Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Исторические данные 9
1.2. Характеристика возбудителя инфекции Е. coli 0157:Н7 11
1.3. Эпизоотологические данные о возбудителе инфекции Escherichia coli 0157:Н7 18
1.4. Патогенез 27
1.5. Клинические признаки заболеваний, вызванных Е. coli 0157:Н7 30
1.6. Диагностические методы исследований Е. coli 0157:Н7 36
1.7. Профилактика и лечение заболеваний вызванных Е. coli 0157:Н7 40
1.8. Заключение по обзору литературы 42
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 45
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
3.1. Усовершенствование методики выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157 из биологического материала от сельскохозяйственных и мелких домашних животных 49
3.2. Частота выделения Е. coli 0157:Н7 из различных экологических ниш 55
3.2.1. Частота выделения Е. coli 0157:Н7 из биологического материала от сельскохозяйственных животны 56
3.2.2. Частота выделения Е. coli 0157:Н7 от мелких домашних животных и пушных зверей 59
3.2.3. Частота выделения Е. coli 0157:Н7 от птицы 60
3.2.4. Частота выделения Е. coli 0157:Н7 от людей 61
3.3. Сезоннсть выделения Е. coli 0157:Н7 62
3.4. Изучение фенотипических свойств 64
3.4.1. Изучение морфологических свойств выделенных изолятов 64
3.4.2. Изучение биохимических свойств Е. coli 0157:Н7 65
3.4.3. Изучение биохимической вариабельности Е. coli внутри серотипа0157 69
3.4.4. Изучение патогенных свойств культур Е. coli 0157:Н7, выделенных от животных и человека 73
3.4.5. Изучение антибиотикорезистентности изолятов Е. coli 0157:Н7, выделенных от животных и птицы 79
3.5. Изучение эпизоотической значимости носительства Е. coli 0157:Н7 у мелких домашних животных 84
3.6. Изучение патогенности изолятов Е. coli 0157-.Н7, выделенных от крупного рогатого скота, для мелких домашних животных 86
4. ОБСУЖДЕНИЕ 88
ВЫВОДЫ 98
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 100
ЛИТЕРАТУРА 101
ПРИЛОЖЕНИЕ 124
- Характеристика возбудителя инфекции Е. coli 0157:Н7
- Частота выделения Е. coli 0157:Н7 из биологического материала от сельскохозяйственных животны
- Изучение биохимических свойств Е. coli 0157:Н7
Введение к работе
Болезни желудочно-кишечного тракта (гастроэнтериты, гастроэнтеро-колиты), вызываемые токсинами эшерихий, распространены повсеместно и поражают сельскохозяйственных животных различных видов, поэтому представляет одну из сложных проблем для современной ветеринарии. В последние годы во многих развитых странах колибактериоз находится под пристальным вниманием ветеринарных и медицинских специалистов, а также Всемирной организации здравоохранения, так как важную роль в инфекционной патологии человека и животных стали играть эшерихий, вырабатывающие Шига-подобные токсины (веротоксины), в том числе и Е. соН 0157:Н7 (А.В. Куликовский, А.Н. Панин, 1997). Данный серотип кишечной палочки приводит к возникновению у людей геморрагического колита, который может осложниться гемолитико-уремическим синдромом (ГУС) и тромботической тромбоцитопенической пурпурой (ТТП), а у молодняка крупного рогатого скота - диареи с признаками геморрагического гастроэнтерита и отечной болезни у свиней (Ю.Г. Степашин, Э.А. Светоч и ДР-, 2005).
Современная проблема пищевых зоонозов связана с продукцией, полученной главным образом от внешне здоровых животных, прошедшей в полном объеме ветеринарно-санитарную экспертизу и вторично контами-нированной в процессе получения, транспортировки, переработки, хранения, реализации и потребления (А.В. Куликовский, 2007).
Несмотря на достаточно широкое изучение Е. coli 0157:Н7 в медицине, в ветеринарии проведены отдельные исследования по выявлению частоты выделения и бактерионосительства данного микроорганизма среди различных видов животных, птицы и человека. При этом пока нет достаточных данных о патогенных свойствах Е. coli 0157:Н7 и резистентности к
антибактериальным препаратам. В России отсутствуют данные о носи-тельстве Е. coli 0157:Н7 среди мелких домашних животных.
Также в ветеринарии не совершенна бактериологическая методика выделения и идентификации Е. coli 0157:Н7 из биологического материала.
В связи с этим возникает необходимость изыскания новых подходов к профилактике инфекций, вызванных Е. coli 0157:Н7, и борьбе с ней. Для этого требуется комплексный подход к изучению широкого спектра биологических свойств возбудителя и совершенствование бактериологического метода выделения и идентификации Е. coli 0157:Н7.
