Митохондриальная пальмитат/Ca2+- активируемая циклоспорин A- нечувствительная пора: свойства и возможная физиологическая значимость Белослудцева Наталья Валерьевна

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Белослудцева Наталья Валерьевна. Митохондриальная пальмитат/Ca2+- активируемая циклоспорин A- нечувствительная пора: свойства и возможная физиологическая значимость : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04 / Белослудцева Наталья Валерьевна; [Место защиты: Ин-т биофизики клетки РАН].- Пущино, 2008.- 114 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/311

Введение к работе

Актуальность проблемы. Ионы кальция, как известно, являются одним из ключевых регуляторов внутриклеточных, и, в частности, митохондриальных процессов. Однако избыточное накопление этих ионов в митохондриях может привести к появлению неспецифической проницаемости внутренней мембраны органелл и последующей клеточной гибели (Zoratti et al., 2005; Bernardi et al., 2006). Поэтому изучение процессов, связанных с нарушением мембранной проницаемости митохондрий при аккумуляции этими органеллами ионов Са²⁺, является весьма актуальной проблемой.

Согласно современным представлениям, возникновение неселективной проницаемости мембран митохондрий связано с образованием Са²⁺-активируемой поры, или MPT (Mitochondrial Permeability Transition pore). Традиционная точка зрения на природу этого процесса состоит в том, в присутствии Са²⁺ происходит открытие мультибелкового трансмембранного мегаканала, способного пропускать вещества с м.м. < 1.5 кДа, а также ингибироваться циклоспорином А (ЦсА) (Zoratti and Szabo, 1995; Zoratti ct al., 2005; Halestrap, 2006; Leung et al., 2008). Однако недавно было показано, что пальмитиновая кислота (ПК) и низкие концентрации Са²⁺ вызывают открытие ЦсА-нечувствительной митохондриальной поры, механизм образования которой, вероятно, отличается от общепризнанного (Sultan and Sokolove, 2001).

В нашей лаборатории развивается представление о том, что митохондриальная пора, активируемая пальмитатом и Са ⁺, имеет липидную природу (Mironova et al., 2001, 2004; Белослудцев и др., 2005). В основе этого предположения лежит тот факт, что ПК обладает способностью связывать Ca^2f со сродством, которое на 1-2 порядка выше, чем сродство ненасыщенных жирных кислот, фосфолипидов и других липидов, и сравнимо со сродством к Са ⁺ рада белков (Mironova et al., 2001). Механизм образования поры может быть объяснен в свете полученных недавно данных о том, что связывание анионов ПК с Са²⁺ в модельной мембране вызывает фазовую сегрегацию жирной кислоты в твердые мембранные домены. Это ведет к фазовому переходу в липидном бислое и формированию липидных пор (Agafonov et al., 2007). В соответствии с теорией образования липидных пор, пальмитат/Са ⁺-активируемая пора способна самопроизвольно закрываться.

Несмотря на весомые доказательства липидной природы пальмитат/Са²⁺-активируемой поры, механизмы регуляции поры до конца неясны. В связи с этим, особый интерес представляет выяснение вопроса, как липидное окружение влияет на образование поры в мембране.

Актуальность изучения функционирования и регуляции липидной короткоживущей пальмитат/Са²⁺-активируемой поры в митохондриях связана с тем, что пора может играть ключевую роль в целом ряде физиологических и патологических процессов. Так, показано, что открытие этой поры в митохондриях может иметь непосредственное отношение к механизму пальмитат-индуцированного апоптоза (Belosludtsev et al., 2006), обнаруженного недавно в культуре клеток (Kong and Rabkin, 2000). Предполагается также, что Са²⁺-активируемая пора может функционировать и при физиологических

условиях, когда необходим быстрый выброс Са из митохондрий. В этом случае функционирование короткоживущей поры может приводить к колебанию ионных потоков через внутреннюю митохондриальную мембрану, которые наблюдают при добавлении к клеткам и суспензии митохондрий ионов Са²⁺ или Sr²⁺ (Evtodienko et al., 1994).

Следует подчеркнуть, что концентрация свободной ПК, необходимая для образования ЦсА-нечувствительной поры в митохондриальных мембранах, близка к таковой при физиологических условиях (Le-Quoc and Le-Quoc, 1989; Mironova et al., 2004). Более того, уровень пальмитата в митохондриях может увеличиваться при изменении физиологического состояния организма и при некоторых патологиях, в частности при ишемическом повреждении тканей (Vork et al., 1993; Mironova et al., 2004), диабете (DeFronzo et al., 2004) и других. Это позволило предположить, что образование пальмитат/Са²⁺-активируемой поры в митохондриях может усиливаться при изменении физиологических условий, а также при патологиях.

