Новые свойства углеводсвязывающих белков: лектина из мидии Crenomytilus grayanus и галектина-3 человека Фуртак Вячеслав Анатольевич

Содержание к диссертации

Стр.

5 Список сокращений

Благодарности 7

Введение 8

1. Обзор литературы. Галактозоспецифичные лектины как 10

активные вещества, узнающие различные углеводные структуры

в гликоконъюгатах

1. Углеводные структуры, содержащие галактозу в гликонъгогатах 10

2. Связывание различных гликоформ лектинами 15

3. Характеристика Gal/GalNAc - специфичного лектина из мидии 21 Crenomytilus grayanus (CGL)

1 .4. Муцины в аденокарциномах толстой кишки человека 29

5. Нейрональные Gal/GaINAc-содержащие гликонъюгаты как 35 маркеры в спинномозговых ганглиях крыс

6. Галектин-3 в межклеточном матриксе 37

1. Общая характеристика галектина-3 человека 37

2. Аффинность связывания галектином-3 различных 41 углеводных остатков

3. Рецепторы (лиганды) галектина-3 на клеточной поверхности 44 и в межклеточном пространстве

4. Роль галектина-3 в органогенезе и ангиогенезе 47

5. Галектин-3 и эндоцитоз/экзоцитоз 48

6. Галектин-3 и клеточная адгезия 50

1.7. Заключение 53
2. Материалы и методы 54

7. Объекты исследования 54

8. Реактивы и реагенты 54

9. Аналитические методы 55 2.3.1. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 55

2. Вестерн-блоттинг 56

3. Определение концентрации белка 57 23 А. Гемагглютинационный тест активности пектинов 57

2.4. Окрашивание гистологических препаратов по Шиффу и 57

альциановым синим

2.5. Окрашивание тканевых и клеточных препаратов лектинами 59

1. Приготовление гистологических препаратов 59

2. Получение конъюгата CGL с пероксидазой хрена 60

3. Окрашивание препаратов конъгогатами лектинов 61

2.6. Получение рекомбинантного галектина-З 64

4. Клонирование белка 64

5. Экспрессия рекомбинантных белков 68

6. Аффинная хроматография белков на Ni-агарозе 69

7. Получение конъюгата белков с флюоресцентной меткой 70

8. Получение галектина-3 без гистидиновой (6 HisTag) метки 71

7. Анализ эндоцитоза Рі-интегринов на флюоресцентном 71 сортировщике клеток (FACS)

8. Флюоресцентный анализ эндоцитоза галектина-3 , CGL и Pi- 72 интегринов

2.9. Влияние галектина-3 и CGL на адгезивность клеток карциномы 74

молочной железы

3. Результаты и обсуждение 75

1. Морфологическая характеристика аденокарцином толстой 75 кишки человека

2. Рецепторы CGL в толстой, тонкой кишке человека и крысы 83

3. Гистопатология рецепторов CGL в опухолях толстой кишки 91 человека

4. Рецепторы CGL в спинномозговых ганглиях крыс 104

5. Клонирование и очистка рекомбинантных белков 111

6. Эндоцитоз рі-интегринов и галектина-3 клетками карциномы 112 молочной железы

7. Влияние экзогенного галектина-3 на микрофиламенты и 116 распластывание клеток

8. Эндоцитоз CGL клетками карциномы молочной железы не 120 меняет их адгезивность

3.9. Модель регуляции клеточной адгезии галектином-3 и CGL 121
Выводы 124
Заключение 125
Список литературы 126

Список сокращений

CGL - лектин из мидии Crenomytilus grayanus
НРА - лектин белковой железы улитки Helix pomatia
* PNA- лектин арахиса Arachis hypogaea

GS-ІВд -лектин Griffonia simplicifolia SNA - лектин Sambucus nigra DBA - лектин Dolichos bijlorus D-Gal - D-галактоза D-GalNAc - 1\Г-ацетил-0-галактозамин

* D-Glc - D-глюкоза
L-Fuc - L - фукоза
D-Tal - D - талоза
Mel - мелибиоза
Lac - лактоза

Sue - сукроза

* GIcNAc - N-auenin-D- глюкозамин
NeuAc - N-ацетилнейраминовая кислота
Me-O-a-D-Galp - метил-а-О-галактопиранозид
p - пиранозид, f - фуранозид

БСА - бычий сывороточный альбумин BSM - муцин подъязычной железы быка

* ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ТБС - трисовый буфер солевой
мкг - микрограмм

мкл - микролитр

мкМ - микромолярный

нм - нанометр

нг - нанограмм

CRD - углеводсвязывающий домен галектина-3

ЕСМ - экстрацеллюлярный (межклеточный) матрикс

ПЦР - полимеразно-цепная реакция кДНК - кодирующая ДНК мРНК - матричная РНК 6HisTag - метка из 6 гистидинов

Ras - онкоген и продукт его экспрессии

Вс1-2 - митохондриальный антиапоптотический фактор

NWGR - аминокислотная последовательность ВН1 домена Вс1-2

Вах - белок X (дерепрессор апоптоза), ассоциировнный с Вс1-2

FcgR II - рецептор Fc фрагмента IgG

EGF - эпидермальный фактор роста

OD - оптическая плотность

FITC - флюоресцеинизотиоционат

FACS - флюоресцентный сортировщик клеток

ИФА - иммуноферментный анализ

THGP - гликопротеин Tamm-Horsfall

ЛПС - липополисахарид

DNTP - динуклеотидтрифосфат

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность коллективу лаборатории

# химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН, который обеспечил
работу с CGL, сотрудникам патологоанатомического отделения Краевой
клинической больницы, предоставившим операционный материал
аденокарцином толстой кишки человека. Особо признателен д-ру Josiah
Ochieng, профессору Meharry Medical College (Nashville, TN, USA) и
коллективу его лаборатории за помощь в работе по изучению галектина-3

* человека, службе технической поддержки компании Qiagen за консультации
по клонированию галектина-3.

Введение к работе

Несмотря на значительные успехи здравоохранения и медицины, среди различных заболеваний ведущее место занимают онкологические болезни. По количеству погибших рак занимает второе место после инфарктов и инсультов. Более половины злокачественных опухолей удается успешно лечить, однако по-прежнему остаются нерешенными проблемы лечения рака молочной железы и рака толстой кишки. Методы ранней диагностики и лечения этих заболеваний крайне неудовлетворительны.

Особый интерес представляют исследования специфических изменений клеточных рецепторов при онкотрансформации. Исследование функций гликоконъюгатов, как составной части клеточных рецепторов, убедительно продемонстрировали ключевую роль углеводной составляющей при опухолевом процессе. В настоящее время наметились два подхода для выявления углеводного профиля гликопротеинов - это использование моноклональных антител к углеводным детерминантам и углеводовязывающих белков - лектинов, специфичных к определенным углеводным .структурам.

В ряде работ показана ценность лектинов животного и растительного происхождения как цитологических маркеров. Отличием нашего подхода является изучение сравнительно недавно открытого и полученного в очищенном виде Gal/GalNAc-специфичного лектина из мидии Crenomytilus grayanus как маркера нормальных и трансформированных клеток. Особенность этого лектина заключается в избирательном связывании углеводных цепей О-типа, характерных для гликопротеинов муцинового типа, которые секретируются эпителиальными клетками.

Вторая часть работы посвящена исследованию роли галектина-3 человека в межклеточном матриксе. Клетки многих злокачественных опухолей интенсивно экспрессируют и секретируют галектин-З. Одним из примеров аберрантного гликозилирования белков можно считать появление полилактозаминных углеводных цепей в Рі-интегринах за счет

специфической активации гликозилтрансфераз. Благодаря этому они приобретают способность реагировать с галектином-3 в межклеточном матриксе. Основная гипотеза состоит в том, что галектин-3 межклеточного матрикса при взаимодействии с (Зі-интегринами клеточной поверхности инициирует их эндоцитоз внутрь клетки. В результате этого клетки линий карциномы молочной железы человека теряют способность адгезировать и распластываться на белках межклеточного матрикса, что может быть одним из механизмов метастазирования.

Таким образом, лектины как маркеры позволяют обнаружить те или иные углеводные структуры в клетках и тканях, а лектины в модели клеточной адгезии дают возможность определить, какую функцию могут выполнять эти структуры.

Целью данной работы является изучение локализации лигандов Gal/GalNAc специфичного лектина из мидии Crenomylilus grayanus (CGL) на гистологических препаратах нормальных и трансформированных тканей толстой кишки, а также в спинномозговых ганглиях крыс, определение роли связывания Рі-интегринов с галектином-3 и CGL в адгезии клеток линий « карциномы молочной железы человека. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить гистологические препараты нормального и
трансформированного эпителия толстой кишки человека, окрашенные
пероксидазным конъюгатом CGL. Определить характер окрашивания
связанный с онкотрансформацией.

2. Определить возможность применения CGL для выявления нейронов типа Б спинномозговых ганглиев крыс.

3. Выделить и очистить рекомбинантный галектин-3 человека.

4. Установить характер воздействия экзогенно добавленного галектина-3
и CGL на адгезию клеточных линий карциномы молочной железы человека.

1. Обзор литературы

Галактоз осп ецифичныс лектины как активные вещества, узнающие

различные углеводные структуры в гликоконъюгатах

1.1. Углеводные структуры, содержащие галактозу в гликонъюгатах

Структура углеводных единиц (детерминант лектинов) представлены в табл. 1. Они широко распространены в гликопротеинах млекопитающих и также были обнаружены в гликосфинголипидах (Hakamori et al., 1981; Hakamori et al., 1986; Wu, 1988; Wu, 1994; Wu, 1995; Wu, 2001). 0- аномеры L, F и T единиц присутствуют только в гликосфинголипидах, тогда как Lp" и Гф структуры образуют кор антигенов групп крови А, В, Н, Le^a, Le^b. В семействе ганглиозидов 4 единицы (L_p, ІГр, Тр и Р«) представляют 78% от общего содержания углеводов в гликосфинголипидах (Stults et al., 1989; Wu 2002).

В последнее время большое количество различных гликопротеинов от простейших О-гликанов до антигенов групп крови использовали для изучения связывающей активности лектинов (Негр et al., 1988; Негр et al., 1979; Wu, 1988; Wu, 1979; Wu, 1992; Wu, 1994; Wu, 1995; Wu, 1997;. Wu, 2001,). В этих исследованиях также были использованы бактериальные полисахариды с гомогенными гликотопами (Krause, Maccarthy, 1962). Природные Тп гликопротеин и асиалогликопротеин подчелюстных желез броненосца {Dasypus novemcinctus), асиалогликопротеин подчелюстных желез хомячка (рис. 1) (Wu, 1994; Wu, 1995) - идеальные реагенты для изучения Tn-специфичных лектинов и моноклональных антител. Овечий гликопротеин слюны можно использовать как источник сиалированного Тп-антигена (Неф et al., 1979). Активные и инактивированные антифризные гликопротеины построенные из повторяющихся единиц дигликозил-трипептида (Tal-»Thr-Ala-Ala_s рис. 4) (DeVries et al., 1970; Lin et al., 1972) -уникальные реагенты для изучения связывания Т-специфичных лектинов (Wu, 1988).

Таблица 1. Углеводные структурные единицы гликопротеинов и гликосфинголипидов млекопитающих (Wu, 2002).

P: аномер сахара; m: мультнвалентность.

#

GalNAcaWSeriThr

I , 1

Tn Природный гликопротеин подчелюстных желез броненосца (Tn) (Wu, 1994).

GalNAcal->Sci/nir (65%)

I , 1

Neu5Aca2-+6GaINAcal-+Ser/Thr (35%)
I , 1

Гликопротеин А подчелгостных желез броненосца (2/3 Tn и 1/3 сиалил Tn) (Wu, 1979,
* Wu, 1995).

GalNAcal— Ser/Thr

1 , 1

Гликопротеин подчелюстных желез хомячка (Тп) (Wu, 1998).

Основной: GalNAcal -»Ser/Thr (>75Уе)

I , 1

Другие: Galp1-*3GalNAcctl—Ser/rhr
і , 1

GIcNAc

4- pi, 6 (GlcNAcpi-6T₀)

Caipi— 3GaINAeaWSermir
I , 1

(%l-»6T_a)

ipi.4 -GIcNAc

Api.6

Gaipi— 3GaINAca1-»Ser/Thr

Овечий асиалогликопротеин подчелюстных желез (более 75% Тп) (Неф et аі., 1979).

Рис. 1. Структурные углеводные единицы гликопротеинов слюны.

-Ala-AIa-Thr Таї Galppl-OGalNAc

Рис. 2. Структурные единицы активных и инактивированных антифризных гликопротеинов из антарктической рыбы Trematomus borchgrevinki построены из повторяющихся единиц дигликозил-три пептида с Т_а- боковой углеводной цепью (DeVries et al.,1970; Lin et al., 1972).

Другие гликаны, такие как асиалогликопротеин слюнных желез свиньи, содержит 3 лектиновые детерминанты - углеводные структуры А, Т и Тп (Неф et а!., 1988), си-кислый гликопротеин человека имеет ди- и тетраантенные единицы II в боковых углеводных цепях (рис. 3) (Fournet et al., 1978; Schmid et al., 1979), фетуин после слабого кислотного гидролиза содержит детерминанты Т и I/II (рис.4) (Nilsson et al., 1979; Spiro, Bhoyroo, 1979), гликофорин эритроцитов человека содержит структурные единицы Т_а и Тп (рис. 5) (Schauer, 1988), полисахарид XIV типа пневмококков (Pneumococcus) характеризуются поли-П остатками (рис. 6) (Linberg et al., 1977; Wu, 1995). Полисахарид Streptococcus группы С имеет в своем составе гликотопы GalNAcod~-> (Krause, Maccarthy, 1962). Многие гликопротеины, полученные из кисты яичников человека, и продукты их деградации по Смиту были отобраны для исследования реакционных способностей лектинов (Wu, 1988), Углеводные цепи этих гликопротеинов связаны О-гликозидной связью через GalNAc с серином и треонином белкового кора. Внутренняя часть углеводной цепи варьирует по количеству моносахаридов от 1 до 12. Большинство детерминант, проявляющих активность с лектинами, находятся на нередуцирующем конце боковых углеводных цепей.