Цель работы - изучить фенотипические свойства и эпизоотологиче-скую значимость Е. coli 0157:Н7.
Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
Определить частоту выделения Е. coli 0157:Н7 из различных экологических ниш.
Изучить биологические свойства изолятов Е. coli 0157:Н7.
Изучить биохимические свойства и их вариабельность.
В экспериментальных условиях изучить эпизоотическую значимость носительства Е. coli 0157:Н7 у мелких домашних животных.,
Научная новизна.
Получены данные о частоте выделения Е. coli 0157:Н7 из различных экологических ниш.
Впервые на территории России установлена эпизоотологическая значимость бактерионосительства у собак и кошек.
Получены данные о восприимчивости мелких домашних животных к Е. coli 0157:Н7.
Установлена вариабельность биохимических свойств выделенных изолятов, свидетельствующая о генетической разнородности популяции Е. coli 0157:Н7.
Теоретическая и практическая ценность работы.
Усовершенствована методика выделения и идентификации энтероге-моррагической кишечной палочки серотипа 0157:Н7 из биологического материала от животных.
Оформлена заявка на патент «Способ выделения и идентификации эн-терогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157:Н7 в биологическом материале от животных», № 2006141983 от 27.11.2006.
Получено свидетельство в ФГУ ФИПС об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2007613064 от 18 июля 2007 г. Экспертная система «Биохимия микроорганизмов 2.0».
Подготовлены методические рекомендации по выделению и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157:Н7 из биологического материала животных и птицы, утвержденные Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол № 3 от 30 октября 2007 г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии протокол №3 от 30 октября 2007 г.
Апробация работы.
Материалы исследований доложены на заседаниях Ученого совета ГНУ ИЭВСиДВ (2004-2007 гг.), на Сибирском международном ветеринарном конгрессе (Новосибирск, 2005 г.), на международной научно-практической конференции (Барнаул, 2005 г.), на VI Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2006 г.), на второй Международной научно-практической конференции молодых ученых (Новосибирск, 2006 г.), на международной научно-практической конференции (Москва, 2006 г.), на международной конференции (Ульяновск, 2006 г.), на третьей Российской научно-практической конференции с международным участием (Новосибирск, 2006 г.), на международной научно-практической
конференции (Новосибирск, 2006 г.), на VIII Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 работы в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ ("Сибирский вестник сельскохозяйственной науки" и "Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук").
Объем и структура диссертации.
Работа изложена на 123 страницах и включает введение, обзор литературы, заключение по обзору литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 15 рисунками. Список литературы включает 201 источник, в т.ч. 140 - зарубежных авторов.
Внедрение результатов исследования.
Результаты исследований внедрены в учебный процесс в Новосибирском государственном аграрном университете, Иркутском государственном аграрном институте при подготовке ветеринарных специалистов.
Основные положения, выносимые на защиту.
усовершенствование методики выделения и идентификации энтеро-геморрагической кишечной палочки 0157:Н7 из биологического материала;
результаты исследований по частоте выделения Е. coli 0157:Н7 из различных экологических ниш;
биологическая характеристика изолятов Е. coli 0157:Н7, выделенных от различных видов животных и человека;
эпизоотическая значимость носительства Е. coli 0157:Н7 у мелких домашних животных.
Характеристика возбудителя инфекции Е. coli 0157:Н7
Элективными являются среды Эндо, Левина. Селективной средой для выделения и идентификации Е. coli серотипа 0157:Н7 является среда с сор-битолом (сорбитол Е. coli 0157:Н7 агар, Sorbitol MacConkey Agar) (Б.И. Антонов, 1986; А.А. Султанов, 2000; W.H. Ewing, 1986; F. Orskov, 1987).
При культивировании в МПБ Е. coli 0157:Н7 вызывает равномерное помутнение среды с образованием беловатого осадка, пристеночного кольца или нежной плёнки на поверхности, легко разбивающихся при встряхивании (Б.И. Антонов, 1986; К.А. Bettelheim, 1994).
На МЛА Е. coli 0157:Н7 через 18-24 часов формирует круглые, выпуклые колонии средней величины, прозрачные в проходящем свете. Возможно образование мелких прозрачных колоний, напоминающих колонии шигелл или сальмонелл, а также крупных слизистых колоний, похожих на колонии клебсиелл (О. А. Полякова, 1976; Методические указания, 2001).
На среде Эндо Е. coli 0157:Н7 образует выпуклые, круглые, сочные малиново-красные колонии средней величины с металлическим блеском, гладкой поверхностью и ровными краями. На среде Левина (агаре с эозином и метиленовой синькой) кишечная палочка растет в виде темно-фиолетовых или черных колоний. Изменяет цвет SDS-бульона с зеленого на желтый (А. А. Султанов и др, 2000).
