Содержание к диссертации
Введение
1.1 Криоконсервирование - сохранение биологического материала при помощи сверхнизких температур 9
1.1.1 Развитие методов криоконсервирования 10
1.1.2. Классификация криопротекторов 11
1.1.3. Естественные способы устойчивости к низким температурам и криопротекторы 12
1.1.4. Кржоконсервация морских животных 13
1.1.5. Криопротекторы на основе липидов 14
1.1.6. Жизнеспособность, целостность и функциональная активность в популяция клеток после замораживания-оттаивания 15
1.2. Культуры клеток в морской биотехнологии 16
1.2.1. Продукция биологически-активных веществ в культуре клеток .... 16
1.2.2 Культуры клеток морских беспозвоночных 19
1.2.3. Увеличение пролиферативной активности клеток морских
беспозвоночных с помощью белковых активаторов 22
1.2.3.1. Факторы роста морских ежей 22
1.2.3.2. Новый подход для увеличения пролиферативной
активности клеток морских беспозвоночных 23
1.2.3.3. Gal4 - представитель универсальных
активаторов транскрипции эукариотических генов 23
1.23 А. Возможность цис-регуляции гена ЭРФ морских ежей
белком Gal4 25
1.3. Перенос экзогенной ДНК в морской биотехнологии 26
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1. Животные 28
2.2. Плазмиды 28
3. МЕТОДЫ 28
3 1 Приготовление препаратов липидов 28
3.2. Замораживание клеточной суспензии 29
3.3. Оттаивание клеточных культур 29
3.4. Дифференциальная сканирующая калориметрия лилидов 30
3.5. Трансфекция эмбрионов морских ежей 30
3.6. Получение первичных культур из клеток морских беспозвоночных . .30
3.7. Фракционирование суспензии эмбриональных клеток морских ежей 31
3.8. Трансфекция первичных клеточных культур, полученных из эмбрионов морских ежей со стадии бластулы 31
3.9. Выделение тотальной ДНК из эмбриональных клеток морских ежей ... 32
3.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием тотальной ДНК, выделенной из эмбриональных клеток морских ежей 32
3.11. Выделение тотальной РЬЖ из эмбрионов морских ежей и ее очистка ... 34
3.12. Получение фракции матричной РНК 35
3.13. ОТ-ПНР анализ 36
3.14. Рестрикционный анализ продуктов амплификации 36
3.15. Включение Н3-тимидина 37
3.16. Включение С14-уридина 37
3.17. Фотосъемка 38
3.18. Приготовление полутонких срезов 38
3.19. Выделение и определение содержания нафтохиноновых
пигментов из клеток первичных культур морского ежа 38
3.20. Статистический анализ 39
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 40
4.1. Эмбриональное развитие морского ежа и мидии 40
4.2. Криосохранение эмбриональных и соматических клеток
морских беспозвоночных 41
4.2.1. Жизнеспособность личиночных и соматических клеток моллюсков и эмбриональных клеток морских ежей после замораживания-оттаивания 41
4.2.2. Уровень синтеза РНК в первичных культурах личиночных и соматических клеток моллюсков и эмбриональных клеток морских ежей после замораживания-оттаивания 44
4.2.3. Температуры фазовых переходов общих липидных экстрактов морских беспозвоночных 47
4.2.4. Особенности замораживания-оттаивания клеток морских беспозвоночных 49
4.3. Влияние активатора транскрипции gal4 на рост и развитие эмбрионов и эмбриональных клеток морских ежей 52
4.3.1. Трансфекция оплодотворенных яйцеклеток и эмбрионов морских ежей геном gal4 52
4.3.2. Детекция генов, гомологичных генам цитоплазматических актинов СуПЪ и СуШЬ морского ежа St. purpuratus в клетках морских ежей при помощи геноспецифической ПЦР 54
4.3.3. Детекция гена gal4 в эмбриональных клетках морских ежей при помощи геноспецифической ПЦР 55
4.3.4. Экспрессия гена, гомологичного гену цитоплазматического актина Cyllb St. purpuratus в клетках плоского морского ежа 56
4.3.5. Доказательство экспрессии гена gal4 57
4.3.6. Рестрикционный анализ ггродуктов амплификации 58
4.3.7. Количество эмбрионов с ОПС у разных видов морских ежей ... 59
4.3.8. Количество эмбрионов с окрашенными ОПС у разных видов морских ежей . 61
4.3.9. Образование ОПС в процессе культивирования эмбрионов морских ежей 62