CF

щ ^LFuc ,—і—, ial,3

Gaipi—4GlcNAc

1 4ЭЬ4

Gaip 1 —4GIcNAcP1 —2Man

|al, 3 [

it ManpJ—4GlcNAcpl—4GlcNAcpi->Asn
t«l,6 ' » |

Gaip 1 -HGIcNAcp 1 ->2Man

Gaipi-*4GlcNAc

№ углеводной «ели 1

Рис. 3. Структура асиало-ai-кислого гликопротеина плазмы крови человека. Первичная структура классов А, В, BF, С и CF углеводных единиц участков гликозилирования (Fournet et al> 1978; Schmid et al., 1979). Углеводные единицы этого асиалогликопротеина сгруппированы в соединения с биантенной (класс А), триантенной (класс В) без фукозы и с фукозой (класс BF или CF). С - хитобиоза.

Gal IP1,

JAcJ П

GlcNAc .

lpl.6

Gaip I ->3GalNAcct I—Ser /Thr

Gaip 1 -»3GalNAca 1 -+ Ser I Thr,

I ' 1

Gaipi-*4(3) GlcNAc

4pi,4 Gaip 1 -*4GJcNAep 1 — 2Mana 1 ->3Manp l—4GlcNAcp 1 -*4GlcNAcP 1 -N-Asn

Пр Таї, 6

Gaip 1 -»4GIcNAcp 1 ->2Man
і , і

Рис. 4. Триантенные структурные единицы ТІ и Т углеводов асиалофетуина. Он содержит 3 боковых олигосахарида с 2 различными структурами, О-гликозидно-связанных с Ser или Thr белкового кора (№ 1, 2), углеводные боковые цепи N-гликозидно-связаны с аспарагином (№ 3) (Nilsson et al., 1979). С - хитобиоза.

I ' 1

Gaipi—30alNAoal— Ser/ГЬг

fa2,3 \a2,6 NeuAc NeuAc

(Дисиалил Тцц іфипто Т_ц) Гликофорин человека природный (Schauer, 1988).

_. _n

Gajpi-»3GalNAcal-+Ser/Thr

Крипто-Tn

Асиалогликофорин

GaINAcal-*Ser/Thr

І , 1

Тп-гликофорин

Рис. 5. Углеводные структуры гликофорина человека (Schauer, 1988). Эта группа мембранных гликопротеинов эритроцитов человека содержит углеводы составляющие 30-45% от общего количесво углеводов в эритроцитах.'

-6GlcNAcpi — 3Gaipi-4Glcpi-ТР1.4 Gal

Рис. 6. Повторяющаяся структурная единица XIV типа полисахаридов Pneumococcus (Linberg et al., 1977). Последовательность GalBl—>4GlcNAc (ПВ) обеспечивает связывание с лектинами.

1.2. Связывание различных гликоформ лектинами

Способность лектинов связывать различные вещества можно проанализировать ингибированием реакции. Однако факторы, оказывающие влияние на это взаимодействие, не ограничиваются свойствами участка

16 связывания лектина и гликотопа гликоформы. Эти факторы также включают в себя воздействие других частей молекул. Следовательно, изучение характера взаимодействия лектинов с разными хорошо охарактеризованными гликопротеинами, гликосфинголипидами и полисахаридами может служить источником информации о необходимых условиях взаимодействия. Пол ивалентн ость, растворимость, стерические факторы, заряд, рН, температура и т.д. могут влиять на связывание. Взаимодействие лектинов с гликоформами изучают методом количественной преципитации и ее ингибирования (Wu, 1992; Wu, 1997), разновидностями ИФА (Wu, 2000). Эти методы позволяют получить данные о количестве участков связывания молекул, аффинности и специфичности (Duk et al., 1994). Углеводную специфичность Gal/GalNAc активных лектинов классифицируют в соответствии со степенью аффинности к структурным единицам углеводов (табл. 2).

Сходство связывания гликопротеинов этими лектинами можно использовать в выборе оптимальной панели лектинов для глико- и гистохимических исследований. Реактивность углеводных детерминант лектинов (дисахаридов, связываемых лектинами) представляет характеристику аффинности связывания двух индивидуальных Сахаров в комбинации.

Для классификации выделены 8 типов взаимодействий лектинов с гликоформами:

1. Природный Тп-гликопротеин слюнных желез броненосца (рис. 1) (Wu, 1994) преципитирует многие Тп и Тп/Т специфичные лектины из Madura pomifera (МРА), Artocarpus integrifolia (AIL), Codium fragile subsp. tomentosoides (CFT) и Vicia Villom B₄ (VVL-B₄). Он также взаимодействует с GaINAcccl-> специфичными лектинами из Griffoma (Bandeiraea) simplicifolia-Аа (GSI-A4), Griffoma (Bandeiraea) simplicifolia-B₄ (GSI-B₄), НРА и WFA, но очень слабо с агглютининами из Ricinus communis (RCAi), Abrus precatorim (АРА), Triticum vulgaris (WGA) и Arachis hypogaea (PNA).

Таблица 2. Классификация Gal/GalNAc-специфичных лекгинов по способности связывать структурные углеводные единицы (Wu, 2003).

Таблица 2, Продолжение

^а3амена Fucal->2 на субтерминальнугої Gal уменьшает связыание. ^bSЗамена Fucal-^2 на субтерминальную Gal блокирует связывание. ^СС, хитобиоза дисахарид, mil, мультивалентный II.

2. Сывороточные гликопротеины антарктической рыбы Trematomus

borchgrevinki богаты поли-Т_а (Galpl—^3GalNAcal—>Thr) структурными т

единицами (рис. 2) (DeVries et аі., 1970; Lin et al., 1972). Активные

антифризные гликопротеины хорошо взаимодействуют с Т-специфичными

лектинами PNA, MP А, В РА и CFT, но очень слабо с другими лектинами

(табл. 2) (Wu, 1988). Этот гликопротеин характеризуется наибольшей

гомогенностью по содержанию Т-структур, благодаря чему его используют

для изучения Т-активности пектинов и антител.

3. Поли Up (Galpl—*4GlcNAcpl—») остатки в капсулярном полисахариде
Pneumococcus XIV типа (рис. 6) (Linberg et al, 1977) содержат боковые
Galp(l—>4)-связанные с GlcNAc кора. Он проявляет сильное взаимодействие
с II активными лектинами RCA], GCL, и ВРА, но слабо реагирует с другими
лектинами (табл. 2).

р 4. Полисахариды группы С клеточной стенки Streptococcus имеют в

своем составе углеводные единицы GalNAcal— (Kraiise, Maccarthy, 3962) и

хорошо взаимодействуют с F/A-активными лектинами CFT, DBA, НАА и WFA, но слабо реагируют с Т, I/II или Тп-специфичными лектинами (табл. 2).

5. Ди- и тетраантенные II (GalpI —*4GIcNAc) структуры присутствуют в
4 оц - кислом гликопротеине (рис. 3) (Fournet et al., 1978; Schmid et al., 1979),

хорошо взаимодействуют с П-активными лектинами RCAi, ВРА, WFA и АРА, но не с DBL, HPL, PNA и VVL-B₄ (табл. 2).

6. Мультиантенные П/Т-остатки входят в состав углеводных цепей
асилофетуина (рис. 4) (Nilsson et al., 1979). Этот гликопротеин имеет в своем
составе 3 углеводные цепи с 2 различными структурами О-

а гликозидносвязанными с Ser и Thr белкового кора и три-П и -I/II смешанные

структуры N-гликозидно связанные с аспарагином белкового кора. Асиалофетуин хорошо взаимодействует с мульти ПЯ- и Т-специфичными лектинами RCAi, АРА, ВРА и AIA, но не с VVL-B₄ (табл. 2).

7. GalNAcpl—4Galpl-> (Sp) и Galpl-»4GIcNAc (П_р) гликотопы в
гликопротеине Tamm-Horsfall Sd (а+) мочи (THGP) (Hard et al., 1992) и

* асиало-THGP проявляют наибольшую активность в отношении АРА (Wu,

1995). Они также реагируют с GalNAcp^- и Ga1pl->4GlcNAcP (II)-активными лектинами Wistaria Jloribunda (WFA), Glycine max (SBА) и RCA], но слабо взаимодействуют со всеми a-GalNAc (А/Тп)-специфичными лектинами - Helix pomatia (HPA), Phaseolus lunatus (LBL) и Madura pomifera (MPL).

8. Антигены групп крови человека АВН и її имеют сходство с А, В, Т/ІТ-
активными дисахаридными единицами из секрета кисты яичников (Wu, 1988).
Гликопротеины кисты яичников человека и их продукты кислотного
гидролиза - важные источники A/Ah, B/B_h, I, IT, Т и Тп гликотопов. На основе
ингибирования связывания DBA, HPA и WFA были классифицированы как
F/A (GalNАсаl-+3GalNAc/Ga!NАса 1—>3Gal) специфичные лектины (Wu,
2001).

Активные гликопротены группы крови А преципитировали до 90 % добавленного DBA, но после деградации по Смиту этой реакции не

наблюдали, что можно объяснить тем, что для связывания DBA необходимы терминальные остатки GalNAcocI—> . WFA и НРА также взаимодействовали с гликопротеином группы крови А, но в отличие от DBA, продукты гидролиза по Смиту тоже проявляли активность. Следовательно, поливалентность І/ЇЇ и Tn-структурных единиц может оказывать влияние на связывание лектинов.

PNA, MP А, ВРА и RCA₂ (рицин) составляют группу Т-специфичных лектинов. Однако их свойства отличаются. Антиген группы крови А не преципитировал PNA, тогда как продукты деградации по Смиту полностью преципитировали лектин. Гликопротеин А также слабо реагировал с МРА и ВРА, но продукты его деградации по Смиту показали значительное увеличение активности и преципитировали более 90% лектина. Увеличение активности PNA, МРА и ВРА означает, что лектиновые детерминанты были закрыты или длинные олигсахаридные цепи создавали стерическое препятствие для взаимодействия, a GalNAcal— или LFucal—+ связанные остатки были удалены после деградации по Смиту.

RCAj классифицирован как 1Л1-специфичный лектин. Гликопротеин А и продукты деградации по Смиту полностью преципитировали лектин, следовательно RCA| способен связвать внутренние 1/П-гликотопы.

Таким образом, были выделены 11 групп GaI/GaINAc-специфичных лектинов (табл. 2) в соответствии с их тонкой углеводной специфичностью. Однако каждый лектин даже в составе одной группы обладает индивидуальными отличиями по аффинности к различным углеводным единицам. Поэтому часто обнаруживают отдельные лектины, способные маркировать те или иные клеточные структуры. Причем, даже очень близкие по специфичности лектины могут не давать реакции. Сам факт специфичного связывания леюгина с компонентами ткани или клеток рассматривают как результат случайной комплементарности углеводной структуры с чужеродными по источнику углеводсвязывающими белками. Заранее

предсказать свойства лектина как маркера компонентов клеток и тканей невозможно.

Однако исходя из общеизвестных фактов аффинности к тем или иным углеводным структурам можно предполагать позитивную реакцию. Очевидно, что лектины могут маркировать компоненты эндоплазматической сети и аппарата Гольджи, где происходит гликозилирование, т.е. ковалентное присоединение галактозы к синтезируемым олигосахаридам. Кроме этого, возможно реакция с поверхностным глико кал иксом клетки, который также богат гликопротеинами, и, наконец, разнообразные клеточные секреты также часто содержат мукоидные вещества, богатые углеводными структурами. Межклеточный матрикс характеризуется присутствием различных углеводных структур в составе коллагеновых и эластиновых волокон, базальных мембран, которые также могут давать реакцию с Gal/GalNAc-специфичным лектинами.

1.3. Характеристика Gal/GalNAc - специфичного лектина из мидии Crenomytilus grayanus (CGL)

Галактозоспецифичный лектин (Л1) впервые был обнаружен в целомоцитах и целомической жидкости мидии Crenomytilus grayanus. Впоследствии его выделили на гранулированной агарозе, применяя для элюции 0,1 М Gly-HCI, рН 2,5 (Лоенко, 1999). В серии тестов по выявлению преципитиругощеи активности этого лектина особый интерес представляет наличие специфичности к раково-эмбриональному антигену. Л1 также специфично связывал грамположительные бактерии, что позволяет предполагать его функцию в регуляции таксономического состава микробиального комплекса двустворчатых моллюсков (Лоенко, 1999).

Другой галактозоспецифичный лектин из мидии Crenomytilus grayanus (CGL), иммунохимически родственный Л1, получен из целомической жидкости аффинной хроматографией на сефарозе, обработанной кислотой.

Для элюции использовали 0,2 М галактозу (Belogortseva et at, 1998). В отличие от большинства других лектинов морских беспозвоночных, CGL не относится к С-типу, поскольку для реакции связывания не требуются ионы кальция и магния (Belogortseva et al, 1998). Как видно из аминокислотного состава, приведенного в таблице 3, для CGL характерно высокое содержание аспарагиновой кислоты, глицина, пролина, аланина и гистидина (табл. 3). Общее содержание углеводов составляет 1,3%. Поэтому можно предполагать синтез и секрецию лектина по классическому пути, что нехарактерно для семейства р-галактозидсвязывагощих белков - галектинов. Следовательно, пока нет возможности отнести CGL к какой-либо группе белков, поскольку неизвестна его аминокислотная последовательность.

Таблица 3. Аминокислотный состав лектина CGL.

SDS-электрофорез показал, что CGL движется в градиентном полиакрил амидном геле одной полосой как белок с молекулярной массой 18 кДа. SDS-электрофорез в присутствии 2-меркаптоэтанола дает тот же

результат, поэтому есть основание предполагать наличие лишь одной субъединицы в структуре белка.