На среде с сорбитолом Е. coli 0157:Н7 образуют круглые, выпуклые, влажные, прозрачные бесцветные или слабо-розовые колонии диаметром 1,5-2,5 мм (Методические указания, 2001).
Характерной биохимической особенностью энтерогеморрагических кишечных палочек серотипа О 157:Н7, в отличие от других Е. coli, является отсутствие способности продуцировать фермент P-D-глюкуронидазу (95% штаммов) и расщеплять сорбитол (Ю.Г. Степашин, В.В. Гусев и др., 2005; С. Krishnan et al, 1987; J.S. Thompson, 1990; M.P. Doyle, 1991). В остальном биохимические свойства штаммов Е. coli 0157:Н7 практически не отличаются от Е. coli других серовариантов: ферментируют с кислотообразованием углеводы - глюкозу, маннит, лактозу; не ферментируют адонит и инозит; сбраживают вариабельно рамнозу, дульцит, сахарозу, арабинозу, салицин, раффинозу. Свертывают молоко, образуют индол, дают положительную реакцию с метилротом и отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра. Не разжижают желатин, не выделяют сероводород, не утилизируют цитрат натрия, малонат натрия, не имеют фенилаланиндеза-миназы, уреазы. Большинство штаммов расщепляют аминокислоты лизин и орнитин, не расщепляют аргинин (А.Ф. Карышева, 1989; Е.А. Светоч и др., 1998; Методические указания, 2001; J.S. Thompson et al., 1990).
По данным М.К. Пирожкова и С.А. Стрельченко (2006) патогенные свойства эшерихий обуславливаются комплексом факторов: интимином (фактор колонизации); эндотоксином (вызывающий дегенеративные изменения в кишечнике); экзотоксином (обладающий нейротропными и некро-тизирующими свойствами); гемолизином, адгезией и выделением колици-нов, а также выработкой веротоксинов.
Е. coli О 157:Н7 относится к энтерогеморрагической группе (ЕНЕС) кишечных палочек, вырабатывающие Шига-подобные (Shiga-like toxin) токсины (веротоксины) и вызывающие геморрагический колит и гемоли-тико-уремический синдром (П.А. Емельяненко, 2000; W.M. Johnson et al., 1983; С.Н. Pai et al, 1984; J.S. Spika et al., 1986; A.O. Carter et al., 1987; S.M. Scotland et al, 1987; C.H. Pai et al, 1988; S.M. Ostroff et al,1990; D.L.Martin et al, 1990; E.A. Belongia et al, 1991; A.D. O Brien, 1992; P.I. Tarr, M.A. Neill, 1996).
J. Konowalchuk в 1977 году впервые употребил термин "веротоксин" (VT) для определения цитотоксина E.coli, вызывающего гибель культур клеток Vero в культуре ткани. Но действие токсина распространяется на многие другие клетки, включая кишечные, эндотелиальные и лимфатические (К.Р. Keenan et al., 1986; С.А. Lingwood et al., 1987).
Первый шаг к определению патогенного потенциала Е. соН 0157:Н7 был сделан в 1983 году, когда был выделен токсин. Этот токсин назвали "Шига-подобный TOKCHH"(SLTOKCHH), ИЛИ "веротоксин" (VT), из-за его схожести с шига токсином, выделяемым бактериями рода Shigella (Ю.И. Вертиев, 1996; W.M. Johnson et al., 1983; A.D. O Brien, M.E. Chen, 1983; A.D. O Brien, T.W. Chang, 1983; N.A. Strockbine et al., 1988; B. Cryan, 1990; A.D. O Brien et al., 1992).
E. coli 0157:H7 (EHEC) вырабатывают SLT-токсины (веротоксины), которые, контактируя с глоботриозольными керамидными рецепторами и закрепляясь на них, блокируют наработку N - глюкозидазу на 28-й рибо-сомальной подъединице, и тем самым инактивируют рибосомальную РНК, нарушая её взаимодействие с факторами элонгации. Это приводит к подавлению белкового синтеза и, в конечном итоге, к гибели клетки-мишени. Глоботриазольный керамид четко выражен в человеческой почке и найден в первичной культуре клеток эндотелия (Ю.В. Езепчук, 1985; S.M. Scotland et al., 1985; V.V. Padhye et al, 1986; N.A. Strockbine et al., 1986; A.D. O Brien et al., 1987; С A. Lingwood et al., 1987; M. Noda et al., 1987; V.V. Padhye et al, 1987; Y. Endo et al., 1988; T. Waddell et al., 1988; B. Boyd et al., 1989; S.K. Saxena et al., 1989; J.K. Suh et al., 1998).
