Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Влияние нефтяного загрязнения на биологическую активность почвы (обзор литературы) 9
1.1. Нефтяное загрязнение почв 9
1.2. Мониторинг природных объектов загрязненных нефтяными углеводдродами 11
1.3. Абиотическая деградация нефти в почве 14
1.4. Биотическая деградация нефти в почве 15
1.5. Биотестирование и биоиндикация. Тест-объекты, используемые для оценки нефтяного загрязнения почв
1.6. Диагностика и биорекультивация нефтезагрязненных почв 27
1.6.1. Углеводородокисляющие микроорганизмы 27
1.6.2. Цианобактериально-водорослевые ценозы (альготестирование, альгоиндикация и фикоремедиация)
1.6.3. Растения (фитотестирование, фитоиндикация и фитомелиорация)
1.6.4. Зоотоксичность нефтезагрязненных почв 39
1.6.5. Ферментативная активность нефтезагрязненных почв 41
1.7. Биоремедиация нефтезагрязненных почв с использованием микробных препаратов
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 52
2.1. Материалы исследований 52
2.1.1. Экспериментальные участки (микрополевые опыты) 52
2.1.2. Модельные опыты (лабораторные эксперименты) 52
2.1.3. Характеристика использованной нефти 53
2.1.4. Характеристика биопрепарата Белвитамил (Пат. РФ №2198748) 53
2.1.5. Характеристика биопрепарата Ленойл (Пат. РФ № 2232806) 54
2.1.6. Характеристика биопрепарата Азолен (Пат. РФ № 2224791) 55
2.2. Методы исследований 55
2.2.1. Определение содержания остаточных нефтепродуктов в почве (McGill, Rowell, 1980)
2.2.2. Определение уровня фитотоксичности (ГОСТ 12039-82; ГОСТ 12039-82; ГОСТ 12039-82; Фомин, Фомин, 2001) 56
2.2.3. Определение уровня зоотоксичности (Ханисламова, 1995) 58
2.2.4. Методы изучения почвенных водорослей (Штина, Голлербах, 58
1976; Кузяхметов, Дубовик, 2001)
2.2.5. Определение ферментативной активности почвы (Хазиев, 1976, 2005)
2.2.6. Методы посева, выращивания, учета и определения микроорганизмов (Методы..., 1991; Егоров, 1976).
2.2.7. Описание структуры комплекса почвенных микроскопических грибов (Зенова, Кураков, 1988)
2.2.8. Определение длины гиф мицелия (Методы ., 1991) 62
2.2.9. Статистическая обработка данных 63
ГЛАВА 3. Изменение параметров биологической активности почв под влиянием нефтяного загрязнения
3.1. Реакция почвенных ферментов на нефтяное загрязнение почв 64
3.1.1. Каталаза 64
3.1.2. Липаза 66
3.1.3. Хитиназа 68
3.1.4. Целлюлаза 70
3.2. Динамика изменения численности микроорганизмов под действием нефтяного загрязнения почвы 72
3.2.1 Влияние нефтяного загрязнения почв на численность гетеротрофных микроорганизмов
3.2.2. Влияние нефтяного загрязнения почв на 73
углеводородокисляющие микроорганизмы
3.3. Влияние нефтяного загрязнения почвы на комплекс микроскопических грибов
3.3.1. Влияние нефтяного загрязнения на длину гиф и биомассу мицелия
3.4. Влияние нефтяного загрязнения на высшие растения 80
3.5. Использование микроартропод (Collembola) для определения зоотоксичности нефтезагрязненных почв
3.6. Влияние нефтяного загрязнения на цианобактериально- водорослевые ценозы
ГЛАВА 4. Оценка эффективности рекультивации нефтезагрязненных почв с использованием микробных препаратов
4.1. Содержание остаточных нефтепродуктов 93
4.2. Изменение активности почвенной каталазы при рекультивации 94
4.3. Влияние рекультивации на численность гетеротрофных и 95
углеводородокисляющих микроорганизмов
4.4. Влияние рекультивации на численность и видовой состав микроскопических грибов
4.5. Влияние рекультивации на фитотоксичность 101
4.6. Влияние рекультивации на зоотоксичность 103
4.7. Влияние рекультивации на цианобактериально-водорослевые ценозы
ГЛАВА 5. Коэффициент биологической активности почв 117
Заключение 125
Выводы 132
Литература 135
Приложение 169
- Мониторинг природных объектов загрязненных нефтяными углеводдродами
- Целлюлаза
- Содержание остаточных нефтепродуктов
Введение к работе
Актуальность темы. В современном обществе, зависящем от углеводородных энергоресурсов, одним из наиболее масштабных техногенных загрязнителей является нефть. Попадая в почву, нефть оказывает как прямое, так и опосредованное влияние на биологическую активность почв.*
Биотесты, используемые для оценки токсичности техногенно нарушенных почв обычно состоят из одного (Udo, Payemi, 1975; Вассер и др., 1989; Винник, 2005) или группы таксономически близких видов (Артемьева, Штина, 1985; Bierkens et al., 1998; Juvonen et al., 2000; Домрачева, 2005; Ашихмина и др., 2006; Капелькина и др., 2004, 2007; Терехова, 2007). Результаты таких тестов могут показывать значительную степень корреляции с величиной оцениваемого фактора (обычно концентрацией загрязнителя), однако не могут в полной мере отражать интегральную токсичность среды.