Гем агглютинирующая активность лектина не зависит от дивалентных катионов. CGL не показал предпочтительности по отношению к какой-либо из групп крови человека (табл. 4). Обработка эритроцитов трипсином увеличивает гемагглготинацию, что, по-видимому, связано с тем, что экспонированные на поверхности клеток углеводные детерминанты маскируются белковыми молекулами.

Таблица 4. Агглютинация эритроцитов CGL.

Анализ ингибирования гемагглютинации различными веществами (табл. 5) показал, что М-ацетил-О-галактозамин, D-галактоза, D-талоза (С2-эпимер D-галактозы) способны ингибировать гемагглготинацию в концентрации 1,2-5,0 мМ. Ы-ацетил-О-галактозамин обладает самой высокой аффинностью по сравнению с другими ингибиторами. С другой стороны, метил-a-D-галактопиранозид показал аффинность в 6 раз более высокую по сравнению с

Таблица 5, Ингибирование реакции гемагглютинации CGL моносахаридами,

олигосахаридами и гликопротеинами.

Р-аномером. Конфигурация гидроксильной группы в С4- положении очень важна для реакции связывания лектина, так как глюкоза (С4-эпимер D-галактозы), не обладает ингибирующей активностью. D-талоза (С2-эпимер D-галактозы) ингибирует реакцию гемагглютинации в концентрации выше 5,4 мМ.

Этот факт показывает, что положение гидроксильной группы в С2-положении незначительно влияет на реакцию связывания CGL с D-галактозой. 3-О-метил-р-метилгалактозид не ингибирует реакцию в концентрации до 40мМ. Это позволяет предполагать, что гидроксильная группа в СЗ-положении имеет принципиальное значение для связывания CGL с галактозой. Гидроксильная группа в С6-положении также важна, так как D-фукоза также очень слабый ингибитор (не ингибирует в концентрации 80 мМ). Тот факт, что D-галактит не проявляет ингибирующей активности, показывает, что циклическая конформация сахара необходима для реакции связывания лектина.

Для реакции связывания имеет также существенное значение количество углеводных единиц и характер связи терминального остатка галактозы, Сравнение ингибирующей активности лактозы и мелибиозы показывает, что лектин специфичен к GaI(cct-6)Glc, тогда как лактоза Gal(pl-4)Glc не проявляет ингибирующего эффекта. Эти данные позволяют предполагать, что именно конфигурация и тип связи имеют решающее значение для связывания, а не следующий за галактозой остаток D-глкжозы. Причина, скорее всего, состоит в том, что галактоз ил ированная в четвертом положении глюкоза не относится к молекулярным структурам, специфичным для CGL. Изолактозамин (Gal(pi-3)GalNAc) и лактозамин Gal(pl-4)GlcNAc не ингибируют в концентрациях 8 и 10 мМ, соответственно. Возможно, что р-1,4- и р-1,3-связанные концевые сахара создают стерическое препятствие взаимодействию олигосахарида с углеводсвязывающим доменом лектина.

Включение гидрофобного п-нитрофенильного агликона в p-D-галактозу увеличивает ингибирующую активность последней в 10 раз по сравнению с обычной D-галактозой, и в 50 раз по сравнению с р-О-метил-Б-галактопиранозидом. Интересно, что подобное увеличение ингибирующей активности не происходит при включении п-нитрофенильного агликона в а-D-галактозу и М-ацетил-О-галактозамин. Похожий эффект был обнаружен у лектина из Sambucus nigra (SNA) (Fischer et al., 2000). Как и в случае с SNA, вероятно, что участок связывания гидрофобных молекул в углеводсвязывающем домене CGL расположен таким образом, что он предпочтительно реагирует с гидрофобным п-нитрофенильным р-связанным агликоном.

Среди нативных и обработанных нейраминидазой и проназой глико протеинов лучшими ингибиторами в реакции гемагглютинации были муцин подчелюстной железы быка (BSM) и его асиалоформа (a-BSM). Асиалофетуин и oci-кислый асиалогликопротеин обладают намного более высокой ингибирующей активностью, чем соответствующие нативные гликопротеины. Активность асиалофетуина оказалась в 17 раз выше асиалоорозомукоида. Более того, обработанные проназой гликопротены BSM и аси ал о-В SM показали намного более слабый ингибирующий эффект, чем соответствующие нативные гликопротеины. Из табл. 5 видно, что BSM в 37 раз более активен, чем BSM, обработанный проназой. Фетуин, обработанный проназой, в 33 раза менее активен, чем обычный фетуин. Эти изменения ингибирующей активности после ферментативной обработки, вероятно, связаны с тем, что BSM и асиалофетуин до обработки проназой представляют собой мультивалентные литанды, в которых пептидный кор несет на себе определенным образом расположенные углеводные цепи. При разрушении пептидных связей углеводные цепи теряют ориентацию, что сказывается на способности связывать лектин. Согласно другой гипотезе, важную роль во взаимодействии лектина с лигандом может играть

олигосахаридная последовательность и прилежащий пептидный участок, узнаваемый лектином.

CGL отличается от других известных Gal/GalNAc-специфичных лектинов по молекулярной массе, зависимости активности от ионов кальция, рН раствора и предпочтительной способности связывать олигосахариды с а-конфигурацией гликозидной связи. Этот лектин обладает повышенным сродством к остаткам Gal/GalNAc независимо от их положения в углеводных цепях, образующих своеобразную "щеточную" оболочку, характерную для гликопротеинов муцинового типа (рис. 7), Как видно из рис. 7 основную часть углеводных структрур составляет Тп антиген и в меньшей степени Т (рис, 8), Общую специфичность CGL к различным углеводным структурам можно представить в следующем виде:

Тп>Т » П > (l-0-p-N0₂Ph-p-D-Ga1p > D-GalNAc > Mel и Lace >1-0-р-N0₂Ph- и l-O-Me-ot-D-Galp > D-Gal и D-Tal >» 1-O-Me-a-D-Galp).

GalNAca 1 —Sei/Thr (>53%)

I , 1

OkNAc

GalNAcal—Ser/Thr (GlcNAcpi—ЗТп, >22%)

I , I

Gaipi-*3GalNAeal—ЯетЛЬг

1 , 1

T«

GlcNAc

і 81,6 (GtcNAcpi-^T,)

Gaipi—3GalNAcaI-*Ser/Thr
I , \

T*

Рис. 7. Асиаломуїдин подчелюстной железы (а-BSM, более 53% Тп) (Неф et а!., 1988).

Tn JL

O—(CH₂)_n-CH

c=o

/ П = 1 или 2

CH₂OH

он/^-—о

O—2)_n-CH

c=o

n = 1 or 2 /

Crypto - Tn Рис. 8. Углеводные структуры T и Tn гликотопов в проекциях Хэуорса.

Тп составляет углеводную основу гликопротеинов муцинового типа, представленные в организме в виде мукоидного секрета различных слизистых эпителиев - слюны, слизистой желудка и толстой кишки и т.д. Тп может быть гликозилирован или сиалирован и образует криптоформу (рис. 8) (Неф et al., 1988). После присоединения GalpI-»3 к Тп образуется эпитоп Т_и> который составляет основу антигена Thomsen-Friedenreich

CGL входит в состав препарата "митилан", обладающего иммуностимулирующей, антибактериальной и противоопухолевой активностью (Ovodova et al., 1992). Однако биологическая активность самого

CGL пока не изучена, так же как отсутствуют какие-либо работы по применению этого лектина в качестве маркера.

Таким образом, использование CGL в исследованиях компонентов клеток и тканей потенциально дает возможность определять локализацию и динамику перераспределения гликотопов Тп и Т, которые ассоциированы с муцинами. Другими словами, CGL может быть использован как реагент в исследованиях гликотопов муцинов при нормальных физиологических процессах и в онко патологиях.

1.4. Муцины в аденокарциномах толстой кишки человека

Аденокарцином ы представляют собой железистые трубочки или протоки, врастающие в прилежащие ткани, разрушающие их и образующие опухоль. Это самые распросраненные опухоли эпителиального генеза. Аденокарциномы в зависимости от степени дифференцировки способны секретировать муцины. Однако муцины, или гликопротеины муцинового типа аденокарцином имеют ряд характерных отличий от мукоидного секрета, который секретируют нормальные клетки эпителия толстой кишки. В нормальных муцинах доминируют структуры 3-го типа (Podolsky, 1985):

3.GaiP(l-4)GlcNAcP(l-3)GalNAc-Ser/Thr

2 NeuAca В секретируемых муцинах клеточных линий аденокарцином доминируют

структуры 1, 2 и 4 типа (Capon et аі., 1992):

1. NeuAca(2- 6) GIcNAca-Ser/Thr

2. GlcNAcP(l-3)Ga1NAc-Se^hr

6 2 NeuAca 4. Gaip(l-4)GlcNAcP(l-3)Gaip(l-4)G1cNAcP(l-3)GalNAc-Ser/Thr

NeuAca

Это считают главным отличием углеводных структур нормального и трансформированного эпителия. Более детальный перечень всех возможных изменений углеводных структур можно найти в обзоре (Kim et al., 1996).

Высокодифференцированные аденокарциномы обычно секретиругот большее количество муцинов, чем низкодифференцированные, потому что менее дифференцированные клетки содержат гораздо меньший объем цитоплазмы. Муцины, продуцируемые раковыми клетками, обнаружены в крови больных, что используют как прогностический фактор (Miyake et al., 1992).

Антигены, ассоциированные с муцинами Мисі, Мис2, МисЗ, TF, Тп и s-Tn (сиалил Тп) характеризуются стадийным увеличением экспрессии от аденом со слабой степенью дисплазии к аденомам с высокой степенью дисплазии и аденокарциномам (табл. 6). Высокое содержание этих антигенов также характерно для аденом и аденокарцином ворсинчатых опухолей, которые имеют более высокий метастатический потенциал по сравнению с опухолями блюдцевидного типа (Konish, Morson, 1982). Высоко- и среднедифференцированные аденокарциномы экспрессируютМис1, TF, Тп и s-Tn в большей степени, чем низкодифференцированные. Эпителиальные клетки с перинуклеарной локализацией этих антигенов, по всей видимости, способны полностью синтезировать углеводные цепи муцинов, в результате чего, сам секрет уже не реагирует со специфичными антителами. В аппарате Гольджи антитела реагируют с продуктами промежуточного синтеза. В опухолевых клетках синтез углеводных цепей происходит не полностью, и секрет локализован в апикальной части клетки, т.е. промежуточный продукт в нормальных клетках становится конечным в трансформированных клетках. В онкоцитах экспрессия муцинов становится аполярной, что приводит к неупорядоченному накоплению муцинов в целой клетке. Данные гистохимии не могут точно указать, играет ли потеря полярности экспрессии муцинов какую-либо роль в канцерогенезе.

Таблица 6. Типы клеточной локализации муцинов и их гликотопов в

аденомах и аденокарциномах толстой кишки человека (Cao et al., 1997).

+ Увеличенная экспрессия.

++ Сильно увеличенная экспрессия.

- Уменьшенная экспрессия.

Апикальный - тип локализации антигена в верхней части цитоплазмы.

Перинуклеарный - тип локализации антигена в цитоплазме окружающей

ядро.

Аполярный - тип локализации антигена диффузно по всей цитоплазме

и/или в базолатеральной мембране эпителия.

Муцины, локализованные в базолатеральной мембране, могут уменьшать адгезию клетки (Wesselmg et al., 1995). Муцины клеточной поверхности могут служить защитой от низких значений рН (Boland et al., 1995) и нейтрализовать иммунный ответ организма при развитии опухоли (Hilkens et al., 1995). Мисі считают главным источником TF, Тп и s-Tn гликотопов в колоректальный аденомах и аденокарциномах (Cao et al., 1997). Мисі - трансмембранный сиалогликопротеин (Мг>400.000) с большим внеклеточным доменом в нормальных колоноцитах. Это одна из самых крупных молекул клеточной поверхности образует палочковидные структуры 200-500 нм, которые даже могут маскировать другие поверхностные рецепторы (Hilkens et al., 1995). Мисі постоянно

эндоцитируется внутрь клетки, подвергается сиалированию в компартментах аппарата Гольджи и возвращается назад, т.е. происходит его рециркуляция. Предполагают, что таким образом поддерживается необходимая степень сиалирования молекулы (Litvinov, Hilkens, 1993). Цитоплазматический домен Мисі связан с Ras сигнальной системой ответственной за активацию онкогенов (Pandey et al.₇ 1995).

Muc2 и МисЗ известны как секреторные муцины. Мис2 образует структуру с высокой степенью полимеризации, которая может функционировать как физический барьер. Полная структура МисЗ еще неизвестна. Присутствие EGF-подобного С-концевого домена позволяет предполагать участие МисЗ в процессах лиганд-рецепторных взаимодействий, например при заживлении нарушений слизистой кишки (Kim, Gum, 1995).

Неполный синтез углеводов муцинов приводит к экспонированию на поверхности онкоцитов гликотопов TF, Тп и Le^x, которые адгезируют на рецепторах эндотелиальных клеток и гепатоцитов, и, таким образом, принимают участвуют в метастастазировании. TF-антиген групповой специфичности крови относится к онкофетальным антигенам. Его экспрессия обнаружена в толстой кишке новорожденных, но у взрослых людей TF почти не определяется. TF может маскироваться дополнительными боковыми углеводными цепями. Поэтому лектин арахиса PNA, специфично связывающий этот антиген, почти не дает окрашивания с нормальными эпителиальными клетками, однако хорошо реагирует с онкоцитами, где TF реэкспрессирован. PNA в пище устойчив к протеазам желудочно кишечного тракта, возможно, является природным мито геном, поскольку стимулирует пролиферацию эпителия прямой кишки (Ryder et al., 1998).

