Pseudoaminobacter sp., Nocardioides sp. и Pseudomonas sp [Topp, 2001]. Показано, что чистые культуры Pseudomonas sp. strain ADP, Pseudoaminobacter sp. strain С147 и Pseudoaminobacter sp. strain С195 полностью минерализуют атразин (используя ксенобиотик в качестве источника азота), Pseudoaminobacter sp. strain С223 превращает атразин в гидроксиатразин, Nocardioides sp. strain С190 атразин - в N-этиламмелид (рис. 5.). В свою очередь, при внесении в нестерильную почву штамма Nocardioides sp. strain С190 наблюдали минерализацию 14С меченного атразина, что свидетельствует о наличии в почве других организмов, способных потреблять атразин и его производные.
Наряду с поиском представителей естественной почвенной микрофлоры способных разлагать атразин, возможно использование и рекомбинантных штаммов, например Rhodococcus sp., способных катализировать и дехлорирование и деалкилирование атразина [Shao et.al.,1995; Strong et.al., 2000]
Суммируя вышеизложенное, следует отметить, что в настоящее время известно значительное многообразие микроорганизмов, способных вовлекать атразин в собственный метаболизм (табл.6). Это палочковидные бактерии, способные потреблять атразин в концентрациях более 1г/л, например Pseudomonas sp. A DP,
Методы изучения внеклеточных ферментов грибов
Эндоглюканазную активность качественно оценивали в плотной среде, содержащей в качестве субстрата КМ-целлюлозу (с проявлением Конго красным [Васильченко и др., 2000]). 100 мкл культуральной жидкости в разведении 1:2 соответствующим буфером вносили в лунки диаметром 8 мм в слое 2%-ного агара, содержащего 0,5% КМЦ и буфер с рН 7,2; 9 или 10,4. Чашки с КМЦ-агаром инкубировали в течение ночи при 40С, промывали 0,2 М раствором NaCl и окрашивали 0,1%-ным Конго красным. Избыток красителя удаляли последовательным промыванием 0,2 М раствором NaCl и дистиллированной водой. Показателем активности эндоглюканаз служил диаметр неокрашенных зон вокруг лунок. Активность контролировали также с использованием в качестве субстрата сшитой окрашенной AZCL-оксиэтилцеллюлозы ("MegaZyme", Австрия). 50 мкл неразбавленной культуральной жидкости вносили в лунки диаметром 5 мм на чашках с агаром, содержащим частицы оксиэтилцеллюлозы [Юлдашев и др., 1992] (0,1%), при рН 3,5; 4,5; 7,2 и 9,0. Инкубацию вели в течение ночи при 40С, определяли диаметр зон растворения частиц субстрата.
Лакказную активность определяли в плотной среде, содержащей в качестве субстрата гваякол (0,2 г/л). 100 мкл культуральной жидкости вносили в лунки диаметром 8 мм в слое 2%-ного агара, содержащего 0,1% ЦФБ с рН 6,5. Чашки инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, определяли диаметр зон окрашивания субстрата.
Активность целлобиозодегидрогеназы определяли с помощью целлобиозы (38 мкМ, Merck) и дихлорфенол индофенол а (ДФИ) (86 мкМ, Sigma) в качествет субстратов в 0,1М ЦФБ при рН 5,5. 100 мкл культуральной жидкости вносили в лунки диаметром 8 мм в слое 2%-ного агара, содержащего целлобиозу и ДФИ в 0,1% ЦФБ с рН 5,5. Чашки инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, далее определяли диаметр зон бесцвечивания субстрата.
Определение активностей ферментов в КЖ
Эндоглюканазную активность определяли вискозиметрическим методом [32] в 0,1М цитратно-фосфатном буфере (ЦФБ) при рН 5,0, используя 0,5% раствор Na-соли карбоксиметилцеллюлозы (Sigma, США) в качестве субстрата.
Активности других ферментов определяли с помощью регистрирующего спектрофотометра Спекорд М40 (Carl Zeiss, ФРГ). Активность целлобиогидролазы I определяли с помощью специфического субстрата метилумбеллиферил-Р-Б-лактозида (0,2мМ, Merck), регистрируя накопление метилумбеллиферона в 0,1М ЦФБ при рН 5,5 и длине волны 350 нм, используя разностный коэффициент экстинкции МУФ и МУФ-лактозида 1620M-W1 [Miller et al., 1998].
