Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Регуляция процессов метаболизма дрожжевых организмов в зависимости от условий их культивирования 8
1.1.1. Влияние состава питательной среды на биохимические процессы в клетках дрожжей 16
1.2. Применение нетрадиционных источников в составе питательной среды для культивирования дрожжей 22
1.2.1. Геотермальная вода как источник органических и минеральных компонентов питательной среды для выращивания дрожжевых организмов 26
Глава 2. Экспериментальная часть 30
2.1. Объекты исследования 30
2.2. Состав среды культивирования 31
2.3. Постановка эксперимента 34
2.4. Проведение биохимического анализа 34
2.4.1. Определение активности ферментов 34
2.4.2. Определение общего содержания фосфора 37
2.4.3. Определение суммарного количества нуклеиновых кислот 38
2.4.4. Определение общего содержания углеводов 39
2.4.5. Определение трегалозы 39
2.4.6. Определение легкогидролизуемых углеводов 40
2.4.7. Определение общего содержания липидов 40
2.4.8. Определение суммарного содержания фосфолипидов 41
2.5. Изучение люминесцентных спектров дрожжей 42
2.6. Морфологические исследования 42
2.7. Определение биотехнологических показателей 43
2.8. Статистическая обработка результатов 44
Глава 3. Результаты исследовании и их обсуждение 45
3.1. Исследование биохимических особенностей дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cercvisiae Y-503 в зависимости от состава питательной среды 45
3.1.1. Влияние состава питательной среды на ферментативную активность исследуемых штаммов 45
3.1.2. Исследование общего содержания фосфора и нуклеиновых кислот в биомассе дрожжей в зависимости от состава среды культивирования 52
3.1.3. Изучение показателей углеводного обмена дрожжей в зависимости от состава среды культивирования 57
3.1.4. Влияние состава питательной среды на липидныи обмен дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503 62
3.2. Исследование люминесцентных свойств дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503 в зависимости от состава питательной среды 68
3.3. Влияние состава питательной среды па некоторые морфологические и биотехнологические свойства
дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503 77
3.3.1. Сравнительная характеристика морфологических свойств дрожжей в зависимости от условий культивирования 77
3.3.2. Влияние геотермальной воды в составе питательной среды на биотехнологические свойства штаммов
S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503 85
Выводы 92
Литература
- Регуляция процессов метаболизма дрожжевых организмов в зависимости от условий их культивирования
- Проведение биохимического анализа
- Исследование биохимических особенностей дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cercvisiae Y-503 в зависимости от состава питательной среды
- Исследование люминесцентных свойств дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503 в зависимости от состава питательной среды
Введение к работе
Актуальность. Известно, что дрожжевая клетка обладает отличительной способностью к регулированию биохимических процессов в зависимости от условий культивирования [Кретович, 1986]. Регуляторные механизмы, определяющие скорость роста дрожжей и находящиеся на многих уровнях организации дрожжевой клетки, связаны прежде всего с составом питательной среды.
Ранее было установлено, что минеральные и органические компоненты подземных вод, обладающие большим химическим потенциалом и являющиеся стимуляторами физиолого-биохимических процессов в живой клетке, могут быть использованы в качестве нового источника питания дрожжевых организмов [А.с. 1730140, 1992; Абрамов и др., 1995, 1998, 1999, 2000]. На этой основе были разработаны эффективные технологии с использованием геотермальной воды нефенольного класса в составе среды культивирования, позволившие получить высококачественные прессованные и сушеные хлебопекарные дрожжи [Патент 2084519, 1997; Патент 2151795, 2000]. Биологически активные соединения геотермальной воды в составе мелассной питательной среды при определенных условиях культивирования способствовали получению нового штамма S. oviformis Y-2635, который содержит оптимальное количество свободных аминокислот, минеральных веществ, водорастворимых витаминов [Исламова, 2002; Патент 2188232, 2002]. Однако ряд биохимических показателей S. oviformis Y-2635, определяющих биологическую ценность дрожжей, остается неизученным. Кроме того, большой интерес представляет исследование особенностей биохимических механизмов дрожжевых клеток при воздействии различных компонентов питательной среды в процессе периодического культивирования. В настоящей работе мы пытались выяснить, каким образом геотермальная вода в составе питательной среды влияет на биохимические процессы и активность ферментов нового штамма S. oviformis Y-2635 и традиционно используемых в хлебопекарном производстве дрожжей S. cerevisiae Y-503.