В связи с этим, актуальным является использование таких диагностических систем, которые позволяли бы оценить общую биологическую активность почвы по результатам совокупной реакции каждого уровня организации живой материи на стрессовый фактор.
Использование микробных препаратов является одним из наиболее экономически и экологически целесообразных методов рекультивации нефтезагрязненных почв (Алехин и др., 1998; Габбасова, 2001; Лизунов, 2002; Sasek et al., 2003; van der Gast et al., 2003). Однако при искусственном внедрении микробных комплексов в почвы с таким многокомпонентным загрязнителем как нефть, в ходе рекультивации всегда существует вероятность образования персистентных и токсичных соединений (Плешакова и др., 2007). Для испытания экологической безопасности микробных препаратов и для оценки эффективности биоаугментации необходим обобщающий критерий, который позволил бы определять
функциональное состояние почвы и ее токсичность. В качестве такого критерия может быть использован уровень биологической активности почвы.
Цель и задачи исследования. Целью исследований являлась разработка многоуровневой тест-системы для измерения биологической активности нефтезагрязненных и рекультивируемых почв, а также поиск обобщенного критерия для оценки эффективности биоаугментации с использованием микробных препаратов Азолен, Белвитамил, Ленойл.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
Изучить индивидуальные реакции каждой группы тест-объектов на внесение в почву различных концентраций нефти и рекультивацию.
Создать многоуровневую тест-систему, используя наиболее диагностически значимые реакции изученных тест-объектов.
Разработать обобщенный коэффициент биологической активности, позволяющий сравнивать почвы с разной степенью антропогенной нагрузки.
Оценить эффективность рекультивационных мероприятий в нефтезагрязненных почвах с помощью разработанного коэффициента.
Научная новизна. Впервые в многоуровневую систему биотестирования нефтезагрязненных почв включены показатели развития цианобактериально-водорослевых ценозов (ЦВЦ). Проведены тесты по наличию у микробных препаратов альготоксических свойств.
Предложен коэффициент биологической активности почв (БАП), включающий в себя уровень активности ферментов, показатели численности гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ), микроскопических грибов, водорослей и цианобактерий, степень развития высших растений и педобионтов в исследуемой почве. Получены данные об использовании коэффициента БАП для оценки эффективности рекультивационных мероприятий.
Практическая значимость работы. Разработанная
многокомпонентная тест-система позволяет получить надежные результаты при оценке характера и степени нефтяного загрязнения почвы. Ее можно
включить как составную часть в систему экологического мониторинга. Результаты исследований могут быть использованы в курсах лекций «Охрана природы», «Промышленная экология», «Экология и рациональное природопользование». Предложенный коэффициент БАП позволяет сравнивать функциональное состояние почв на разных стадиях биодеградации нефти и может служить дополнительным аргументом при выборе того или иного метода рекультивации.