4.3 Л0. Влияние количества плазмидной ДНК на образование эмбрионов с ОПС у морских ежей 63
4.4. Очистка эмбриональньк клеток морских ежей фракционированием в ступенчатом градиенте плотности перколла 64
4.5. Влияние ингибиторов киназ и фосфотаз на развитие эмбрионов морских ежей 67
4.6. Пролиферативная активность клеток морских ежей, трансформированных геном gal4 70
4.6.1. Трансфекция первичных клеточных культур морских ежей геном gal4 70
4.6.2. Клеточные культуры, полученные из трансфецированных геном gal4 эмбрионов морских ежей 73
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 77
ВЫВОДЫ 79
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 80
Введение к работе
За последние 10 лет было описано более 5000 химических соединений из морских организмов, причем многие из этих природных биоактивных метаболитов обладают высоким фармакологическим потенциалом. Особый интерес среди данных организмов привлекают губки, иглокожие, моллюски и другие морские беспозвоночные, которые представляют собой источник ценных биологически активных веществ, многие из которых не встречаются в наземных организмах (Ireland et al., 1988). В частности плоский морской еж Scaphechinus mirabilis содержит нафтохиноидные пигменты, главным из которых является эхинохром (Nishibori, 1957). Препарат Гистохром, созданный на его основе, обладает уникальными терапевтическими свойствами (Еляков и др., 1999 а,б; Мищенко и др., 2003).
Некоторые виды морских беспозвоночных имеют обширную сырьевую базу, другие являются редкими. В любом варианте, в свете современных тенденций сохранения биоразнообразия, было бы заманчиво разработать технологии промышленного культивирования клеток этих животных с целью получения биологически активных веществ. Продукция биологически активных веществ in vitro может стать альтернативой химическому синтезу или аквакультуре, но при условии, что клетки в культуре будут обладать высоким потенциалом роста. До сих пор в мировой практике, несмотря на многочисленные исследования, получено лили, две культуры из тканей морских беспозвоночных и низших позвоночных: из тканей кораллов (Frank et al., 1994) и аецкдий (RrnksYich, Rabinowitz, 1994; Kawaraura, Fujiwara, 1995).
Низкая пролиферативная активность клеток морских беспозвоночных в условиях искусственного культивирования препятствует получению постоянных клеточных культур. Проблему получения клеточной линии можно решить путем вывода клеток морских беспозвоночных из состояния дифференцировки, изменив экспрессию генов ростовых факторов, но до сих пор в мировой практике эта проблема не нашла своего решения. Поэтому актуальность дальнейших широких и углубленных исследований особенностей культивирования клеток морских беспозвоночных не вызывает сомнений.
Наиболее перспективным источником получения делящихся клеток морских беспозвоночных является эмбриональный материал, но его получение носит сезонный характер. Это существенно снижает интенсивность исследований. Поэтому важным направлением нашей работы стала разработка методов криоконсервации для создания постоянного источника клеток этих животных.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разработка научных основ криоконсервирования клеток и получения клеточных культур морских беспозвоночных. Предлагается стимулировать скорость деления клеток морских беспозвоночных через изменение уровня экспрессии факторов роста. Для этой цели мы использовали транскрипционный активатор транскрипции, ген gal4.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
Разработать методы криоконсервации клеточных культур морских беспозвоночных путем подбора оптимальных криопротекторов. Оценить жизнеспособность и провести анализ уровня синтеза РНК в клетках морских ежей и моллюсков после замораживания и оттаивания в присутствии разных криопротекторов.
Найти эффективный способ переноса чужеродных генов в клетки морских ежей.