Цель и задачи исследования. Основной целью работы является изучение влияния геотермальной воды в составе питательной среды на биохимические и технологические свойства дрожжей Saccharomyces oviformis Y-2635 и Saccharomyces cerevisiae Y-503.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Исследование активности ферментов: а-глюкозид азы, |3-фруктофуранозидазы; алкогольдегидрогеназы, протеиназы, глюкоамилазы штаммов S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503 в зависимости от состава среды культивирования: с содержанием геотермальной воды и стандартной питательной среды;
Выяснение влияния геотермальной воды в составе питательной среды на количественное содержание нуклеиновых кислот и фосфора в биомассе дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503;
Определение общего содержания и легкогидролизуемых углеводов, трегалозы, общего содержания липидов и фосфолипидов в биомассе дрожжей в зависимости от состава питательной среды;
Изучение влияния состава питательной среды на люминесцентные свойства, морфологические и биотехнологические характеристики дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503.
Научная новизна. Впервые установлена возможность регуляции активности ферментов гидролитического комплекса дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503 биологически активными веществами геотермальной воды в составе среды культивирования.
Установлено, что содержание фосфора, липидов, фосфолипидов, запасных углеводов в биомассе дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503 повышается при воздействии комплекса минеральных и органических компонентов геотермальной воды в составе питательной среды при периодическом культивировании.
Впервые исследованы люминесцентные свойства штаммов S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503, отражающие функциональное состояние клетки в зависимости от состава питательной среды.
Установлено, что минеральные и органические соединения геотермальной воды нефенольного класса в составе питательной среды способствуют стабилизации морфофизиологического состояния дрожжевых клеток исследуемых штаммов, а также улучшению их биотехнологических показателей.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные экспериментальные данные позволяют расширить представление о механизме влияния биологически активных веществ геотермальной воды в составе питательной среды на особенности биохимических, физиологических процессов, морфологии дрожжей.
Штамм S. oviformis Y-2635, культивируемый на питательной среде с содержанием геотермальной воды нефенольного класса, обладает высокой ферментативной активностью, что представляет значительный интерес для повышения эффективности производства прессованных хлебопекарных дрожжей.
Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:
Внесение геотермальной воды в состав среды культивирования существенно влияет на активность ферментов углеводного и азотистого обмена дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503.
Использование геотермальной воды в составе питательной среды повышает содержание фосфора, углеводов и липидов в биомассе исследуемых штаммов дрожжей.
Геотермальная вода в составе среды культивирования влияет на морфологические характеристики дрожжевых клеток и биотехнологические показатели штаммов S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на:
международной конференции «Достижения биотехнологии на благо будущего человечества» (Самарканд, 2001);
XVI научно-практической конференции по охране природы Дагестана (Махачкала, 2001);
II международной научной конференции и выставке «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ и получен патент РФ.
Регуляция процессов метаболизма дрожжевых организмов в зависимости от условий их культивирования
Жизнедеятельность микроорганизмов определяется характерными чертами, и прежде всего ростом, развитием, размножением, обменом веществ и приспосабливаемостыо к внешним условиям; координация между различными метаболическими процессами в дрожжевой клетке обеспечивается благодаря сложнейшим регуляторним механизмам. Дрожжи обладают гибким метаболизмом и способны к значительным перестройкам обмена веществ в ответ на изменение условий культивирования [Шарышев и др., 1997]. Решающее значение имеют такие факторы внешней среды, как аэрация, температура, концентрация ионов водорода, осмотическое давление и т.д.
Существенное влияние на биохимические реакции в дрожжевых клетках, их состав и структуру оказывает аэрация. Главная функция молекулярного кислорода состоит в том, что он служит конечным акцептором электронов при аэробном дыхании, кислород при этом восстанавливается до воды. По отношению к молекулярному кислороду можно выделить несколько групп организмов; дрожжи относятся к факультативным анаэробам, то есть растут как в присутствии, так и в отсутствии Ог.