Апробация. Основные положения и результаты диссертации были
представлены: на Международных конференциях и конгрессах
«Ломоносов-2004» (Москва, 2004), «Мікробні біотехнологіі» (Одесса, 2006),
«Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Казань,
2006), «Здоровье и безопасность жизнедеятельности молодежи: проблемы и
пути решения» (Уфа, 2006), «Changing Soils in a Changing World: the Soils of
Tomorrow» (Palermo, 2007), «Биологическая рекультивация и мониторинг
нарушенных земель» (Екатеринбург, 2007), «Экология и биология почв»
(Ростов-на-Дону, 2007), «Мировые инновационные технологии
восстановления нарушенных и загрязненных земель техногенных регионов»
(Кемерово, 2008), на Всероссийских конференциях и съездах «VI, VII
Докучаевские молодежные чтения» (Санкт-Петербург, 2003, 2004),
«Проблемы геоэкологии Южного Урала» (Оренбург, 2005), «Биотехнология-
2005» (Пущино, 2005), «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2006),
«Техносферная безопасность, надежность, качество, энерго- и
ресурсосбережение» (Ростов-на-Дону, 2006), «Альгологические
исследования: современное состояние и перспективы на будущее» (Уфа, 2006), «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга» (Киров, 2006, 2007), «Фундаментальные достижения в почвоведении, экологии, сельском хозяйстве на пути к инновациям» (Москва, 2008), «Проблемы экологии в современном мире» (Тамбов, 2007, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах списка ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы (336 наименования, в том числе 124 на иностранных языках) и приложения. Текст диссертации изложен на 169 страницах, рисунков 20, таблиц 13.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность и благодарность научным руководителям: доктору биологических наук, профессору Н.А. Киреевой и доктору биологических наук, профессору И.Е. Дубовик, за неоценимую помощь, оказанную при выполнении данной работы, профессору О.Н. Логинову, за предоставленные биопрепараты, а также всем коллегам и соавторам публикаций.
Мониторинг природных объектов загрязненных нефтяными углеводдродами
Для оценки последствий тех аварий, которых не удалось избежать, и для наблюдения за рекультивируемыми почвами необходим мониторинг -система многолетних сопряженных наблюдений, контроля, экспериментов, оценки, краткосрочного прогноза и определения долгосрочных тенденций, направленных на охрану почв и окружающей среды.
В практике экологического мониторинга загрязненных нефтью территорий используются различные показатели для оценки степени воздействия и скорости самоочищения экосистем и почв по изменению: состояния растительности, численности, биомассы и видового состава различных групп почвообитающих беспозвоночных животных, общей биомассы, группового состава и уровня метаболической активности почвенного микробоценоза.
Большинство исследователей (Исмаилов, Пиковский, 1988; Иларионов, 2004) выделяет в процессе самоочищения нефтезагрязненных почв три этапа. Первый длится 1-1,5 года. Спустя несколько дней после нефтяного загрязнения почвенная биота значительно подавлена. Затем численность определенных групп микроорганизмов, в частности углеводородокисляющих бактерий, повышается. Максимальное их содержание приходится на первые полгода после загрязнения и остается выше фоновых значений почти 2 года. В состав пионерного нефтеокисляющего биоценоза наряду с углеводородокисляющими бактериями входят некоторые группы грибов и цианобактерии.
Второй этап процесса самоочищения длится 3—4 года. К этому времени количество остаточной нефти в почве снижается до 8—10 % от исходного уровня. Этот этап деградации нефти в почве характеризуется, главным образом, микробиологическими процессами трансформации углеводородов. Доминирующее положение в комплексе почвенных микроорганизмов на этом этапе занимают актиномицеты и микроскопические грибы. Происходит увеличение общей численности различных групп микроорганизмов, в особенности грибов, актиномицетов, споровых и неспоровых бактерий.
Начало третьего этапа определяется по исчезновению в остаточной нефти исходных и вторичных парафиновых углеводородов. В это время в почве продолжают оставаться полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), характеризующиеся стойкостью к микробиологическому расщеплению.
Самоочищение экосистем, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, это стадийный биогеохимический процесс трансформации загрязняющих веществ, сопряженный с процессом восстановления биоценоза. В результате биотических взаимодействий происходит биотрансформация физико-химических форм загрязнений и их разрушение в процессе биохимического окисления. Для различных природных зон длительность отдельных стадий этих процессов различна, что связано в основном с водно-почвенно-климатическими условиями. Важную роль играют и состав нефти, наличие сопутствующих солей, начальная концентрация загрязняющих веществ (Исмаилов, Пиковский, 1988).
Сегодня становится очевидно, что адекватное понимание функционирования почвы возможно лишь при всестороннем учете жизнедеятельности почвенной биоты. К тому же, наличие в почве «избыточных» микробной биомассы и избыточного видового разнообразия микроорганизмов, является, по-видимому, одной из главных причин устойчивости почвы к неблагоприятным воздействиям.
Биологические показатели, используемые в биомониторинге, подразделяются на следующие группы:
1- функциональные - продуктивность, дыхание, скорость обмена, скорость фотосинтеза и т.д.
2- структурные - число видов и особей, количество биомассы, размер, массы особей и т.п.
3- структурно-морфологические (экологические) - изменения активности, питания, патологии, нарушения гомеостаза.
Знание актуальной (в данный момент) токсичности почвенного покрова определенной территории и последующее наблюдение за ее изменением позволяет.