Получить трансгенные культуры морских ежей и доказать экспрессию в них гена активатора транскрипции gal4.
Исследовать влияние гена gal4 на эмбриональное развитие морских ежей и пропи-феративную активность клеток в первичных культурах.
Положения, выносимые на защиту
Разработан метод криоконсервации морских беспозвоночных, при использовании которого жизнеспособность клеток составляет 32 % для морских ежей и 30 % для мидии.
Осуществлен перенос гена gal4 в эмбрионы морских ежей и показано, что ген эффективно в них экспрессируется.
Экспрессия гена gal4 в эмбриональных клетках морских ежей приводит к дедиф-ференциации клеток и увеличивает их пролиферативную активность.
Предложен новый для морской биотехнологии способ увеличения пролифератив-ной активности клеток, заключающийся в использовании генов-активаторов транскрипции.
Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии ДВГУ, а также в группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН.
Выделение липидных экстрактов и анализ температур их фазовых переходов были проведены совместно с сотрудниками кафедры биохимии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета: профессором д.б.н. Э.Я. Костецким и доцентом К.6.П. НЛУЕ.Саниной. Определение содержания нафтохиноновых пигментов в клетках мор- ских ежей проведено совместно с сотрудниками Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН - к.х.н. Е.А. Кольцовой и к.х.н. В.П.Глазуновым.
Автор приносит глубокую благодарность всем перечисленным сотрудникам и коллегам, своим научным руководителям, а также доктору М. Пташне (США) за предоставление образцов плазмидной ДНК.
Данная работа выполнена при частичной финансовой поддержке НОЦ ДВГУ за счет средств фонда US CRDF (проект VL-003) и Министерства Образования РФ (А03-2.12-524) и президиума ДВО РАН (04-3-Г-06-023 и 04-3-А-06-047).
Развитие методов криоконсервирования
Работы в области низких температур ведутся в основном в двух направлениях: разработка методов замораживания и подбор криопротекторных сред. Разработка методов включает в себя поиск оптимальных скоростей замораживания - это сверхбыстрое и медленное замораживание, контролируемое по градусам в минуту.
В настоящее время способ сверхбыстрого охлаждения, который разрабатывался в 50-60-е годы группой американских ученых во главе с Б. Дж. Льюйетом (диспергирование мелких капель клеточной суспензии непосредственно в жидкий азот либо распыление на сильно охлажденную пластинку, при скорости охлаждения не менее 104 С/сек) не применяется, в силу практической сложности осуществления заморозки больших объемов образца и некоторых осмотических изменений, повреждающих липопротеиды и вызывающих разрывы в клеточной мембране, Калинина и Громов (Kalinina, Gromov, 1991) показали, что при быстром замораживании амебы до температуры жидкого азота (- 196 С) и последующем оттаивании происходит необратимое повреждение цитоплазмы, ядро же при этом сохраняет нормальную морфологию и высокую функциональную активность. При пересадке таких ядер в клетки с энуклеированной цитоплазмой происходит восстановление активности клеток: прикрепления к субстрату, подвижности клеток и эндонитоза и, в некоторых случаях, деления клеток.
Сегодня, как правило, используется ступенчатое (градиентное) замораживание и относительно быстрое оттаивание клеток. При этом замораживание не должно быть слишком медленным, так как это способствует росту кристаллов льда и увеличению токсического эффекта на клетки специальных защитных веществ, используемых при данных процедурах (Mazur, 1984).
Первые успешные исследования по сохранению биологических объектов при помощи контролируемого, медленного замораживания были проведены Чангом (Chang, 1947), Пол-джером (Polge, 1949), Витенхемом с коллегами (Whitungham et al., 1972), а впоследствии и многими другими учеными.
Однако надо отметить, что когда время пребывания замораживаемого материала на каждой ступени не менее 15-20 минут, то скорость замораживания при ступенчатых методах криоконсервирования, значительной роли не играет (Odintsova, Tsal, 1995). Поэтому, главной
проблемой в настоящее время, стало поиск специальных веществ, способных предотвращать развитие повреждений биологического материала при его замораживании и последующем оттаивании, то есть поиск специфических криопротекторов.