В анаэробных условиях брожение протекает интенсивно, однако дрожжи почти не размножаются. В присутствии кислорода дрожжи переключаются с брожения на дыхание. У некоторых дрожжей можно почти полностью подавить брожение усиленной аэрацией (эффект Пастера). Аэрация уменьшает потребление субстрата, а также образование этанола и ССЬ, но делает возможным рост дрожжей. С энергетической точки зрения это чрезвычайно полезный регуляториый механизм: в анаэробных условиях образуются только 2 моля ЛІТ на один моль использованной глюкозы, а при дыхании - молей ЛТР. Таким образом, клетка, регулируя превращения субстрата, может получать максимум энергии в различных условиях [Шлегель, 1987].
Однако прежде чем вызвать изменения в обмене веществ, кислород воздуха оказывает действие в первую очередь на морфологию и физиологию дрожжевой клетки: изменяется размер и строение клетки, ее химический состав и т.д. Аэробно выращенные клетки в отличие от анаэробных менее богаты гликогеном, волютином и азотистыми соединениями, а также имеют меньшие размеры и массу [Авакянц, 1980]. Значительно изменяется ферментный состав дрожжевой клетки, особенно комплекс дыхательных ферментов. При переходе из аэробных условий в анаэробные изменение активности ферментов дрожжевой клетки связано с положением фермента в цепи переноса электронов. Наиболее сильно изменяется терминальный фермент (цитохромоксидаза), который непосредственно реагирует с молекулярным кислородом.
В дрожжах, лишенных длительное время кислорода, падает активность малатдегидрогеназы, изо цитр атдегидро ген азы, отсутствуют цитохромоксидаза и цитохром Ь, уменьшается содержание цитохрома с. Однако при аэрации анаэробно выросших дрожжей происходит синтез типичных аэробных цитохромов. Известно, что ферментативная активность дрожжей изменяется при их насыщении кислородом. Исследованиями динамики секреции экзо-фермеитов винных дрожжей Saccharomyces oviformis и Saccharomyces vini при постоянной и различной степени аэрации бродящей среды установлено ее избирательное воздействие на процесс секреции и количественные показатели активности экзоферментов дрожжей: (3-фруктофуранозидазы, протеина-зы и эстсразы [Туйчиева и др., 2003].
Аэрация оказывает заметное влияние на накопление липидов дрожжами, кроме того, изменяет отдельные липидные фракции и даже состав жирных кислот. Образование дрожжами липидов связано в большой степени с дыхательной активностью клетки. Ингибирование процессов дыхания дрожжей может оказывать влияние на процессы окисления, связанные с
НАДФ.Ні, что в свою очередь препятствует превращению насыщенных жирных кислот в ненасыщенные. В клетках Saccharomyces cerevisiae в условиях анаэробиоза резко измершется состав фосфолипидов в митохопдриальных мембранах. Содержание ненасыщенных жирных кислот падает, при этом увеличивается количество короткоцеиочных насыщенных жирных кислот [Лукашик, Пшеничная, 19731.
Одним из наиболее важных факторов, влияющих на активность дрожжей, является температура. Влияние температуры на ход ферментативных реакций довольно многообразно. Температура влияет на устойчивость фермента, на сродство фермента к субстрату, активаторам или ингибиторам, на изменение концентрации растворенного кислорода, максимальную удельную скорость роста дрожжей и т.д. [Камзолова и др., 1996; Singh at al., 1991].
Характер воздействия температуры на активность ферментов определяется их белковой природой. Повышение температуры сверх оптимальной приводит к инактивированию ферментов. Клубок белковой молекулы теряет форму, ее спирали распрямляются, и хотя общий химический состав фермента не измершется, но прежняя конфигурация белковой молекулы утрачивается и молекула теряет активность. При низкой температуре (ниже нуля) ферменты не разрушаются, но действие их прекращается.
Исследованрге температурной зависимости белковой флуоресценции позволяет получать информацию об области тепловой стабильности натив-ной структуры белка, а также об индуцируемых теплом изменениях в пределах нативного состояния белка [Пермяков, 2003].
С помощью температуры (физического индуктора) можно более чем в 4 раза увеличивать стационарную скорость действия протеиназ, т.е. первой стадии гидролиза белков. Непосредственно па сами ферменты индуктор не влияет; механизм индуцированного автолиза, запускаемый посредством мембранотропных агентов, воздействующих на липопротеиновые мембраны клетки, приводит к высвобождению гидролитических ферментов из лизосом и их взаимодействию с субстратом [Бабаярг, Латов, 2003].