Кроме PNA, в гистохимических исследованиях гликотопов колоректальных муцинов, используют лектин Dolichos biflorus (DBA) и белковой железы виноградной улитки НРА. DBA и НРА на срезах толстой кишки интенсивно окрашивают секрет бокаловидных клеток и позволяют

таким образом детектировать D-GalNAc-содержащие молекулы муцинов. Моноклон ал ьные антитела к Мис2, который в основном секретируют бокаловидные клетки верхних отделов крипты не взаимодействовали с мукоидным секретом. Скорее всего, пептидный эпитоп оказывается спрятан за ""щеточной каймой" углеводных остатков и становится недоступен для антител (Gambus et al., 1994). Тем не менее, при помощи моноклональных антител удалось выделить 7 субпопуляций бокаловидных клеток толстой кишки, которые секретируют различные композиции муцинов (Latella et al., 1996).

НРА также связывает мукоидный секрет онкоцитов в самой опухоли и метастазах. Позитивная окраска НРА коррелировала с инвазией в региональные лимфатические узлы, метастазами и плохим прогнозом, однако не было найдено какой-либо связи между экспрессией гликотопов НРА и стадией дифференцировки опухоли толстой кишки (Ikeda et al., 1994), Прогностическая ценность этого лектина скорее всего связана с его способностью связывать Тп-гликотоп (GaINAcot-0-Ser/Thr). Однако прямые исследования экстрактов опухолей молочной железы вестерн-блоттингом показали, что кроме Тп НРА способен связывать и другие гликопротеин ы (Brooks, Leathern, 1998). Одним из наиболее вероятных кандидатов эндогенных лектинов, связывающих НРА-позитивные гликотопы, является галектин-3 человека, который также связывает GalNAc, полилактозаминные гликаны и АВН групповые антигены крови (Barondes et а!., 1994). Антиген Forssman еще один возможный гликопротеин, который узнает НРА, но менее вероятный, потому что реакция оказалась нечувствительной к обработке [i-N-ацетилгексозаминидазой (Ito et al., 1996).

В целом, мукоидный секрет аденокарцином толстой кишки содержит лишь 48% от нормального содержания углеводов, что связывают с общей супрессией генов ответственных за синтез соответствующих гликозилтрансфераз (Boland et al., 1990). Недавно показано, что Мис2, секретируемый клеточнй линией LS 180 аденокарциноми толстой кишки,

активирует циклооксигеназу-2 макрофагов, что можно считать одним из механизмов воспалительного процесса в прилежащих к опухоли тканям. Воспаление известно как один из негативных, сопутствующих онкогенезу процессов. Организм, реагируя на деструктивные процессы, наоборот способствует росту опухоли. Расширение сосудов, их фенестрация, усиленный приток крови оказывают стимулирующе воздействие на опухоль. Следовательно, отсутствуют молекулярные и физиологические механизмы, которые могли бы распознать и выработать соответсвующую реакцию на опухоль. В результате течение болезни усугубляется. В организм попадают продукты метаболизма опухоли, в том числе секретируемые муцины, различные токсические вещества, что вызывает отравление и нарушение нормальных физиологических процессов.

Секретируемые адненокарци номами толстой кишки муцины пропитывают окружающую соединительную ткань, что может вызывать ее деструкцию, нарушение регенеративных процессов. В результате этого соединительная ткань трансформируется в строму опухоли. Заполняя окружающее пространство, мукоидный секрет опухоли создает неблагоприятные условия для существования нормальных эпителиальных клеток. Поэтому муцины аденокарцином можно также рассматривать как фактор отбора опухолевых клонов. Онкоциты, неспособные существовать в данном микроокружении мукоидного секрета, будут элиминированы. Отсюда следует, что муцины аденокарцином толстой кишки, представляют собой важную составляющую опухолевого роста и профессии.

Ценность лектинов как углеводсвязывающих белков в исследованиях мукоидного секрета аденокарцином определяется специфичностью и аффинностью к углеводным структурам, которые возникают в результате злокачественной трансформации и модификации секреторного аппарата клетки.

1.5. Нейрональные Gal/GaIN Ac-содержащие гликонъюгаты как маркеры в спинномозговых ганглиях крыс

Гликоконъюгаты с терминальными остатками галактозы характеризуютя специфической экспрессией и распределением в различных нейронах, что широко используют в нейробиологии для маркирования субпопуляций клеток, ответственных за различные функции центральной и периферической нервной системы. Изолектин из Griffonia simplicifotia (GS-IB4) специфично связывает остатки a-D-галактозы мембранных гликопротеинов или рецепторов (Hayes, Goldstein, 1974), поэтому близок по специфичности к другим лектинам связывающим a-D-галактозу таким, как ИРА, PNA и DBA.

Показано, что связывание GS-IB4 с макрофагами стимулирует секрецию фактора некроза опухоли, благодаря чему возникает реакция на опухолевые клетки (Tabor et аі., 1992). Клеточные рецепторы, ответственные за это взаимодействие, также связывает эндогенный галектин-3, хотя последний более специфичен к остаткам pVD-галактозы (Sato, Hughes 1992). Амебоидные клетки микроглии также содержат рецепторы для GS-IB4 на своей поверхности и способны эндоцитировать лектин (Wu et al., 1999b). GS-ГВ4 широко используют в исследованиях антигена ксенотрансплантции (Galct(I-3)Gal), который является основной причиной отторжения тканей (Goldstein, Winter, 1999).

Кроме того, GS- IB4 способен специфично связывать гликоконъюгаты чувствительных нейронов типа Б спинномозговых ганглиев крыс, что успешно используется в гистохимических исследованиях (Streit, Kreutzberg, 1987). Пока нет каких-либо сведений о том, какие это гликоконъюгаты. Предполагают, что антигены групповой специфичности крови АВН могут иметь отношение к GS-IB4-no3HTHBHbiM гликопротеинам, которые приобретают терминальный остатки a-D-Gal в транс-цистернах аппарта Гольджи и транспортируются по аксонам, и очевидно, принимают участие в физиологической регенерации плазматической мембраны синапсов

(Silverman, Kruger 1990). Другие типы нейронов в составе спинномозговых ганглиев не взаимодействуют с лектином.

Нейроны, отвечающие за болевую чувствительность, делятся на 2 класса: первые имеют тело клетки маленького размера и медленно проводящие немиелиновые аксоны, известные как С-фибриллы, вторые имеют клеточное тело средних размеров и слабо миелизированные аксоны с более быстрой проводимостью, известные как А5 фибриллы. С-фибриллы могут быть еще разделены в соответствии с типом болевой чувствительности. Первая главная группа характеризуется тем, что экспрессирует провоспалительный пептид Р и пептид, ассоциированный с геном кальцитонина (CGRP). Вторая группа не экспрессирует субстанцию Р или CGRP, но может быть идентифицирована по присутствию специфичных ферментов (фтор-резистентной кислой фосфатазы FRAP) или связыванию с лектином GS-IB4 (Caterina, Julius, 1999). Эти группы нейронов также отличаются по способности синтезировать рецепторы нейротрофина (MolHver et ah, 1997).

Предполагают, что последние 2 типа нейронов отвечают за передачу термических, химических и механических стимулов, выполняя общую соматосенсорную функцию. Отдельные группы нейронов могут вносить различный вклад в инициацию и поддержание болевого ощущения. Например, пептид-эргические нейроны, очевидно, отвечают за нейрогенное воспаление при выбросе провоспалительных пептидов в ответ на активацию (Cao et al., 1998). Вероятно, эти нейроны отвечают за болевые ощущения, вызванные воспалением тканей (Woolf et al., 1998). Напротив, анализ нокаут-мышей по протеин-пептидазе С дает основание предполагать, что GS-IB4-позитивные непептид-эргические нейроны специализированы для поддержания хронического болевого ощущения в ответ на деструкцию нервных окончаний (Malmberg et al., 1997). Электрофизиологические исследования также показали, что С8-1В4-позитивные нейроны, или Б-нейроны, отличаются по проводимости нервного импульса и амплитуде натриевых каналов (Stucky, Lewin, 1999).

Конъюгат GS-IB4 с токсином сапорином успешно использовали для специфичной нейтрализации Б-нейронов ш vivo. После инъекции в спинной мозг крысы теряли термическую и механическую болевую чувствительность (Vulchanova et al., 2001). Из этого следует, что нейроны типа Б отвечают за термическую и механическую типы болевой чувствительности и в целом за острые болевые ощущения.

Феномен ретроградного транспорта гликоконьюгатов используют для изучения распределения нервных волокон в организме. При инъекции лектина в спинной мозг он попадает внутрь клеток и транспортируюется вместе с гликоконьюгатам по нервным волокнам. Так после инъекции конъюгата пероксидазы хрена с GS- IB4 позитивные афферентые волокна Б-нейронов обнаружены в коже и внутренних органах. Б-нейроны отвечают, таким образом, за висцеральную чувствительность (Pleinderleith, Snow, 1993).

SBA, также специфично связывающий галактозу, маркировал субпопуляцию Б-нейронов, что и GS-IB4 (Silverman, Kruger 1990). Очевидно, активность лектинов связана с работой специфических гликозилтрансфераз, которые присоединяют остатки галактозы в специализированных трансцистернах аппарата Гольджи, потому что -галактоза аккумулировалась именно в этих компартментах Б-нейронов (Streit, Kreutzberg, 1987).

Таким образом, галакотозоспецифичные лектины могут служить полезным инструментом для более полного морфологического анализа не пептид-эргических чувствительных нейронов.

1.6. Галектин-3 в межклеточном матриксе

1.6.1. Общая характеристика галектина-3 человека

Биотехнология выделения лектинов из разнообразных биологических объектов постепенно вытесняется методами рекомбинантных ДНК (Лахтин, 1989). Развитие методов генной инженерии и применение в исследованиях лектинов дало мощный толчок в изучении большого класса галактозоспецифичных лектинов человека и животных - галектинов

(Barondes et al., 1994). Клонирование белка, в отличие от обычного выделения из экстракта, позволяет получить более гомогенные и в большем количестве препараты и, что самое главное, аминокислотную последовательность белка. Это в свою очередь позволяет систематизировать данные о молекулярной организации лектинов (Лахтин, 1994). В работах некоторых авторов по-прежнему присутствует такая очень неопределенная характеристика изучаемого лектина, как "полоса с молекулярной массой". Например, нет возможности определить, к каким уже известным 14 членам семейства галектинов могут относиться галактозосвязывающие лектины СЛ1 и СЛ2 (Рапопорт и др., 1996; Рапопорт и др., 2000).

Галектин-3 - один из самых изученных белков семейства галектинов. Это главным образом цитоплазматический белок, который также легко транспортируется в клеточное ядро митохондрии и во внеклеточное пространство, несмотря на отсутствие классической сигнальной последовательности на N-концевой части молекулы (Barondes et al., 1994; Davidson et al., 2002; Yu et al., 2002). Галектин-3 часто ассоциирован с аппаратом сплайсинга созревающих мРНК в ядре, поэтому его считают важнейшим компонентом пролиферативного потенциала клетки (Dagher et al., 1993). Основная дилемма в изучении галектина-3 состоит в том, считать ли этот белок непосредственно действующей молекулой внутри клетки или в экстрацеллюлярном матриксе либо сигнальной молекулой, играющей роль спускового крючка в самых разнообразных физиологических процессах.

В первом случае необходимы достаточно высокие концентрации лектина, а во втором - уровень синтеза может быть достаточно низким, но тогда нужны особые сигнальные каскады, способные «усилить» сигнал. Сигнальные каскады, благодаря которым галектин-3 стимулирует клеточную пролиферацию, недавно определены для звездчатых гепатоцитов HSC_S (Maeda et al., 2003). Галектин-3 охарактеризован как компонент сигнальной системы клеточной смерти (апоптоза) (Lee et al., 2003).

Однако возможно и противоположное воздействие на клеточную пролиферацию. Трансформирование LNCaP-клеточной линии рака простаты к ДНК галектина-3 приводит к супрессии пролиферации и снижению скорости роста опухоли (Ellerhorst et al„ 2002). Метастазирование, т.е. проникновение клеток изначальной раковой опухоли в другие части организма, можно остановить, подавляя деятельность галектина-3, который способствует тесному контакту клеток в организме. Галектин-3 без N-концевого (коллагеноподобного) домена не только не может прикреплять клетки друг к другу, но и блокирует доступ к клеткам нормального галектина-3 (John et al._s 2003). Модифицированный пектин цитрусовых также способен нейтрализовать галектин-3 и благодаря этому может подавлять рост опухоли и метастазов в случае рака простаты (Nangia-Makker et al., 2002).

И в цитоплазме, и в митохондриях галектин-3 взаимодействует с антиапоптозной сигнальной молекулой Bcl-2 (Akahani et al., 1997; Kim et al., 1999; Yang et al., 1996). Галектин-3 известен как ингибитор апоптоза Т-клеток иммунной системы (Yang et al., 1996). Особый интерес представляет наличие аминокислотной последовательности NWGR в галектине-3, такой же мотив обнаружен в Bcl-2 (Yang et al., 1996). Посредством NWGR Bcl-2 связывает Bax и образует белковые гетеродимеры (Yin et al., 1994). Ответственность NWGR за ингибирование апоптоза гапектином-3 была показана на клеточных линиях карциномы молочной железы. Экспрессируемый галектин-3 ингибирует апоптоз, индуцированный цисплатином, тогда как галектин-3, несущий мутацию по участку NWGR, не дает такого эффекта (Akahani et al., 1997).

Кроме того, описан ингибирующий эффект на особый вид апоптоза -аноикис, который индуцирует отсутствие клеточного «якоря» - субстрата для адгезии. Скорее всего, галектин-3 задерживает клеточный цикл на фазе G1, находясь в котором клетки не подвергаются аноикису (Kim et al., 1999). В экспериментах in vivo (Hsu et al., 2000) на нокаут-мишах показано, что в этих

мышах макрофаги накапливаются в перитониальной полости, и эти клетки оказались более устойчивы к апоптозу, индуцированному липополисахаридом и у- интерфероном (Hsu et al.„ 2000).