Частота выделения Е. coli 0157:Н7 из биологического материала от сельскохозяйственных животны
Для изучения частоты выделения Е. coli 0157:Н7 среди животных и птицы было исследовано 1246 проб биологического материала (кал, молоко). Из них: 406 проб кала от телят, 250 проб кала и 149 проб молока от коров, 77 проб от поросят, 34 пробы от лошадей, 174 пробы от мелких домашних животных, 70 проб от пушных зверей, 68 проб помета птиц. Совместно с сотрудниками детской инфекционной больницы г. Новосибирска производился отбор проб кала от людей: 306 проб кала от детей с клиническими признаками энтерита, гастроэнтерита и острой кишечной инфекции и 53 пробы от клинически здоровых взрослых людей.
Фекалии брали от здоровых и больных желудочно-кишечными болезнями животных и птиц, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами. Пробы фекалий брали из прямой кишки в стерильные пробирки с физиологическим раствором при помощи стерильных пастеровских пипеток. Молоко от коров брали из каждой доли в стерильные пробирки. Пробирки ставили в штативы и доставляли в лабораторию. Посев биологического материала на среду Эндо проводили в день отбора материала.
Для изучения частоты выделения Е. coli 0157:Н7 среди сельскохозяйственных животных исследовали: 406 пробы кала от телят, 250 проб кала и 149 проб молока от коров, 77 проб от поросят, 34 пробы от лошадей.
Исследования показали, что в среднем процент выделения энтероге-моррагической кишечной палочки серотипа 0157:Н7 от телят различных возрастов в Алтайском крае составил - 10,61%, в Новосибирской области -6,14%.
Максимальное выделение Е. coli 0157:Н7 (13,33%) наблюдалось из биологического материала от телят 1-10 дневного возраста из Алтайского края, от здоровых телят - 11,67%, от больных гастроэнтеритом - 18,18%. В Новосибирской области частота выделения Е. coli 0157:Н7 от телят 1-10 дневного возраста отмечалась значительно ниже - 3,57%, от здоровых — 2,38%, от больных - 7,14%.
От телят 10-30 дневного возраста с признаками гастроэнтерита в Алтайском крае Е. coli 0157:Н7 выделили в 7,69% случаев, в Новосибирской области - в 4,81%, от больных телят в 3,13%, от здоровых в 5,16% случаев.
Среди телят 45-180 дневного возраста максимальное выделение наблюдали в Новосибирской области (20,59%). Частота выделения Е. coli 0157:Н7 отмечалась больше от больных (33,33%), чем от здоровых (11,36%) животных. В Алтайском крае выделение данного микроорганизма среди здоровых телят составило 9,09%. Из кала клинически здоровых коров данный серотип выделяли в Алтайском крае в 25% случаев, в Новосибирской области - 2,17%
Изучение биохимических свойств Е. coli 0157:Н7
Полученные из биологического материала культуры Е. coli 0157:Н7 были подразделены на 9 групп:
Группа 1 - изоляты, выделенные от телят Алтайского края.
Группа 2 - изоляты, выделенные от коров Алтайского края.
Группа 3 - изоляты, выделенные от собак.
Группа 4 - изоляты, выделенные от людей.
Группа 5 - изоляты, выделенные от коров Новосибирского района.
Группа 6 - изоляты, выделенные от телят Новосибирского района.
Группа 7 - изоляты, выделенные от птицы.
Группа 8 - изоляты, выделенные от поросят.
Группа 9 - изоляты, выделенные от лошадей.
Изучение биологических свойств проводили при помощи диагностической системы ПБДЭ. Для идентификации микроорганизмов по биохимическим признакам была разработана компьютерная программа «Биохимия микроорганизмов 2.0».
Выделенные изоляты Е. coli 0157:Н7 ферментировали с кислотообра-зованием углеводы - глюкозу, мальтозу, лактозу (92,2%), маннит (90,2%), арабинозу (82,4%); не ферментировали инозит; не утилизировали цитрат, малонат; не имели фенилаланиндезаминазы, уреазы (94,12%). Они давали отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра и положительную с метилро-том - 76,5%, сбраживали вариабельно сахарозу (60,8%).
Большинство изолятов Е. coli 0157:Н7 расщепляли аминокислоты лизин (74,5%) и орнитин (66,7%), не расщепляли аргинин (96,1%), продуцировали индол (66,7%), не образовывали сероводород, давали положительную реакцию со средой Кода, а также не разжижали желатин. Сорбит ферментировали 70,6% изолятов. Все выделенные изоляты не ферментировали сорбитол, что является характерной особенностью Е. coli 0157:Н7 (табл. 8).
Исследования ферментативных свойств показали, что все изученные изоляты являются типичными представителями вида Escherichia coli, хотя среди них наблюдали культуры с измененными биохимическими свойствами.
Достаточно высокая вариабельность биохимических характеристик внутри вида E.coli создает предпосылки для использования биохимических критериев с целью дискриминации штаммов внутри вида, и, соответственно, для целей молекулярной эпизоотологии и экологии E.coli.