Целью настоящей работы является изучение свойств митохондриальной пальмитат/Са²⁺-активируемой циклоспорин А-нечувствительной поры и выяснение ее возможной физиологической значимости.

Задачи исследования:

Исследовать свойства пальмитат/Са²⁺-активируемой поры, а именно влияние на процесс образования поры в мембране липидов - холестерина и кардиолипина, а также модификации SH-групп митохондриальных белков.
Изучить возможность рециклизации ионов Са²⁺ в митохондриях при образовании пальмитат/Са²⁺-активируемой поры как в присутствии добавленной пальмитиновой кислоты, так при накоплении эндогенных жирных кислот в результате активации фосфолипазы А₂.
Определить возможность выхода из митохондрий апоптоз-идуцирующего фактора (АИФ) в условиях образования пальмитат/Са²⁺-активируемой поры.
Определить влияние ненасыщенных жирных кислот, предупреждающих вызываемый пальмитатом апоптоз в культуре клеток, на образование пальмитат/Са²⁺-активируемой поры в митохондриях и липосомах.
Исследовать параметры функционирования митохондриальной пальмитат/Са²⁺-активируемой поры в зависимости от типа ткани, возраста животного, а также его устойчивости к условиям гипоксии.

Научная новизна работы. В работе впервые показано, что формирование в мембране пальмитат/Са²⁺-активируемой поры усиливается в присутствии кардиолипина, а кардиолипин-связывающий агент, ЮМ-нонил акридиновый оранжевый, ингибирует открытие поры в митохондриях, не оказывая при этом существенного влияния на параметры дыхания и поглощение Са²⁺ органеллами. Впервые установлено, что холестерин, встроенный в мембраны липосом и митохондрий, облегчает образование в них пальмитат/Са²⁺-индуцируемой поры, в то время как модификация SH-rpynn митохондриальных белков дитиотреитолом и тимеросалом не влияет на ее открытие. Предложена новая модель функционирования кальциевого цикла в митохондриях, в котором вход иона осуществляется через Са²⁺-унипортер, а

выход - через временно образующиеся в мембране липидные поры, индуцируемые ПК и Са²⁺. Рециклизацпя ионов Са²⁺ при открытии таких пор может происходить как в условиях добавленной жирной кислоты, так и при ее вероятном образовании в случае активации фосфолипазы Аг- Впервые показано, что в результате открытия поры происходит выход из митохондрий апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ), что может быть индикатором участия иальмитат-активируемой поры в механизме каспаз-независимой гибели клетки. Установлено, что чувствительность митохондрий печени крысы к индукторам поры - ПК и Ca^2t - усиливается с возрастом и при адаптации животного к условиям гипоксии. Митохондрии сердца крысы также подвергаются ЦсА-нечувствителыюму пальмитат/Са²⁺-индуцирусмому набуханию, вызванному образованием поры, однако по сравнению с митохондриями печени, это набухание имеет меньшую амплитуду и скорость.

Научно-практическое значение работы. Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах функционирования митохондрий в норме и при патологиях, связанных с нарушением кальциевого гомеостаза клетки и накоплением свободных жирных кислот. Результаты диссертации могут быть использованы в фундаментальных исследованиях в области биоэнергетики, а также в дальнейшем найти применение в медицине при разработке фармакологических препаратов, так как в настоящее время показано, что повышение уровня насыщенных жирных кислот, в первую очередь пальмитиновой, и Са ⁺-зависимая митохондриальная пора вовлечены в индукцию ряда патофизиологических явлений, таких как апоптоз, ишемия, нейродегенеративные заболевания, диабет и другие.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 4 и 5-ой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005, 2008); XX Съезде Физиологического Общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); 8 - 12-ой школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2004-2008); на международных конференциях Biological motility (Pushchino, 2008); «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005, 2007); FEBS Congress (Poland, 2004; Austria, 2007); International Conference «Mitochondrial Physiology» (Austria, 2005; London, 2007); VIII World Congress International society for adaptive medicine (ISAM) (Moscow, 2006); 2^nd Symposium International Nutrition (Paris, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 5 таблицами. Список литературы включает 255 наименований.