Очевидно, что фосфорилирование галектина-3 необходимо для его функции как ингибитора апоптоза, по крайней мере, в случае аноикиса. Галектин-3 в неделящихся клетках присутствует в основном в фосфорилированной форме (Cowles et al., 1990). Как и другие галектины, галектин-3, главным образом является внутриклеточным белком (Moutsatsos et al., 1987; Wang et al., 1992). Однако его локализация может меняться, когда клетки входят в следующую фазу роста. Например, в активно пролиферирующих мышиных фибробластах галектин-3 находится и в ядре, и в цитоплазме (Moutsatsos et al., 1987; Hamann et al., 1991). Галектин-3 в нефосфорилированной форме обнаружен только в ядре (Hamann et al., 1991). N-концевой домен галектина-3 определяет его ядерную локализацию потому, что его деления приводит к исчезновению галектина-3 из ядра (Gong et al., 1999).

В межклеточном пространстве галектин-3 вероятнее всего играет роль регулятора клеточной адгезии. Он также участвует в органогенезе, функционировании иммунной системы и опухолеобразовании (Bao, Hughes, 1995; Liu et al., 1993; Raz, Lotan, 1981). Нокаут-мыши no LGALS3, у которых инактивирован LGALS3, кодирующий галектин-3, также как и нокаут-мыши по LGALS3 и LGALS1 (LGALS1 кодирует галектин-1), не имеют каких-либо дефектов имплантации и всего эмбрионального развития. Это дает основание предполагать, что галектин-3 и его антагонист по физиологическому действию галектин-1 не являются жизненно важными белками, и, следовательно, их изучение не позволит раскрыть какие-либо новые физиологические механизмы (Colnot et al., 1998).

Несмотря на то, что нулевые по галектину-3 мутанты мышей все еще интенсивно используют в изучении канцерогенеза и других патологических процессов, за исключением хондроцитов (Colnot et al., 2001), нормальные

., ГСССМЙС'СЛГі

⁴¹ госу;:л,'>сї'зпиил J

БИЕЛИОТІ-КА J

клетки организма могут обходиться без галектина-3. Таким образом, возникает вопрос, при каких физиологических процессах необходим галектин-3? Насколько он более важен при патологических состояниях, вызванных инфицированием микроорганизмами, диабетом, инфарктом миокарда или метастазированием опухоли? Может быть, он более важен при имплантации и развитии эмбриона высших приматов по сравнению с грызунами? Это лишь некоторые из вопросов, которые необходимо адресовать к исследователям галектина-3. Тем временем изучение галектина-3 можно считать достаточно зрелым, и многие новые факты дают возможность прояснить общую картину участия галектина-3 в самых разнообразных физиологических процессах. В этой части обзора мы постараемся проанализировать опубликованные данные о функции галектина-3 в межклеточном пространстве, а также его роль в клеточной адгезии.

1.6,2. Аффинность связывания галектином-3 различных углеводных

остатков

Биологическая активность галектина-3 в межклеточном пространстве, включает, главным образом, взаимодействие с различными гликоконъюгатами посредством углеводсвязывающего домена (CRD). CRD состоит из 125 остатков аминокислот, которые образуют 12 р-складчатых слоев (Hsu et al., 1992). Кроме этого домена, в галектине-3 присутствуют коллагеноподобный и короткий 12-членный N-концевой домен, которые вместе образуют химерный тип структуры характерный только для галектина-3 (Barondes et al., 1994). Коллагеннодобный домен иногда также называют N-концевым.

Одна из долгосрочных задач исследования галектина - идентификация эффективных ингибиторов. Большое число синтетических схем, включая комбинаторные библиотеки, было использовано для конструирования ингибиторов на основе N-ацетиллактозоамина и лактозы. Мы постарались

пересчитать из опубликованных данных аффинность разных производных лактозы по отношению к гапектину-3 (табл. 7).

Таблица 7. Характеристика аффинности галектина-3 к различным

углеводным лигандам.

* Прямые измерения с помощью микрокалориметрии (Bachhawat-Sikder et

at.,2001).

** Ингибирование связывания с галектином-3 в ИФА (Sorme et al., 2002).

- Данные отсутствуют.

Галектин-3, как и другие члены белков семейства галектинов, определен как р-галактозосвязывающий белок. Добавление остатка глюкозы к восстанавлевающему концу галактозы с образованием лактозы (Lac) соответственно увеличивает аффинность галектина-3. Замена гидроксильной группы в глюкозном остатке лактозы на более гидрофобную ацетамидную группу с образованием N-ацетиллактозамина увеличивает аффинность, более чем в 6 раз (табл. 7). Присоединение гидрофильного остатка галактозы к ЗОН-группе LacNAc приводит к дальнейшему увеличению аффинности

более чем в 23 раза по сравнению с лактозой (Bachhawat-Sikder et al., 2001). Другие заместители (лиганды 8-11, табл. 7), полученные введением гидрофобных групп в 3-ем положении остатка галактозы N-ацетиллактозамина (LacNAc) (Sorme et al., 2002) увеличивают аффинность галектина-3 в 2,5 раза по сравнению с LacNAc. Однако природные и синтетические мультивалентные лиганды имеют наиболее высокую аффинность к галектину-3 по сравнению с лактозой. Например, 3,6-2-N-ацетиллактозаминиллактоза (5, табл. 7) как представитель минимальной структуры полилактозаминной цепи представляет собой лучший лиганд среди простых олигосахаридов, представленных в табл. 7.

Ламинин — гетеродимерная молекула, одна из ключевых составляющих межклеточного матрикса - является мишенью для галектина-3, который связывает полилактозам и н в этом гликопротеине. Были детально изучены аффинность связывания галектина-3 и его фрагментов (в которых N-концевые аминокислоты были удалены из молекулы) с ламинином, иммобилизованном на чипе установки Biocore (Barboni et al., 1999). Полипептид галектина-3 без 103 N-концевых аминокислот представляет собой лишь углеводсвязывающий домен. CRD характеризуется константой связывания Ка=0,05х10⁶ М"¹. Для сравнения, полный галектин-3 имеет К_а^1х10^б М"¹. Интересно, что CRD, содержащий дополнительно 10 аминокислот коллагеноподобного домена, характеризуется в 2 раза более высокой аффинностью (Ка=0,1Х10⁶ М¹). Более того, полный галектин-3 и фрагмент с 94-го по 250-й аминокислотный остаток содержит второй дополнительный участок связывания для ламинина (К_а=0,3х10⁶ М"¹ и 2,0x10⁶ М"¹ соответственно) (Barboni et al., 1999). Это может означать, что коллагеноподобный домен галектина или его участок могут уменьшать активность CRD.

Взаимодействие галектина-3 с металлопротеазами межклеточного матрикса приводит к отщеплению и перевариванию большей части N-концевого домена, а оставшийся фрагмент с Мг~22 кДа обладает

аффинностью значительно более высокой к гликанам по сравнению с полной молекулой галектина-3. Предполагают, что этот фрагмент играет важную физиологическую роль в межклеточном матриксе (Ochieng et al., 1998; Ochieng et al., 1999).

1.6.3. Рецепторы (лиганды) галектина-3 на клеточной поверхности и в межклеточном пространстве

На клеточной поверхности галектин-3 взаимодействует с большим числом лигандов, некоторые из которых охарактеризованы и суммированы в табл. 8. Галектин-3 связывает молекулы в их моновалентной форме или при более высоких концентрациях по мультивапентному механизму (Barondes et al., 1994; Ochieng et al., 1994). Однако, конкретные физиологические события, следующие за этими взаимодействиями, пока неизвестны. Связывание гапектина-3 с CD-98 Т-лимфоцитов приводит к возрастанию внутриклеточной концентрации ионов кальция (Dong, Hughes, 1996), в то время как его взаимодействие с рецептором FcgRII в различных типах клеток приводит к ингибированиго экспрессии гена интерлейкина IL-5 (Cortegano et al., 2000). Галектин-3 в низких концентрациях в межклеточном матриксе инициирует продукцию супероксида и увеличивает выброс интерлейкина-1, индуцированного липополисахаридом (Jeng et al, 1994; Liu et al., 1995). Установлено, что галектин-3 может перекрестно связывать рецепторы иммуноглобулинов IgE в тучных клетках и инициировать, таким образом, цитотоксичность к внутриклеточным паразитам, дегрануляцию и выброс серотонина (Zuberi et al., 1994; Truong, 1993). На нейтрофилах человека галектин-3 связывает главным образом CD-66a и CD-66b (Feuk-Lagerstedt et al., 1999), а также поверхностный антиген NCA-160 (Yamaoka et al., 1995).

Вторая группа рецепторов галектина-З на клеточной поверхности в большей степени относится к адгезивным механизмам, чем к механизмам передачи сигнала. В нервных тканях галектин-3 взаимодействует с гликопротеином, ассоциированным с миелином (MAG), ламинином,

Таблица 8. Природные лиганды гапектина-3.

Таблица 8. Продолжение.

тенасцином R и в меньшей степени с сигнальной молекулой L1 и молекулой клеточной адгезии нейронов (NCAM) (Probstmeier et al., 1995). Опухолевые клетки рака толстой кишки продуцируют значительные количества муцинов на клеточной поверхности и в межклеточном матриксе. Эти муцины содержат углеводные цепи, построенные из полилактозаминов, и охарактеризованы как основные лиганды галектина-3 (Bresalier et al., 1996). Связывание галектина-3 с муцинами злокачественных опухолей толстой кишки человека может способствовать гомо- и гетеротипичным клеточным взаимодействиям, приводящим к метастазированию опухоли (Inohara, Raz, 1995).

Рецепторы галектина-3 в опухолях толстой кишки включают в себя раково-эмбриональный антиген (СЕА) и белки, ассоциированные с лизосомальными мембранами (LAMPs) (Barondes et al, 1994; Ohannesian et al., 1995). Другие важные рецепторы галектина-3 на клеточной поверхности относятся к семейству интегринов: CD-IIb/18 интегрин (Мае 1 антиген) мышиных макрофагов (Springer et al., 1979; Dong et al., 1997) и aipV интегрины клеточных линий рака молочной железы человека (Ochieng et al., 1998). Эти взаимодействия, очевидно, предполагают участие галектина-3 в клеточной адгезии.

1.6.4. Роль галектина-3 в органогенезе и ангиогенезе

Экспрессия галектина-3 обнаружена в метанефронах хомячка (Foddy, Hughes, 1986), а также в процессе нефрогенеза почечных канальцев человека (Winyard et al., 1997). Была установлена его роль как модулятора ветвления почечных протоков в органной культуре эмбриональной почки мыши (Bullock et al., 2001). На ранних стадиях развития метанефрона галектин-3 не обнаружен. На более поздних этапах он экспрессируется в терминальных ответвлениях почечных канальцев и эндотелии почечной лоханки.

Экзогенно внесенный галектин-3 ингибирует ветвление почечных канальцев. Роль галектина-3 в развитии почки была также изучена на модельной системе клеток MDCK (Madin-Darby canine kidney) in vitro (Bao et al., 1995). Добавление экзогенного галектина-3 задерживало рост и формирование цист MDCK, тогда как внесение антител, блокирующих гапектин-3, или его ингибиторов, ускоряло рост этих цист (Bao et al., 1995). Предполагают, что в этой системе галектин-3 стимулирует клеточную адгезию, которая ограничивает подвижность в точках роста и реорганизации эпителиальных трубочек.

С другой стороны, галектин-3, возможно, играет ключевую роль в формировании плотных контактов, поддерживающих клеточную полярность. Это также характерно для нормальных эпителиальных клеток молочной

железы, выращиваемых на искусственном межклеточном матриксе -матригеле, где они формируют хорошо различимые цисты, построенные из полярных клеток (Howlett, Bissell, 1993). Галектин-3 может непосредственно участвовать в конечных этапах дифференцировки эпителиальных клеток. При взаимодействии с хензином он индуцирует его полимеризацию. Хензин - гликопротеин высокой молекулярной массы, который поддерживает полярность клеток в дифференцированном состоянии (Hikita et al., 2000). Для нормального развития почки абсолютно необходимо присутствие соответствующих рецепторов клеточной поверхности, взаимодействующих с галектином-3, так как при их отсутствии происходит нарушение формирования эпителиальных трубочек (Bao, Hughes, 1999).

Кроме очевидного участия галектина-3 в образовании почечных канальцев, была установлена его роль в органогенезе на модели in vitro (Nangia-Makker et al., 2000). Эти данные ясно показывают, что для правильного формирования капилляров эндотелиальными клетками in vitro необходим галектин-З, тогда как добавление антител или лактозы блокирует этот процесс. И в этом случае, возможно, что галектин-3 опосредует сильную или слабую адгезию клеток между собой и клеток с белками межклеточного матрикса. Однако точный механизм этого действия пока не установлен.

Галектин-3 также участвует в образовании маточно-плацентарного комплекса при имплантации эмбриона (Lee et al., 1998), несмотря на тот факт, что имплантация протекает нормально и в нулевых по галектину-3 нокаут-мышах. Возможно, что галектин-3 может быть функционально замещен другими галектинами, например, галектином-5.

1.6.5. Галектин-3 и эндоцитоз/экзоцитоз

Нами было показано, что галектин-3 может подвергаться эндоцитозу из внеклеточного вещества в зависимости от концентрации (Furtak et al., 2001). Этот процесс хорошо ингибируется антибиотиком филипином, но не хлорпромазином, что дает основание предполагать участие кавеолярных

мембранных микродоменов, а не клатрин-окаймленных везикул (Orlandi et al., 1998). Более того, мы продемонстрировали, что внеклеточный галектин-3 в концентрации 10-100 мкг/мл может эффективно стимулировать эндоцитоз pV интегринов (Ochieng et al., 1998; Furtak et al., 2001).