Целлюлаза
Непрерывное разложение растительных материалов происходит под действием микроорганизмов различных таксономических групп, аэробных и анаэробных грибов и бактерий. Основными продуцентами целлюлаз являются грибы следующих родов: Aspergillus, Coriolus, Eupenicillium, Fusarium, Penicillium, Phanerochaete, Physarium, Sporotrichum, Trichoderma, Verticillium и др. Так как целлюлозоразрушающие микроорганизмы, являющиеся специфическими продуцентами целлюлаз, очень чутко реагируют на нефтяное загрязнение и длительное время после контаминации находятся в угнетенном состоянии, было сделано предположение, что активность почвенной целлюлазы тоже может служить индикатором состояния почв. Нами были проведены эксперименты по оценке целлюлазной активности почв с различным нефтяным загрязнением аппликационными методами. На рис. 5 представлены величины активности целлюлазы в пробах с давностью загрязнения 1 и 12 месяцев и продолжительностью экспозиции 20, 40 и 60 суток.
Как видно из рисунка, по истечении одного месяца с момента загрязнения активность целлюлазы находилась в угнетенном состоянии, пропорционально концентрации нефти. Спустя 12 месяцев во всех образцах почв, загрязненных нефтью активность исследуемого фермента была выше чем в контроле, причем наивысшие показатели наблюдались в образцах со средним загрязнением (4%). Далее в порядке убывание целлюлазной активности были образцы с умеренно сильным (8%), слабым (1%) загрязнением и контрольного варианта.
В результате проведенных экспериментов, в комплексную тест-систему нами было решено включить фермент каталазу, диагностическая значимость которого оказалась важным и достоверным инструментом, и по ряду показателей зарекомендовала себя как в лабораторных, так и в полевых условиях. Липолитическая активность стала еще одним важным объектом мониторинга нефтезагрязненных почв. Значения липазной активности достаточно легко диагностируются в лаборатории и дополняют данные по каталазе (исследованиями показано, что малые и средние концентрации нефти ингибируют активность каталазы, но стимулируют активность липазы).
Параметры активности ферментов хитиназы и целлюлазы в тест-систему было решено не включать, так как, несмотря на достаточно убедительные результаты и неоспоримый потенциал применения этих ферментов в диагностических целях, в работе с ними мы встретились с некоторыми трудностями. Использованные нами методики определения активности этих ферментов требовали длительных периодов инкубации и экспозиции, и позволяли получить результаты не ранее чем через две недели после начала эксперимента. В нашем стремлении создать комплексную экспресс-систему оценки биологической активности почв одним из приоритетов была минимизация эффективного времени ее использования для получения быстрого результата в тех случаях, когда от него зависит дальнейшая стратегия рекультивационного планирования.
Содержание остаточных нефтепродуктов
Ускорение процесса биодеградации углеводородов нефти происходит за счет увеличения доступа воздуха внесением минеральных и органических удобрений, посева специально подобранных смесей злаковых и бобовых культур в сочетании с необходимыми агротехническими приемами обработки почв. Инокуляция нефтеокисляющими микроорганизмами в сочетании с вышеназванными действиями является наиболее перспективным и результативным способом ускорения восстановления нарушенных территорий. Бактериальные препараты, рекомендуемые и применяемые для биоремедиации, могут включать монокультуры или специальные сочетания микроорганизмов, обладающие высоко выраженной окисляющей активностью в отношении углеводородов нефти прямой, разветвленной и циклической структуры.
Изучив закономерности изменения показателей биологической активности почв вследствие нефтяного загрязнения мы решили использовать многоуровневую систему, включающую весь арсенал описанных биотестов для оценки эффективности биорекультивационных мероприятий. Были изучены три метода биоаугментации с использованием микробных препаратов Ленойл, Азолен и Белвитамил. Эффективность восстановления почв, обработанных этими препаратами, оценивалась отдельно по каждому из изучаемых параметров и сравнивалась с аналогичными значениями фоновой почвы и почвы загрязненной нефтью без обработки препаратом. Для суммарной оценки состояния исследуемой почвы был разработан коэффициент биологической активности почв (БАП).
Серьезную экологическую опасность представляет использование для биоремедиации микроорганизмов, которые могут быть патогенными для человека или обусловливать образование токсических и мутагенных соединений в результате, например, неполного окисления поллютанта. Исследования показывают, что катаболические реакции, осуществляемые бактериями и грибами при разложении нефти, могут превращать нефть в более или менее токсичные и мутагенные метаболиты. Весьма нежелательно, чтобы биоремедиация оказывала отрицательное влияние на биоразнообразие. Таким образом, одной из главных целей испытаний технологий биоремедиации должна быть проверка их биобезопасности.