Активность -глюкозидазы определяли таким же образом с помощью МУФ-р-О-глюкозида (0,2мМ, Fluka) при рН 5,5, используя коэффициент экстинкции 1820 М см"1 при длине волны 350нм.
Активность целлобиозодегидрогеназы определяли с помощью целлобиозы (38 мкМ, Merck) и дихлорфенол индофенол а (ДФИ) (86 мкМ, Sigma) в ОДМ цитратно-фосфатном буфере при рН 5,5 используя коэффициент экстинкции ДФИ 6300 M"1CM" при длине волны 520 нм.
Лакказу определяли путем непрерывной регистрации продуктов окисления катехола (0,1%, Sigma) при 410 нм в 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 6,5 при комнатной температуре. За 1 усл. ед. принимали прирост А410 на 10 ед/мин,
Определение ферментов в биомассе
Мицелий в культурах гриба 6, 10, 14, 17, 21, 24, 31, 38-дневного возраста отделяли фильтрованием и взвешивали. Влажный мицелий растирали в жидком азоте, добавляя на 1 грамм мицелия 3,42 мл экстрагирующего 0,1 М
ЦФБ (рН 6,5), содержащего 1 мМ ЭДТА и 5 мМ дитиотреитол. Экстракт отделяли центрифугированием в течение 15 мин на центрифуге MPW-310 (Польша) при 18000 G и определяли активности ферментов в супернатанте. Культивирование грибов в присутствии атразина Культивирование грибов на плотной среде в присутствии атразина
Культуры выращивали на среде Чапека-Докса с глюкозой, картофельно-декстрозном агаре в течение 8-Ю сут, как в отсутствие, так и в присутствии ( 0,2; 5 или 20 мг/л) атразина. Термофильные микромицеты культивировали при 55-58С, ИНБИ 2-26(+) и ИНБИ 2-26(-) - при 28С. Среды с атразином засевали культурами, выращенными без предварительной адаптации к гербициду.
Исходные растворы атразина вносили в расплавленную среду Чапека-Докса с 1% глюкозы до конечной концентрации 0,2, 5, 20, 50,100, 200, 300 и 500 мг/л и разливали среду на чашки. В качестве посевного материала использовали культуру, выращенную на среде Чапека-Докса без атразина. Из чашки с выросшей культурой вырезали 8-мм блоки по краю колонии так, чтобы культура была одного возраста. Блоки раскладывали мицелием вниз на чашки со средами, содержащими атразин, и инкубировали при 20, 28 и 37 С в течении 35 суток.
Культивирование грибов на жидкой среде в присутствии атразина
Термофильные штаммы и мезофильные штаммы базидиомицетов и представителей сообщества ИНБИ 2-26+ и ИНБИ 2-26- культивировали на жидкой среде Чапека-Докса при 45 и 28С соответственно. Для глубинного культивирования базидиомицетов, выращенных на агаре с пептоном при 28С без адаптации к ксенобиотику, использовали среду следующего состава (г/л): пептон-3, глюкоза- 10, КН2Р04-0,4, FeS04 -0,0005, MnS04 -0,05, MgS04 - 0,5, CuS04 - 0,25. Атразин при культивировании базидиомицетов и ИНБИ 2-26+ добавляли на 3 в конечной концентрации 20 мг/л. При культивировании ИНБИ 2-26- атразин добавляли на 3 сут роста. Концентрации ксенобиотика в культуральной жидкости начинали определять сразу после внесения. Параллельно определяли содержание атразина в незасеянных колбах. Каждую серию экспериментов проводили в трех повторностях. Отобранные пробы фильтровали через мембрану Миллипор (0,45 мкм) и определяли степень разложения атразина методом ИФА и ВЭЖХ. Для выявления адсорбции атразина оставшийся на фильтре мицелий экстрагировали метанолом или этанолом, и полученные образцы также анализировали ИФА и ВЭЖХ. ИФА выполнен Е.ОЛандесман с использованием специфических антител, полученных к.х.н. А.В.Жердевым в лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н.Баха.