Проведение биохимического анализа
Активность ферментов определялась в суспензиях клеток и бесклеточных экстрактах. Получение бееклеточпых экстрактов
К биомассе прибавляли равное по объему количество мелких стеклянных бусин, встряхивали каждую пробу по одной минуте пять раз. В промежутках между встряхиванием биомасса находилась во льду. Затем добавляли равное исходному объему клеток 25 мл МЭС (морфолин и сульфоэтановая кислота), рИ 6,6. После охлаждения повторно проводили встряхивание. Разрушенную биомассу центрифугировали (3000 об/мин, 15 мин, 20 С). Определение количества клеток проводили на спектрофотометре при 600 нм. Для расчета весового количества клеток использовали перерасчетный коэффициент (1 ед оптической плотности при Аш) соответствует 0,15 мг или 107 клеток).
Определение активности а-глнжозидазы
Метод поляриметрический, основан на учете уменьшающегося вращения раствора мальтозы в результате ферментативного действия мальтазы.
В качестве субстрата применяли 12,5%-ный раствор мальтозы (20 мл), добавляли 5 мл фосфатной буферной смеси, 25 мл дрожжевой суспензии, несколько капель толуола. Смесь выдерживали при 30С в течение 60-180 мин, добавляли 5 мл 2н углекислого натрия, чем прекращали ферментативный гидролиз. Использовали круговой поляриметр СМ—3, выражали в условных единицах на мг клеток дрожжей [Белозерский, Проскуряков, 1951 ].
Определение активности Р-фрукторфуранозидазы
Метод поляриметрический, основан на учете уменьшающегося вращения раствора тростникового сахара в результате ферментативного действия р-фрукторфуранозидазы.
Дрожжевую суспензию размешивали с 25 мл 1%-ного раствора одноосновного фосфата натрия, помещали в термостат при 15,5, приливали к содержимому 10 мл 20%-пого раствора тростникового сахара в том же фосфатном буфере после предварительного прогревания в термостате, перемешивали. Количество испытуемого материала подбирали так, чтобы инверсия субстрата до нулевого вращения продолжалась в течение 60-180 минут.
Через установленные промежутки времени брали 25 мл основной смеси, добавляли 5 мл 2н раствора углекислого натрия, прекращающего действие фермента. Смесь оставляли на 15 мин., после чего приступали к поляри-метрированию на приборе СМ-3. Положительное вращение, свойственное тростниковому сахару, в процессе гидролиза постоянно уменьшается и достигает 0 в тот момент, когда расщеплению подверглось 75,75% тростникового сахара. Активность 3-фрукто фураноз ид азы выражали в условных единицах на мг клеток дрожжей [Нелозерский, Проскуряков, 1951].
Определение активности алкогольдегидрогеназы
Окисление этилового спирта под действием алкогольдегидрогеназы сопровождается восстановлением НАД, что регистрировалось по увеличению оптической плотности на спектрофотометре.
В кювету помещали реакционную смесь, содержащую 6 мМ буфер, ЮОмМ этанол и 0,5 мМ НАД. Реакцию начинали добавлением 0,5 мл раствора алкогольдегидрогеназы. Общий объем пробы - 3 мл. Перемешивали и измеряли увеличение оптической плотности при 340 нм на спектрофотометре СФ-26 и течение 45 сек. Состав контрольной кюветы тот же, только отсутствует субстрат. За единицу активности алкогольдегидрогеназы принимали количество фермента, необходимого для окисления 1 мкМ этилового спирта на 1 мг клеток дрожжей [Кочетов, 1980].
Определение активности глнжоалшлазы
Глюкоамилазную активность определяли модифицированным глюкозо оке и дазным методом, основанным на определении глюкозы, образующейся при гидролизе амилозы под действием фермента. В качестве субстрата использовался раствор амилозы (50 г/л) в диметилсульфоксиде. К 10 мл субстрата добавляли 15 мкл буфера, а затем 100 мкл ферментного препарата и инкубировали в термостате 30 мин. при 37й С. Определение активности проводили в условиях сохранения начальной скорости реакции. Реакцию останавливали добавлением 500 мкл динитросалицилового реагента, затем нагревали при 100 С в течение 10 мни. и, после охлаждения, добавив 2 мл воды, определяли поглощение полученного раствора на спектрофотометре СФ-26 при 470 им. За единицу активности і л ю ко амилазы принимали количество фермента, необходимого для образования 1 мкМ глюкозы в мин. при 37 С [Грачева, 1982].