Последующие исследования также показали, что галектин-3 опосредует эндоцитоз конечных продуктов неферментативного гликозирования (AGE) и ацетилированных липопротеинов низкой плотности (LDL) (Zhu, Ochieng, 2001). Исследования, в которых нулевые по галектину-3 мутанты мышей были обработаны препаратами, индуцирующими развитие диабета, почечное клубочковое накопление AGE наблюдали только у нулевых по галектину-3 нокаут-мышей (Pugliese et al., 2001). Это позволяет предположить, что он играет роль медиатора эндоцитозной деградации AGE клетками почек. Накопление AGE во внеклеточном матриксе - основная причина разрушительного действия диабета на организм, следовательно, галектин-3 может смягчать клеточные повреждения, связанные с этой болезнью. Подобным образом галектин-3 опосредует эндоцитоз ацетилированных LDL макрофагами и эндотелиальными клетками, что может быть причиной атерогенеза (Zhu, Ochieng, 2001). В этих исследованиях показано, что галектин-3 скорее всего является фактором, облегчающим процесс эндоцитоза, а не самим рецептором эндоцитоза. В подтверждение этой точки зрения, кубилин, мембранный протеин с Мг~400 кДа, опосредующий внутриклеточную интернализацгао большого числа разных молекул (Christensen, Birn, 2002), недавно описан в комплексе с галектином-3 (Crider-Pirlde, 2002), что предполагает вспомогательную функцию галектина-3 в эндоцитозе.

Несмотря на отсутствие сигнального пептида, галектин-3 очень легко преодолевает плазматическую мембрану в обоих направлениях, и это свойство, возможно, придает ему еще большее значение, как в норме, так и при различных патологиях. Он может связываться с такими амфипатичными молекулами, как синексин (Yu et al., 2002) и воздействовать на различные

клеточные процессы, включая экзоцитоз и эндоцитоз. Существуют и другие мультифункциовальные белки, напоминающие по своим свойствам галектин-3. Например, аннексины, синтезированные на свободных рибосомах клеточной цитоплазмы, экскретируются из клетки без помощи сигнальных пептидов (Siever, Erickson, 1997), Подобно галектину-3, они также рассматриваются как мульти функциональные белки, чья роль в межклеточном матриксе точно неизвестна. Например, аннексин-5 является маркером апоптоза, т.к. он связывает фосфатидилсерин, который переносится из внутреннего слоя мембраны в наружный при апоптозе (Pepper et al., 1998). Таким образом, пока очевиден сам факт участия галектина-3 в эндоцитозе и его взаимодействие с другими молекулами, но неясен механизм этого взаимодействия.

Галектин-3 в силу отсутствия сигнального пептида, главным образом, цитоштазматический белок, и его внутриклеточное содержание намного превосходит концентрацию на клеточной поверхности или в межклеточном матриксе. Механизм, благодаря которому он транспортируется из клетки, неясен, и, скорее всего, это может быть новый путь экзоцитоза. Опухолевые клетки характеризуются особенно высокой скоростью секреции галектина-3. Поэтому этот тип секреции нельзя отнести к неклассическим механизмам (Sato et al, 1993; Hughes, 1999; Menon, Hughes, 1999).

1.6.6. Галектин-3 и клеточная адгезия

Взаимодействие клеток с межклеточным матриксом происходит в основном за счет интегринов клеточной поверхности (Hynes et al., 1987). Однако существуют белки клеточной поверхности, модулирующие их активность. В модели адгезии (Hughes, 2001) галектин-3 может связывать гликозилированный CD-98 на поверхности клетки, который, в свою очередь, инициирует образование кластеров интегринов на поверхности плазматической мембраны. В результате этого возрастает авидность связывания (Hughes, 2001). В ряде работ показано, что интегрины аїрі и CD-

1 lb/18 могут непосредственно взаимодействовать с галектином-3 (Ochieng et al., 1998; Dong, Hughes, 1997). Вероятнее всего, галектин-3 посредством углеводсвязывающего домена связывает ди- и тетраантенные полилактозаминные цепи на интегринах (Veiga et al., 1995; Jasiulionis et al., 1996), Предполагают, что при связывании с интегринами галектин-3 изменяет их аффинность или создает стерическое препятствие для их взаимодействия с межклеточным матриксом. Посттрансляционная модификация интегринов в отношении остатков полилактозамина обычно возрастает после онкотрансформации клетки и может далее усиливаться с прогрессией опухоли (Dennis et al., 1999).

Галектин-3 модулирует адгезию всех типов клеток, содержащих гликозилированные соответствующим образом интегрины (Andre et al., 1999; Veiga et al., 1995). В случае, если интегрины неполностью гликозилированы и не имеют полилактозаминных остатков, что можно ожидать в нормальных эпителиальных клетках и фибробластах, то взаимодействие клеток с экстрацеллюлярным матриксом (ЕСМ) может контролироваться другими сопутствующими интегринам белками, и, следовательно, эти клетки нечувствительны к действию галектина-3. Регуляция адгезии опухолевых клеток галектином-3 может быть перспективным объектом терапевтического воздействия in vivo. В нормальных эпителиальных клетках, как упоминалось выше, галектин-3 в основном играет роль поддержания дифференцированного фенотипа, а не адгезии клеток к белкам ЕСМ, как в случае опухолевых клеток. Галектин-3 в нормальном дифференцированном эпителии в большей степени локализован на апикальном полюсе клетки (Sato etal., 1993).

Предположим, что основным сценарием действия галектина-3 является ингибирование адгезии клеток к белкам экстрацеллюлярного матрикса, тогда возникает вопрос, может ли он быть анти-адгезивным белком во всех этих клеточных системах? Если принимать во внимание зависимость действия от концентрации, галектин-3, подобно галектину-8, можно причислить к так

называемым матрицеллюлярным белкам, обсладающим и про -, и антиадгезивными свойствами (Levy et al., 2001). Клеточные линии MDA-MB-435 и MDA-MB-231 из опухолей молочной железы характеризуются высоким уровнем экспрессии галектина-3 и обладают хорошей адгезивностью к белкам ЕСМ в сравнении с клеточными культурами с низким или нулевым уровнем галектина-3 (Warfield et al., 1997; Matarrese et al., 2000).

Более того, недавно показано, что ингибирование галектина-3 в MDA-МВ-435 с помощью антисмьгсловых ДНК дает начало субклону клеток, которые плохо распластываются на пластике и обладают слабой адгезивностью к белкам ЕСМ и, судя по всему, используют альтернативный адгезивный механизм. Галектин-3 может ускорять секрецию и экспрессию интегринов на клеточной поверхности (Warfield et al., 1997; Matarrese et al., 2000) и секрецию/экзоцитоз коллагена во внеклеточное пространство, что приводит к увеличению адгезии и распластыванию клеток (Sasaki et al., 1999). Галектин-3 может также лигировать клетки к белкам ЕСМ даже в случаях, когда для этого необходимы высокие концентрации лектина.

Главные компоненты ЕСМ ламинин и фибронектин содержат остатки полилактозами на, непосредственно взаимодействующие с галектином-3 (Sato et al., 1992). Галектин-3 в высоких концентрациях в межклеточном матриксе, благодаря кооперативному эффекту (Hsu et al., 1992; Ochieng et al., 1993; Massa et al., 1993), может служить посредником связывания клеток и ЕСМ. Была показана его роль в адгезии клеточных линий рака молочной железы к эластиновым волокнам (Ochieng et al., 1999). Галектин-3 сам по себе может быть иммобилизован на ЕСМ (Ochieng et al., 1995), а клетки в свою очередь могут непосредственно связывать галектин-3 по углеводным остаткам (Pesheva et al., 1998). У бактерий и низших эукориот галектин-3 характеризуется как главный участник в адгезии к белкам ЕСМ и тканям хозяина. Недавно показано, что три помасти готы Trypanosoma cruz't могут связывать ламинин при взаимодействии с галектином-3 (Moody et al., 2000). Галектин-3 также связывает липополисахариды бактерий, благодаря чему

происходит инфицирование клеток хозяина или иммобилизация в межклеточном матриксе (Mey et al., 1996; Mandrell et al., 1994; Gupta et al., 1997).

1.7. Заключение

Использование лектинов как растительного, так и животного происхождения в качестве маркеров отдельных клеток и клеточных популяций является бесспорным достижением современной гликобиологии. Выделение и очистка новых лектинов, обладающих уникальной углеводной специфичностью, может служить источником новых инструментов в гистохимеческих и цитохимических исследованиях. Лектин CGL из мидии Crenomytilus grayanus еще не использовали в данной области. Возникло предположение о возможности специфического маркирования этим лектином муцинового секрета при онкотрансформации эпителиальных клеток толстой кишки человека, а также нейронов в спинномозговых ганглиях крыс.

В настоящее время достигнут определенный прогресс в изучении лектинов, механизма их действия и непосредственного участия в самых разнообразных физиологических и патологических процессах. В частности, для галектина-3 человека установлены внутриклеточные и внеклеточные лиганды, роль в апоптозе и процессинге мРНК, а также биологическая активность, связанная с клеточной адгезией. Однако остаются нерешенными многие проблемы, связанные с определением механизма клеточной секреции галектина-3, воздействия на сигнальные системы внутри клетки, характера воздействия на клеточную поверхность галектина-3, находящегося в межклеточном пространстве. Неясно, может ли секретируемый галектин-3 подвергаться эндоцитозу, если да, то какое значение это может иметь для клеточных процессов. Основная гипотеза данной работы состоит в том, что галектин-3 связывает р_гинтегрины клеточной поверхности и инициирует эндоцитоз внутрь клетки, благодаря чему они теряют способность эффективно связывать белки межклеточного матрикса.

2. Материалы и методы 2.1. Объекты исследования

В экспериментах с CGL использовали операционный материал по поводу аденокарциномы толстой кишки в Краевой клинической больнице г. Владивостока. 4 опухоли ворсинчатого и 8 опухолей блюдцевидного типа, а также сопутствующие аденоматозные полипы и прилежащий неизмененный эпителий толстой кишки (сигмовидная и прямая кишка), эпителий тонкой (12-перстной) кишки. Для исследования спинномозговых ганглиев крыс использовали половозрелых самцов и самок линии Вистар (виварий ТИБОХ ДВО РАН), из которых были также получены образцы тонкой (12-перстной) кишки.

В опытах с галектином-3 и CGL использовали клеточные линии карциномы молочной железы человека MDA-MB-231, MDA-MB-435, ВТ-544 и 11-9-1-4, которые были любезно предоставлены доктором A. Raz (Karmanos Cancer Institute, Detroit, Ml, США). Клеточная линия 11-9-1-4 представляют собой ВТ-549, которую трансформировали кДНК галектина-3. Все клеточные линии культивировали в среде ДМЕМ/Р12 (Sigma, США) со 100 мкг/мл пенициллин-стрептомицином, 2,5 мкг/мл фунгизона, 20 нг/мл эпидермального фактора роста, 98 нг/мл холерного токсина, 10 % эмбриональной сыворотки теленка (Gibco, США), 2 мМ глутамина и незаменимых аминокислот. Клетки культивировали при стандартных условиях: 37С, увлажненная атмосфера с 5 % ССЬ .

2.2. Реактивы и реагенты

В разделах 2.4. и 2.5. были использованы альциановый синий (Sigma, США), реактив Шиффа (Sigma, США), гематоксилин (Loba, Австрия), 25% раствор глутарового альдегида (Reanal, Венгрия), 5,5' - диэтилбарбитуровая кислота (веронал) (Reanal, Венгрия), трис (Serva, Германия), твин 20 (Ferae, Германия), агар (Difco, США), 37% раствор формалина «фарм.», глицерин

«ч», KJO4 «ч», алюмокалиевые квасцы «чда», NaCl «чда», 37% НО «хч», NaOH «хч», уксусная кислота «хч», КОН «хч», КМп0₄ «хч», СаО «ч» (Реахим, СССР), парафин «техн» (отс 6-15-402-90).

Гематоксилин Эрлиха:

В 100 мл 96% этанола растворяли 2 г гематоксилина, прибавляли 100 мл. дистиллированной воды, затем 100 мл чистого глицерина, 3 г. калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты, взбалтывали и оставляли на свету созревать в течение 14 дней (Меркулов, 1979).

В разделе 2.6. были использованы NaCl, фосфат натрия, бикарбонат
настрия, Трис, пиперазин-К-Ы-(2этансульфоновая кислота) (PIPES), среда
для культивирования клеток DMEM, детергент NP-40,

фелилметансульфонилфлюорид (PMSF), NaJ04,, NaBH» диоксихолевая кислота (DOC), диметилсульфоксид (ДМСО), фенилизотиоционат (FITC), ЭДТА, уксусная кислота, этанол, метанол, глицин, глицерин, Твин-20, Тритон Х-100, лактоза, имидазол, кумасси R-250, додецилсульфат натрия (SDS), Понсо S, сефадекс G-25 (Sigma, США), аффигель-15 (Bio-Rad, США), набор реактивов для определения белка по Смиту (Pierce, США).

2.3. Аналитические методы 2.3.1. Электрофорез белков в полиакриламидном геле

Электрофорез белков проводили в 12% ПААГ в восстанавливающих условиях. В лунки вносили 1-5мкг белка. Образцы 5-20 мкг белка растворяли в буфере, содержащем 0,125 М Трис-HCl (рН 6,8), 4% додецилсульфата натрия (SDS), 20% глицерина, 0,005% бромфенола синего и 10% р-меркаптоэтанола (Sigma, США). Образцы кипятили 2 мин на водяной бане и вносили в лунки геля. Для приготовления разделяющих гелей использовали 30% смесь акриламида (АА, 29,2%) и бисакриламида (бис-АА, 0,8%) которую разводили в соответствующее количество раз 1,5М Трис-НСІ буфером (рН 8,8) и водой до конечной концентрации Трис-НСІ равной 375 мМ. В смесь также добавляли 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), 0,1% APS

((NHt^Og) и 0,1% TEMED (Ы,Ы,Ы\Ы'-тетраметилэтилендиамина, Sigma,
США). Для приготовления концентрирующего геля 30% смесь А А и бис-А А
разводили до 5% 1 М Трис-HCl буфером (рН 6,8) и водой до конечной
концентрации Трис-HCl равной 125мМ. В смесь также добавляли 0,1% SDS,
0,1% (NH4)2S₂0₈h 0,1% TEMED. В работе использовали стекла 8x10см со
прокладками толщиной 0,75мм. Для проведения электрофореза использовали
Трис-глициновый электродный буфер, содержащий 25 мМ Трис-НО, 192 мМ
глицин, 0,1% SDS (рН 8,3). Электрофорез проводили при постоянном токе 10
мА в режиме концентрирования и 15 мА в режиме разделения. По окончании
^ электрофореза гель либо окрашивали, либо переносили белки на

нитроцеллголозную мембрану. Окрашивание геля проводили 0,125% (в/о) раствором Кумасси R-250 в системе этанол/уксусная кислота/вода (5/7/88).