Классификация криопротекторов
К криопротекторам относятся вещества, принадлежащие к разным классам химических соединений (Ashwood, Smilh, 1987), Это спирты (этиленгликоль, глицерин), амиды (диметил-ацетамид), оксиды (диметилсульфоксид), искусственные полимеры (поливинилпирролидон, оксиэтилированпый крахмал, полиэтиленгликоль), сахара (манноза, фруктоза, глюкоза, сахароза, трегалоза, крахмал), липиды (фосфолипиды, гликолипиды), пептиды, гликопептиды и
Вопрос о том, какими свойствами должен обладать эффективный криопротектор до сих ігор не имеет исчерпывающего ответа, но некоторые из основных свойств уже известны: криопротектор должен быть не токсичным, хорошо растворимым в воде, эффективно снижать количество вымораживаемой в виде чистого льда воды, предотвращать кристаллизацию и обладать способностью поддерживать в растворенном состоянии соли и белки. Полезным свойством является способность легко проникать через клеточную мембрану (Lorelock, Bishop, 1959), но это не является обязательным, так как существуют много достаточно эффективных защитных веществ, не проникающих внутрь клетки. На основе этого принято делить все существующие криопротекторы на проникающие и непроникающие через мембрану клеток, их механизм защитного действия основан на разных принципах.
При определенных концентрации проникающий криопротектор вызывает обезвоживание клеток, что в свою очередь повышает концентрацию внутриклеточных коллоидов. Последние в высоких концентрациях проявляют защитные свойства: способствуют переохлаждению внутриклеточной среды и ее частичному переходу в стеклообразное состояние, исключающее образование крупных, повреждающих клетки кристаллов льда. К таким криопротекторам относятся: ДМСО, спирты, амиды, моносахариды и др.
При использовании криопротекторов, непроникаюгдих в клетку, уменьшается поток воды через мембрану, а, следовательно, и осмотический стресс при замораживании внеклеточной воды. При этом внутриклеточное содержимое обезвоживается в степени, достаточной для того, чтобы внутриклеточная кристаллизация не вызывала летальных повреждений (Charleston, 1989). К таким криопротекторам относятся искусственные полимеры, полисахариды, пептиды, ляпиды и их производные, многие белки и др.
Все описанные криопротекторы токсичны для животных клеток, поэтому ученые до сих пор проводят поиск новых менее токсичных криозащитных веществ или разрабатывают различные модификации процедур замораживания-оттаивания с целью уменьшения токсического воздействия криопротектора. Так, например, Чао с коллегами предлагают использовать сочетания нескольких криопротекторов (Chao, Ііао, 2001). Чаще всего эта процедура оказывает положительное воздействие на жизнеспособность клеток животных после замораживания-оттаивания, когда в экспериментах используют криопротекторы, обладающие разными механизмами защитного действия, или когда один из криопротекторов способен снизить токсическое воздействие другого (Chen et al., 1993; Chao et al., 1997; Chao, Liao, 2001; Odintsova et al., 2001; Poncet, Lebel, 2003).
Животные
Экспериментальное исследование проводилось на морской биологической станции "Восток" Института Биологии моря ДВО РАН летом и осенью 2000-2002 г.
Морские ежи (Scaphechimts mirabilis, Strongylocentrotus nudus, St. intermedins) и моллюски {Mizuchopecten yessoensis, Mytilus trossulus) были собраны в заливе Восток Японского моря и во время всего эксперимента находились в ваннах с проточной аэрированной морской водой, как описывалось ранее (Odmtsova et al., 1999). Перед началом эксперимента животные были промыты 2-3 раза профильтрованной морской водой, обработанной ультрафиолетом.
Нерест морских ежей стимулировали инъекцией 0,5 М КС1 (0,2-0,3 мл) в область аристотелева фонаря. Нерест моллюсков стимулировали термическим шоком.
. Ллазмиды
В эксперименте мы использовали выделенную при помощи метода щелочного лизиса (Маниатяс и др., 1984) и очищенную плазмидную ДНК (рМА563 и рМА564), любезно предоставленную доктором М. Пташне (Harvard University, Cambridge, США).