Определение актнпностн протеолитнческих ферментов (суммарное количество)
Использовался модифицированный метод Ансона. В качестве субстрата использовали 1 %-ый раствор окрашенного казеина в воде. К 150 мкл субстрата добавляли 100 мкл ферментного препарата и доводили объем смеси до 500 мкл буфером 25 мМ МЭС (морфолин и сульфоэтановая кислота), рН 5,6 или 25 мМ натрийфосфатным буфером, pll 5,4. Смесь инкубировали при 30 С в течение 10-12 часов и останавливали реакцию прибавлением 1,5 % ТХУ. После 10 мин. паузы при 4 С осадок удаляли центрифугированием (2000 об/мин, 10 мин, 4 С). Измерение экстинции проводили на спектрофотометре СФ-26 при 500 им. За единицу протеолитической активности принимали количество фермента, которое за одну минуту катализирует переход в неосаждаемое ТХУ состояние 1 мкмоль тирозина [Anson, 1938].
Исследование биохимических особенностей дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cercvisiae Y-503 в зависимости от состава питательной среды
Биологическая активності, дрожжей определяется наличием в них ферментов различного действия. Свойственный дрожжевому организму характер обмена веществ определяется его генетической природой, от которой зависит специфические для него набор ферментов и соотношение скорости отдельных ферментативных процессов, неразрывно связанных между собой. Отличительным свойством дрожжей является их способность к саморегулированию при изменении условий внешней среды, условий культивирования [Кре-тович, 1986], Взаимосвязь с питательной средой и приспособление дрожжей к ней предопределяют активность ферментов, ускоряют и обеспечивают тем самым биохимические превращения внутри клетки. Оптимальный состав питательной среды полностью обеспечивает возможность индуцированного биосинтеза ферментов, которые, в свою очередь, через промежуточные продукты обмена оказывают влияние на образование конститутивных ферментов [Коновалов, 1967]. Главная задача при изучении регуляции активности ферментов в клетках заключается в том, чтобы понять механизмы, которые связывают процессы метаболизма с функциональной активностью [Коэн, 1986].
Б связи с этим большой интерес представляет исследование особенностей биохимических .механизмов дрожжевых клеток S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503 при воздействии различных компонентов питательной среды в процессе культивирования. Целью нашей работы явилось сравнительное изучение активности ферментов, участвующих в углеводном и азотном обмене: алкогольдегидрогеназы (1.1.1.1.), а-глюкозидазы (3.2.1.20.), р-фруктофуранозидазы (3.2.1.26), глюкоамилазы (3.2.1.3), суммарного количе ства протеиназ (3.4.) в биомассе исследуемых штаммов, культивируемых на мелассных питательных средах; с использованием геотермальной воды и по традиционной технологии.
Хлебопекарные дрожжи должны обладать высокой ферментативной активностью, обеспечивающей их жизнедеятельность в полуфабрикатах производства, при этом наибольший интерес представляет изучение активности ферментов зимазного и мальтазного комплексов, занимающих важное место в углеводном обмене [Кретович, 1986].
Поскольку хлебопекарные дрожжи выращивают в мелассной среде, где составной частью углеводов является сахароза, клетка активно индуцирует эндофермент р-фруктофуранозидазу, легко выделяющуюся в окружающую среду. [3-фру кто фураноз ид аз а всегда присутствует в клетке, и активность этого фермента проявляется с первых минут брожения. Способность дрожжей катализировать реакцию гидролиза сахарозы этим ферментом и затем сбраживать продукты ее гидролиза - глюкозу и фруктозу - характеризуется зимазной активностью. Результаты измерений активности ферментов приведены в таблице 2. Установлено, что опытные варианты имеют более высокий уровень инвертазной активности по сравнению с контролем: в 1,19 раза в суспензиях, и в 1,3 раза в бесклеточных экстрактах (штамм S. oviformis Y-2635); в 1,17 раза в суспензиях и и 1,24 раза в бесклеточных экстрактах (штамм S. cerevisiae Y-503). Примечательно, что активность J3-фруктофуранозидазы нового штамма даже превосходит аналогичный показатель дрожжей S. cerevisiae, традиционно используемых для хлебопечения.