2.3.2. Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг проводили согласно методике, описанной ранее
« (Towbin et al., 1979), после электрофореза в 12 % полиакриламидном геле

белки переносили на нитроцеллюлознуго мембрану полусухим методом в течение 1 ч при 150 мА, 20 V, Качество переноса оценивали окрашиванием части геля и окрашиванием нитроцеллюлознозной мембраны 2% раствором Понсо S. Нитроцеллюлозную бумагу далее отмывали ФСБ с Твин-20 (0,05%) и лактозой (25 мМ) 3 раза в течение 5 мин при встряхивании, инкубировали с

3% БСА в ФСБ с 0,05% Твин-20 в течение 2 ч при комнатной температуре
(все дальнейшие инкубации и отмывки проводили в ФСБ с БСА и Твином-20
и ФСБ с Твином-20 соответственно; при встряхивании). Далее мембрану
обрабатывали моноклональными антителами к 5 гистидину, мечеными
пероксйдазой хрена (Qiagen, США) в течение 1 ч при комнатной температуре
при покачивании.

* Для проявления пероксидазной реакции использовали набор ECL
(Invitrogen, США). После экспозиции на мембране (от 10 мин до 2 ч в

зависимости от интенсивности засветки) пленку проявляли и высушивали. Результаты документировали с помощью сканера.

2.3.3. Определение концентрации белка

Для определения концентрации белка использовали набор реагентов ВСА для определения белка (Pierce, США). Метод основан на использовании бисинхониновой кислоты (ВСА) и представляет собой комбинацию хорошо известного окисления Си²⁺ в Си¹⁺ белками в щелочной среде (биуретовая реакция) и высокочувствительной реакции бисинхониновой кислоты с Си (Smith et al., 1985). В соответствии с рекомендациями производителя готовили рабочий раствор, смешав ректив А и В в соотношении 50:1. На 96-луночную планшету наносили 25 мкл последовательных разведений стандартного раствора белка (1 мг/мл БСА) и образца. Добавляли по 200 мкл рабочего раствора и инкубировали 30 мин при 37 С, Абсорбцию измеряли на планшетном спектрофотометре (Bio-Rad, США) при 562 нм. По калибровочной кривой вычисляли концентрацию белка в образцах.

2.3.4. Гемягтлготинационный тест активности лектинов

В серии последовательных разведений лектина (от 100 до 1 мкг/мл в ФСБ) добавляли 2 % суспензию эритроцитов кролика (Sigma, США) в пластиковых планшетках с tZ-образными лунками. Смесь инкубировали при комнатной температуре 60-120 мин и анализировали гем агглютинацию эритроцитов по форме осадка. Отсутствие гемагглютинации характеризовалось четко очерченным пятном в самом центре лунки. При агглютинации эритроциты покрывали все дно пробирки (Луцик и др., 1981).

Для оценки специфичности реакции использовали серии последовательных разведений соответсвующих ингибиторов лектина.

2-4. Окрашивание гистологических препаратов по Шиффу и

алыдиановым синим

С помощью реакции Шиффа возможно гистохимическое выявление образуемых после окисления йодной кислотой вицинальных гидроксильных групп гликозаминогликанов, протеогликанов, гликопротеинов и гликолипидов тканей и клеток. Эту реакцию проводили в следующем порядке:

1. Де парафинировали срезы в ксилоле и проводили по растворам спиртов нисходящей концентрации (абсолютной, 96%, 90%, 80%, 70%) до воды;

2. Погружали в 1% раствор йодной кислоты на 5-10 мин или 2,5% перйодата натрия (NaJCb) на 20-30 мин;

3. Тщательно промывали в 3 порциях диет, воды (по 3-5 мин), чтобы удалить остаток йодной кислоты;

4. Помещали в реактив Шиффа на 10-20 мин;

5. Промывали в трех порциях свежеприготовленной сернистой воды (по 1-2 минуты).

6. Промывали в водопроводной воде в течение 10 мин, ополаскивали диет, водой

7. Обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заключили в полистирол. При необходимости докрашивали срезы гематоксилином.

В результате получали срезы тканей, окрашенные в пурпурный или лилово-красный цвет. Нейтральные гликозаминоглианы, протеогликаны, гликолротеины и гликолипиды дают пурпурно-красную окраску (Меркулов, 1979).

Для выявления кислых гликозаминоглианов, протеогликанов, гликопротеинов и гликолипидов использовали альциановыи синий. Для этого в свежеприготовленном растворе альцианового синего депарафинированные срезы, переведенные в воду, окрашивали 10-30 сек, после чего отмывали

излишек красителя в диет. воде. Далее по необходимости докрашивали гематоксилином, проводили дегидратацию и заключение срезов в полистирол. В результате кислые гликозаминоглианы, протеогликаны, гликопротеины и гликолипиды выявлялись как участки сине-зеленого цвета.

2.5. Окрашивание тканевых и клеточных препаратов лсктинами 2.5,1. Приготовление гистологических препаратов

Образцы опухолей толстой кишки и прилежащего эпителия, которые
были получены из операционного материала 12 пациентов Краевой
клинической больницы г. Владивостока с диагнозами высоко- и
низкодифференциро ванной аденокарциномы толстой кишки.

Предварительно морфологическое исследование материала проводили по следующей схеме:

1. Препарирование и визуальное изучение макропрепарата. Диссекция
на отдельные элементы (пластинки толщиной 1-2 см);

2. Фиксация в 5% формалине в течение суток при комнатной
температуре.

3. Изготовление тотальных препаратов:

а) диссекция фиксированных (не менее 24 ч) участков опухоли и
эпителия на более тонкие пластинки толщиной 1-4 мм (эпителий
расправляли на картонке);

б) отмывка от фиксатора в проточной водпроводной воде (2-3 ч);

в) окраска гематоксилином Караци (30 мин);

г) отбеливание в насыщенном растворе фенола в воде и отмывка в
проточной воде (1 ч) при комнатной температуре.

4. Диссекция маленьких участков ткани из тотальных препаратов.

5. Заливка отобранного материала в парафин (Меркулов, 1979):

а) обезвоживание в этаноле. Последовательная обработка в 70%(24 ч) 80% (3 ч), 90% (Зч), в 96% (3 ч) и 3 порциях абсолютного спирта в течение 1 ч в каждом;

б) обработка сместью спирт : хороформ (1 : 1) в течение 3 ч, затем в
хлороформе в течение 12 ч;

в) выдерживание в 2 порциях смеси парфин : хлороформ (1 ; 1) в
течение 2 ч в каждой порции при 37 С;

г) пропитывание парафином при 56 С в 3 сменах по 2 ч в каждой
порции;

д) изготовление парафиновых блоков по общепринятой методике
(Меркулов, 1979).

6. Изготовление срезов толщиной 5-7 мкм на санном микротоме по общепринятой методике (Меркулов, 1979).

7. Депарафинирование в 2 порциях ксилола по 3 мин в каждой.

8. Окрашивание гематоксилином Эрлиха (Меркулов, 1979) сразу для верификации материала и/или окрашивание лектином, конъюгированным с пероксидазой хрена.

Для исследования нервной ткани использовали 20 крыс обоих полов линии Вистар весом 220 — 270 г. Животных анестезировали внутрибрюшинным введением тиопентала натрия (40 мкг/мл, 0,5 мл на одного животного). Для удаления крови надрезали сердечный желудочек, после чего животное умерщвляли. Далее препарировали спинномозговые ганглии грудного, поясничного и крестцового отделов позвоночного столба. Свежие образцы ткани помещали в среду для заключения криопрепаратов Tissue Тек OCT (Baxter Scientific, США) в течение 15-20 минут и замораживали в криостате при -20 С. Полученные срезы фиксировали в ацетоне 30-40 мин и хранили при -20 С не более 2 недель.

2,5.2, Получение конъюгата CGL с пероксидазой хрена

Конъюгат CGL с пероксидазой хрена получали по методу (Луцик и др., 1989). К 2 мг пероксидазы хрена (Sigma, США) в 500 мкл воды добавляли 100 мкл ОД М NaJ04. Смесь инкубировали 30 мин в темноте, затем диализовали против 1 мМ ацетатаного буфера (рН 4,4) при + 4 С. К 1 мг

6t CGL в 500 мкл 0,1 M карбонатного буфера (рН 9,5) добавляли галактозу до конечной концентрации 0,1 М и 500 мкл окисленной пероксидазы хрена. Инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляли 50 мкл 0,2 М NaBI-Li (Sigma, США) и инкубировали 2 ч при комнатной температуре, диализовали против ФСБ 12 ч при + 4 С. Для стабилизации добавляли равный объем глицерина и хранили при -20 С.

2.5.3. Окрашивание препаратов конъюгатами лектинов

Gal/GalNAc-специфичный лектин (CGL) получен в гомогенном состоянии биоспецифической хроматографией экстракта мантии мидии Crenomytilus grayanus на частично гидролизованной сефарозе с последующей гельфильтрацией на сефакриле С-200 в лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО (РАН) (Belogortseva et al., 1998). oc-D-Gat-специфичный лектин (Sigma, США) бандерейи GS-IB4, меченый биотином, любезно предоставлен студентом J. Petruska из университета штата Флорида (США).

Для окрашивания гистологических препаратов были получены конъюгаты лектинов с пероксидазой хрена.

Буферные растоворы для разведения пероксидазных конъюгатов: 0,05 М Трис-HCl, рН 7,4 (ТБС )для разведения конъюгата CGL 0,05 М фосфатно-солевой буфрный (ФСБ) раствор с 0,1 мМ СаСЬ, MgCl₂, МпСЬ, рН 7,4 (ФСБК) для разведения конъюгата GS-TB₄.

Использовали 3,3' - диаминобензидин тетрахлорид (ДАБ) (Sigma, США) - как хромоген для визуализации реакции связывания лектинов с компонентами среза. Непосредственно перед нанесением на срез готовили раствор, содержащий 0,05 мг/мл ДАБ в буферном растворе ФСБК с 0,015% Н₂0₂.

При использовании конъюгатов CGL с пероксидазой хрена окрашивание срезов различных тканей проводили по так называемому «прямому методу». После депарафинирования в ксилоле срезы обрабатывали в 1% Н^Ог в

течении 30 мин для блокирования эндогенной пероксидазы. В случае срезов, полученных на криостате, после размораживания срезы непосредственно инкубировали с раствором перекиси водорода Н2О2. Оптимальные концентрации лектинов в инкубационной среде представлены в табл. 9.

Для предотвращения подсыхания срезы при инкубации их в растворе конъюгата лектина использовали миникамеру, состоящую из 2 прямоугольных стекол размером 20x30x0,6 см и расположенных по периметру резиновых прокладок, позволяющих получить просвет 7 мм между стеклами. На нижнем стекле располагали пластиковую сетку, чтобы предметные стекла не «прилипали» к нижнему стеклу инкубационной камеры.

Между верхним стеклом такой инкубационной камеры и наслоенным на

Таблица 9. Оптимальные разведения конъюгатов лектинов для окрашивания срезов.

предметные стекла раствором (3-4 мм) срезы не высыхали в такой камере даже в течение нескольких дней. Оптимальное время инкубации гистологических препаратов с растворами конъюгатов лектинов 12 часов. Затем убирали излишек раствора конъюгата лектина стряхивали со среза и промывали ФСБК 3x3 мин. После такой отмывки, убрав излишки буферного раствора фильтровальной бумагой, наносили на срезы

предварительно приготовленный раствор ДАБ. Активность пероксидазы и соответственно локализацию связанного с гликоконъюгатами лектин а определяли по коричневым отложениям продуктов окислительной полимеризации ДАБ. Время проявления составляло 7-10 мин.

В случае использования лектина GS-IB^ меченого биотином, применяли так называемый «непрямой» метод окраски гистологических препаратов. Суть его состоит в том, что для выявления рецепторов лектинов после инкубации с его би оти новым конъюгатом в течение 2 ч. лектин отмывали в ФСБК в течение 1 ч. Затем наносили раствор конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена и инкубировали 45 мин. Затем вновь отмывали в 3 х 3 мин ФСБК и проявляли субстратом как в предыдущем случае.

По необходимости гистологические препараты докрашивали гематоксилином. Далее препараты обезвоживали в этаноле и заключали в полистирол по общепринятой методике (Меркулов, 1979).

Для контроля специфичности реакции использовали следующие процедуры:

1. обработку срезов субстратом, и/или вся стандартная окраска по прямому и непрямому методу с исключением лектина из процесса окраски;

2. инкубацию в растворе перйодата натрия (2,5 г NaJ0₄ на 100 мл дистиллированной воды) и стандартное окрашивание лектином;

3. добавление в инкубационную среду лектина ингибирующего сахара в различных концентрациях (табл. 10).

Для CGL указаны 2 ингибирующие концентрации, поскольку 30 мМ раствор галактозы дает лишь частичную отмену реакции связывания, но характерную для определенных клеточных структур.

Были использованы различные модификации стандартной окраски лектинами:

1) предварительная обработка срезов муравьиной кислотой (рН 1,2) в течение часа при 37 для удаления концевых остатков сиаловых

Таблица 10. Разведения конъюгатов лектинов.