Одним из факторов, влияющих на ход технологического процесса и качество продукции, является исходная активность дрожжей и их способность адаптироваться к анаэробным условиям жизнедеятельности. В анаэробной среде, основным компонентом которой является мука, доля образующейся мальтозы примерно в 10 раз превышает суммарное содержание глюкозы, что способствует синтезу фермента а-глюкозидазы. Поэтому дрожжевые клетки должны переключаться с дыхательного типа жизнедеятельности на бродиль пый. При этом изменяется их внутренняя структура, увеличивается содержание гликогена, уменьшается потребление СЬ па дыхание, активизируются восстановительные реакции, сахара превращаются в спирт и С02. Локализованная в цитоплазме а-глюкозидаза способна использовать мальтозу после проникновения ее в клетку.
Г Тредставленпые результаты показывают, что уровень активности а-глюкозидазы опытного варианта дрожжей S. ovifonnis Y-2635 как в суспензиях клеток, так и в бесклеточных экстрактах превышает показатели контрольного - в 1,4 и 1,9 раза соответственно. Аналогичная ситуация характерна и для штамма S. cercvisiae Y-503: уровень активности а-глюкозидазы в опытном варианте превышает контроль в 1,14 раза в суспензиях клетов и в 1,4 раза — в бесклеточных экстрактах. Заключительный этан брожения катализирует алкогольдегидрогеназа, восстанавливающая ацетальдегид до этанола, что имеет важное значение для процесса созревания теста. Как видно из рисунка, активность этого фермента в суспензиях клеток и бесклеточных экстрактах штаммов S. ovifonnis Y-2635 и S. cercvisiae Y-503, выращенных на питательной среде с геотермальной водой, выше контроля в 1,28; 1,25 и в 1,54; 1,21 раза соответственно. Известно, что клетка, реагируя на воздействие определенных факторов питательной среды, регулирует синтез индуцибель-ных ферментов [Безбородой, 1984]. Очевидно, такими факторами явились органические (гумусовые вещества) и минеральные компоненты геотермальной воды.
Исследование люминесцентных свойств дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503 в зависимости от состава питательной среды
Люминесцентно-спектралъный анализ, позволяющий изучать физико-химические процессы, протекающие непосредственно в живой клетке и ее органоидах, в настоящее время является общепризнанным. Данный метод может быть использован в фундаментальных и прикладных исследованиях
ДЛЯ ОПредеЛеНИЯ КОПЦеН фаЦИИ вещеСТВ, МЄЖМОЛекуЛЯрНЫХ раССТОЯНИЙ, KOH формационного состояния макромолекул, ориентации молекул и надмолекулярных структур, эффектов миграции энергии и межмолекулярных взаимодействий, микровязкости среды, мембранного потенциала, транспортных процессов в клетке, измерения кинетики и термодинамики молекулярных процессов [Заяв. 94011001/13, 1996; Патент 2054486, 1996; Патент 2135586, 1999; Владимиров, 2001; Страховская и др., 2004; Трофимов, 2004; Epand et al., 1996]. В настоящее время метод собственной люминесценции является одним из наиболее популярных и распространенных методов в биофизике и биохимии [Отчет, 2002; Moernes, 1999; Weiss, 1999].
Параметры люминесценции отражают свойства возбужденных состояний люминофоров, характеристики электронных переходов и их взаимодействия с окружением [Пермяков, 2003]. Гак, ароматические аминокислотные остатки триптофана, тирозина и фенилаланина являются главными люминес-цирующими группами в белках. Используя очень высокую чувствительность люминесценции к изменениям в окружении люминофоров, можно изучать структурные и физико-химические изменения в белковых молекулах, включая функционально значимые изменения [Ladokhin,1999].
Флуоресцентная спектроскопия все более широко используется в биотехнологии. Люминесцентные методы применяют для непрерывного наблюдения за процессами культивирования микроорганизмов. Оптические сенсоры используются для наблюдения за ростом микробных культур, поскольку их можно размещать внутри ферментера, не нарушая идущие там процессы роста [Marose et al., 1998]. С помощью триптофаповой флуоресценции вполне можно следить за состоянием белков в процессе технологической обработки пищевых продуктов и использовать полученные данные для оптимизации технологических процессов [Li-Chan, 1998].
В последнее время люмипесцеитпо-спектральпому анализу уделяется все больше внимания при изучении функциональных механизмов дрожжей [Пиняскина, 2001; Страховская и др., 1998; Garsia et al, 1998]. Известно, что дрожжевая клетка обладает собственной люминесценцией, которая обязана своим происхождением различным компонентам ее структуры и метаболизма: белкам, восстановленным пиридиннуклеотидам и окисленным флавопро-теинам, витаминам, порфириновым структурам и т.д. [Карнаухов, 1987]. В случае, когда собственные спектральные характеристики представляющих интерес компонентов клетки оказываются недостаточно выразительными, используются метки-красители, например, акридиновый оранжевый и бромистый этидий, являющиеся полициклическими ароматическими молекулами [Пинская и др., 2004]. Люминесцентные красители играют большую роль в изучении внутриклеточного обмена веществ дрожжей. Связываясь с макромолекулами, они изменяют свои электронные спектры поглощения, а люминофоры - и параметры своей флуоресценции. По изменению этих параметров можно судить о структуре того или иного биополимера и сложных надмолекулярных образований, таких как рибосома, мембраны, хроматин.
Известно, что люминесценция связана с энергетическим метаболизмом [Пшеничиов и др., 20031. Одна из главных составляющих собственной хеми-лгоминесценции дрожжей - свечение, сопровождающее цепное окисление липидов в мембранных структурах клеток. Чем энергичнее идут цепные реакции окисления липидов, тем выше интенсивность хемилюминесценции, сопровождающей реакцию радикалов [Владимиров, 1999]. Хемилюминес-ценция, отражая процессы перекисного окисления липидов, может быть ис пользована для опенки криоповреждения биологических мембран клеток S. cerevisiac [Скардс и др., 1986J.
Возможности люминеспентно-спектрального анализа связаны с тем, что характерные спектры поглощения и люминесценции многих молекул, входящих в состав функциональных механизмов клетки, в ряде случаев подвергаются значительным изменениям. Гак, при изучении обмена порфиринов некоторых микроорганизмов можно следить за их физиологическим состоянием. Порфириновая структура лежит в основе простатических групп таких широко распространенных соединений, как цитохромы, пероксидаза, катала-за. При получении определенного количества субстрата (углеводороды, соли и микроэлементы), в дрожжах накапливаются различные формы порфиринов со специфическим максимумом люминесценции; при повреждении дрожжевых клеток в условиях голодания, инактивирующего действия нагревания, блокирования дыхательной цепи и т.д., происходит накопление хелатных комплексов с микроэлементами, содержащимися в среде культивирования, что приводит к наблюдаемому изменению спектра люминесценции клеток. Обнаруженная закономерность послужила основой способа определения жизнеспособности дрожжей - продуцентов в микробиологическом синтезе [Карнаухов, 1978].
Целью работы было изучение люминесцентных свойств дрожжей S. oviformis Y-2635 и S. ccrevisiae Y-503 в зависимости от состава питательной среды. Люминесценцией принято называть свечение вещества, возникающее при переходе его молекул из возбужденного состояния в основное, поэтому необходимым условием появления люминесценции является предварительный перевод части исследуемых молекул в возбужденное состояние [Сайдов, Свердлова, 1980]; в наших исследованиях для перевода молекулы в возбужденное электронное состояние использовалась световая энергия. Установлено, что исследуемые дрожжевые суспензии штаммов S. oviformis Y-2635 и S. cerevisiae Y-503, выращенные на мелассных питательных средах (контрольной - по традиционной технологии и опытной, содержащей геотер мальпую воду), обладают полосой интенсивной люминесценции с максимумом 520-530 им и 630 им, при этом наблюдается определенная закономерность для обоих штаммов: интенсивность люминесценции контрольного варианта выше опытного (рис. 5). Спектр люминесценции характеризуется сложной структурой и отражает, очевидно, участие двух фоторецепторов. На основании анализа литературных данных можно предположить, что основной вклад в свечение дрожжевой суспензии при длинах волн 500-550 нм вносят окисленные флавопротеины, а при 600-650 нм - гюрфирины, входящие в состав простетических групп ферментов систем терминального окисления. Как известно, в зависимости от среды культивирования в дрожжах синтезируются порфирины, которые имеют характерные спектры и максимумы люминесценции. Возможно, накопление различных форм порфиринов в контрольном и опытном образцах приводит к изменению спектра люминесценции клеток.