2. кислот. Далее отмывка в 3 порциях ФСБК и стандартная окраска лектинами;

3. добавление в раствор CGL 30 мМ галактозы для ингибирования реакции с лигандами, обладающими более низкой аффинностью;

4. предварительная инкубация со 100 мМ раствора галактозы в диет, воде в течение 3 ч для удаления возможно закрытых эндогенными лектинами участков связывания гликоконъюгатов. Далее отмывка в 3 порциях ФСБК и стандартная окраска лектинами;

5. Предварительная инкубация в смеси Фолча (хлороформ : метанол -3:1 с небольшым количеством воды) в течении 24 ч при 37С для растворения гликолипидов. Далее отмывка в 70% этаноле, ФСБ и обычная окраска конъюгатами.

Для анализа микропрепаратов использовали микроскоп «Биолам» Р-11 (Ломо, г. Ленинград) и фотонасадку. Срезы из парафиновых блоков получали на санном микротоме МС-2 (г. Харьков). Микропрепараты фотографировали цифровой видеокамерой (Sony, Япония).

2.6. Получение рекомбинантного галектина-3 2.6.1. Клонирование белка

Плазмиды рОТВ7, несущие полную последовательность галектина-3 человека (рис.9) (Invitrogen, IMAGE ID: 3050135) были получены из бактерий Е. соН, которые наращивали в среде Миллера (Sigma).

1-60 atggcagacaatttttcgctccatgatgcgttatctgggtctggaaacccaaaccctcaa 1-20 MetAlaAspAsnPheSerLeuHisAspAlaLeuSerGlySerGlyAsnProAsnProGln

61-120 ggatggcctggcgcatgggggaaccagcctgctggggcagggggctacccaggggcttcc 21-40 GlyTrpProGlyAlaTrpGlyAsnGlnProAlaGlyAlaGlyGlyTyrProGlyAlaSer

121-160 tatcctggggcctaccccgggcaggcacccccaggggcttatcctggacaggcacctcca 41-60 TyrProGlyAlaTyrProGlyGlnAlaProProGlyAlaTyrProGlyGlnAlaProPro

181-240 ggcgcctaccatggagcacctggagcttatcccggagcacctgcacctggagtctaccca 61-30 GlyAlaTyrHisGlyAlaProGlyAlaTyrProGlyAlaProAlaProGlyValTyrPro

241-300 gggccacccagcggccctggggcctacccatcttctggacagccaagtgcccccggagcc 81-100 GlyProProSerGlyProGlyAlaTyrProSerSerGlyGlnProSerAlaProGlyAla

301-360 taccctgccactggcccctatggcgcccctgctgggccactgattgtgccttataacctg

101-120 TyrProAlaThrGlyProTyrGlyAlaProAlaGlyProLeuIleValProTyrAsnLeu

361-420 cctttgcctgggggagtggtgcctcgcatgctgataacaattctgggcacggtgaagccc

121-140 ProLeuProGlyGlyValValProArgMetLeuIleThrlleLeuGlyThrValLysPro

421-430 aatgcaaacagaattgctttagatttccaaagagggaatgatgttgccttccactttaac

141-160 AsnAlaAsnArglleAlaLeuAspPheGlnArgGlyAsnAspValAlaPheHisPheAsn

431-540 ccacgcttcaatgagaacaacaggagagtcattgtttgcaatacaaagctggataataac

161-180 ProArgPheAsnGluAsnAsnArgArgVallleValCysAsnThrLysLeuAspAsnAsn

541-600 tggggaagggaagaaagacagtcggttttcccatttgaaagtgggaaaccattcaaaata

181-200 TrpGlyArgGluGluArgGlnSerValPheProPheGluSerGlyLysProPheLysIle

601-660 caagtactggttgaacctgaccacttcaaggttgcagtgaatgatgctcacttgttgcag

201-220 GlnValLeuValGluProAspHisPheLysValAlaValAsnAspAlaHisLeuLeuGln

661-720 tacaatcatcgggttaaaaaactcaatgaaatcagcaaactgggaatttctggtgacata

221-240 TyrAsnHisArgValLysLysLeuAsnGluIleSerLysLeuGlylleSerGlyAspIle

721-750 gacctcaccagtgcttcatataccatgata

241-250 AspLeuThrSerAlaSerTyrThrMetlle

Рис. 9. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности рекомбинантного галеісгина-3 человека.

Для выделения плазмид использовали набор реактивов (Qiagen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. На рис. 9 представлена полная нуклеотидная и аминокислотная последовательность галектина-3 человека. С помощью программы MacVector (Cambridge, США) и представленных на рис. 9 аминокислотной последовательности белка, были получены оптимальные праймеры для полного галектина-3 (табл. 11). Параметры полимеразной цепной реакции (ГЩР) представлены в табл. 11 в соответствии с рекомендациями фирмы (Stratagene, США).

Терминальные GGATCC и AAGCTT представляют собой последовательности специфичные для рестрикционных эндонуклеаз BAMHI и HINDI1I (рис. 10). ГТЦР продукты для полного галектина-3 были очищены в агарозном геле и лигированы в PCR 2.1 ТОРО (ТОРО ТА набор реактивов

СЫЕ1

Рис. 10. Строение вектора экспрессии pQE-80 (Qiagen). Кодирующая ДНК (кДНК) для галектина-3 лигирована по ВАМН I и HIND III участку MCS (multiple cloning site). ATG - стартовый кодон, RBS - участок связывания рибосом, lac О - оператор, РТ5 - промотор Т5, 6xHis - 6 гистидинов, Stop Codons - стоп кодоны, Ampicillin - ген резистентности к ампициллину, ColEl - репликативный участок Е. coli, lac I⁴ - репрессор lac.

Таблица 11. Параметры ГЩР. Реакционная смесь.

Термический цикл.

Праймеры

Полная

последовательность

галектина-3

# I 5' CTCTGGATCC ATGGCAGAC AATTTTTCG 3'

#2 5' GCGGAAGCTTTTATATCATGGTATATGAAGC 3*

для клонирования, Qiagen, США). 6 трансформированных клонов E.coli, которые выращивали на среде Миллера с 50 м кг/мл ампицилина использовали для получения плазмид.

Плазмиды из каждого клона секвенировали и образцы с нужными последовательностями использовали для последующей обработки

рестрикционными эндонуклеазам ВАМНЇ и HTNDIII. После очистки от фермента в агарозном геле по стандартной методике (Qiagen) кодирующую ДНК лигировали по BAMHI/ HINDU I сайту плазмиды для экспрессии белков pQE-80 (рис. 10).

2.6.2. Экспрессия рекомбинантных белков

ТорЮ компетентные клетки Е.соН (Invitrogen, США) трансформировали плазмидами pQE-80, содержащими кДНК галектина-3:

1. Компетентные клетки ТорЮ (Invitrogen, США) и ДНК размораживали на льду.

2. Стерильно добавляли плазмидную ДНК (ОД мкг ДНК в 2 мкл воды) к 50 мкл компетентных клеток и инкубировали на льду 20 мин.

3. Бактерии подвергали термошоку 45 сек при 42 С и немедленно опускали в лед на 2 мин, после чего бактерии наращивали в 0,5 мл среды SOC (Invitrogen, США) 1 ч при 37 С.

4. 100 мкл каждого образца наносили на чашки Петри с агаром (14 г/л),
приготовленном на среде Миллера с добавлением 100 мкг/мл ампицилина.
Бактерии инкубировали при 37 С 12-14 ч.

Отдельные колонии трансформированных Е. соН использовали для продукции и последующей очистки рекомбинантного белка по следующей методике:

4. Одну колонию Е. coli помещали в 20 мл среды Миллера с ампициллином (100 мкг/мл) и инкубировали 12 ч при 37 С во встряхивателе при 200 об/мин.

5. Полученную миникультуру бактерий переносили в 2 л среды Миллера с антибиотиком и наращивали 5-6 ч до OD₆₀o = 0,5. Добавляли 200 мкл маточного раствора ампициллина (100 мг/мл) и 200 мкл маточного раствора 0,01 М IPTG (Sigma, США) для индукции экспрессии рекомбинантного белка.

3. Инкубировали при встряхивании 5 - 6 ч при 37 С, затем культуру
переносили в холодильник на +4 С и икубировали дополнительно в течение
суток.

4. Бактерии центрифугировали при 8000g, 15 мин. при +4 С, образующийся
осадок замораживали и хранили при -80 С либо непосредственно
использовали для выделения белка.

2.6.3. Аффинная хроматография белков на Ni-агарозе

Для получения рекомбинантого галектина-3 использовали метод, основанный на специфичном взаимодействии участка из б гистидинов с никелем, который связан с хелатором - нитрилуксусной кислотой, ковалентно присоединенной к агарозе. Следовательно, все рекомбинантные белки содержат дополнительно 6 гистидинов на N- конце полипептидной цепи, благодаря соответствующей кодирующей последовательности плазмиды pQE-80 (рис. 4). Пептид из 6 гистидинов имеет нейтральный заряд при физиологических условиях и обычно не изменяет свойств белка, поэтому не требует последующего удаления. Процедуру осуществляли в следующей последовательности:

1. Бактерии экстрагировали лизирующим буфером (20 мМ Трис-НС1, 30
мМ NaCl, 0,5% Тритона Х-100, 1 мМ PMSF, рН 8,0) на льду, облучали
ультразвуком 6x30 сек (200 W).

2. Смешивали Ni-агарозу с экстрактом в расчете 300-400 мкл суспензии Ni-агарозы на 50 мл экстракта на роторном смесителе I час при +4 С.

3. Ni-агарозу осаждали слабым центрифугированием (1000 g) 5 мин. Супернатант снимали, Ni-агарозу ресуспендировали в отмывочном буфере (20 мМ PIPES, 0,5 М NaCl, 0,5% Тритона Х-100, 1 мМ PMSF, 15 мМ имидазола, рН 8,0).

4. После 5 циклов отмывки белок элюировали 250 мМ имидазола в 20 мМ PIPES с 0,5М NaCl, рН 8,0.

5. Белок переводили в фосфатно-солевой буфер ФСБ и концентрировали на центрифужных концентраторах Centricon-20 (Fisher Scientific, США). Аликвоты белка замораживали и хранили при -80С.

6. Концентрацию белка в образцах определяли по Смиту (Smith et al., 1985).

2.6.4. Получение конъюгата белков с флюоресцентной меткой

Готовили маточный раствор FITC в диметилсульфоксиде с концентрацией 1 мг/мл. Реакцию проводили в течение ночи при +4 С в 0,5

_% М карбонатном буферном растворе в присутствии 40 мМ лактозы при

концентрации белков не менее 1 мг/мл таким образом, что 100 мкг FITC прореагировали с 1 мг белка при +4 С в течение 12 часов. Реакцию останавливали добавлением 0,5 М Трис-HCI. Несвязавшийся FITC отделяли в ФСБ на колонке сефадекса G-25. После этого образцы концентрировали в Centricon-Plus 20 (Amicon, США). Интенсивность включения метки

щ оценивали на спектрофлюориметре.

2.6.5. Получение галектнна-3 без гистидиновой (6HisTag) метки

Плазмиды PUC19 с кодирующей последовательностью галектина-3 человека были очищены из линии HMS174 E.coli и субклон ированы в B121(DE3) (Novagen, США) в соответствии с рекомендациями производителя

(Novagen). Затем рекомбинантный галектин-3 человека был выделен и очищен, как описано ранее (Ochieng et al., 1993). Бактерии, полученные по методике, описанной для экспрессии белков с гистидиновой меткой (6 HisTag), лизировали в буферном растворе (50 мМ Trts, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% DOC, 0,1% SDS, рН 8,0). Экстракт центрифугировали при 8000 g, 30 мин. Супернатант инкубировали с асиалофетуин-агарозой. Для получения

конъюгата асиалофетуина с агарозой использовали Аффигель-15 в соответствии с рекомендациями производителя. После отмывки в буферном растворе (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин-20, рН 8,0),

связанный белок элюировали 0,1 М раствором лактозы, переводили в ФСБ и концентрировали на центрифужных концентраторах Centricon-20 (Fisher Scientific, США). Аликвоты белка замораживали и хранили при -80С. Концентрацию белка в образцах определяли по Смиту (Smith et al., 1985).

2.7. Анализ эндоцитоза Рі-интегринов на флюоресцентном сортировщике

клеток (FACS)

Общая схема FACS приведена на рис. 11. В работе были использованы

Анализируемая смесь клеток

Преломляющие овет призмы

Регистратор

красной

флюоресценции

Регистратор

зеленой

}>люоресценции

Регистратор от рале иного гранулярными

клетками лазерного света

Регистратор

лазерного пучка

(позволяет

определить

размеры клеток)

Сепаратор,

позволяющий

Похожие диссертации на Новые свойства углеводсвязывающих белков: лектина из мидии Crenomytilus grayanus и галектина-3 человека

Физико-химические и шапероноподобные свойства малого белка теплового шока Hsp22 человекаКазаков Алексей Сергеевич

Исследование структуры и свойств флуоресцентных химер малых белков теплового шока человекаДацкевич Петр Николаевич

Связывание рибосомных белков S5 и S16 человека с участком 1203-1236/1521-1698 3`-концевого домена 18S pРНКЯньшина Дарья Дмитриевна

Полиморфизмы генов миогенного фактора 6 и альфа-актинина-3 и их ассоциация со структурой и функцией скелетных мышц человекаДружевская Анастасия Михайловна

Выделение и изучение свойств супероксиддисмутазы человека из рекомбинантного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiaeДроздова, Юлия Игоревна

Роль аналога аденозина в изменении фенотипических свойств дендритных клеток человека моноцитарного происхождения при бронхиальной астмеГоремыкин, Константин Викторович

Определение структуры и динамических свойств комплексов дигидрофолатредуктазы человека и L.Casel с антибактериальным препаратом триметопримомКовалевская Надежда Владимировна

Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на свойства мезенхимальных стволовых клеток человека. Чвартацкая Оксана Викторовна

Нарушения свойств связывающих центров сывороточного альбумина при заболеваниях человекаАндреева, Оксана Леонидовна

Исследование иммунохимических и биохимических свойств N-концевого фрагмента предшественника натрийуретического пептида В-типа человекаСеферян Карина Рубеновна