Нативность іглазмидной ДНК проверяли электрофорезом в 0,8 % агарозном геле (Pharmacia, ABMBD Uppsula, Швеция) в однократном ТВЕ буфере. Гели прокрашивали бромистым этидием и просматривали в ультрафиолетом свете на трансиллюминаторе (Ultraviolet Products, INC, San Gabriel, California, США).
Концентрацию и чистоту выделенной плазмидной ДНК оценивали спектрофотометри-чески (RF-1501, Shimadzu, Япония).
В экспериментах использовали плазмидную ДНК с показателем чистоты (260/280 н.м.) не менее
Приготовление препаратов липидов
Ткани целых животных, мидии М. trossulus, морского ежа St indermedius и морской звезды Asterias amurensis, были гомогенизированы. Липиды были экстрагированы с помощью хлороформ-метанольной процедуры (Folch, 1957). Аликвоты общих липидных экстрактов были смешаны с нагретой культуральной средой (60-70 С) в течение 1-2 мин, и затем смесь была обработана ультразвуком (22 кГц, 1-2 мин). Липидные эмульсии были стабильны в течение 3-4 дней при 4 С.
. Замораживание клеточной суспензии
Клеточную суспензию помещали в стерильные микропробирки (криовиалы) по 0,33 мл и постепенно (по каплям, в течение 3-5 мин) добавляли раствор с криопротектором до 1 мл. В качестве криопротекторов использовали 10 %-ный раствор ДМСО (1,5 М), содержащий 0,2 % трегалозу в комбинации с 0,085 %-0,15 % содержанием общих липидных экстрактов морских беспозвоночных в виде липидных эмульсий (данная концентрация липидов была выбрана на основе ранее проведенных экспериментов, где тестировались препараты от 0,037 % до 0,5 %).
Для криоконсервации клеток морских беспозвоночных мы использовали только двух-этапный способ замораживания, как наиболее простой и достаточно эффективный (Odintsova, Tsal, 1995). После инкубирования клеточной суспензии в течение 30 минут при 10 С пробы помещали в криостат (MLW10, Германия) при -29 С на 15 минут, затем пробирки с клеточной суспензией переносили в жидкий азот (-196 С), где они хранились в течение нескольких суток.
. Оттаивание клеточных культур
Размораживание образцов производили на водяной бане при комнатной температуре при постоянном помешивании. Сразу после оттаивания 1 мл содержимого криовиалы переносили в центрифужную пробирку и постепенно, по каплям, добавляли 10 мл морской воды с антибиотиками, центрифугировали в течении 5 минут при 2000 об/мин (для выведения растворов криопротекторов из клеток). К осадку постепенно добавляли 1 мл среды Лейбовкча L-15 (Flow Laboratories, Grand Island, NY, США), модифицированной Одинцовой и Хоменко (Odintsova, Khomenko, 1991), содержащей 2 % эмбриональной сыворотки (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, США), инсулин 5 мг/л, а-токоферолацетат 1,75 мг/л, гентамицин 40 мг/л (Sigma Chemical Co., St. Luis, MO 63178, США) и гаутамнн 100 мг/л (Serva, Feinbiochemical, Heidelberg, Германия).
Жизнеспособность клеток оценивали с помощью модифицированной окраски трипа-новым синим (Phillips, 1973), проводя прямой подсчет клеток в камере Горяева. Размороженную клеточную суспензию культивировали при температуре 18 С в течение 1-2 суток в 24 золуночных плато (Coming, NY, США) при 19 С с последующей оценкой синтетической активности клеток.
. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) липидов
Температуры фазовых переходов тестированных общих липидных экстрактов были определены на дифференциальном сканирующем калориметре ДСК-2М (Пугцино, Россия): навеска лилидов (10 мг) в алюминиевых контейнерах помещалась в калориметр. Образцы замораживались и размораживались со скоростью 16 С в минуту в температурных пределах от -100 С до +80 С. Эта часть работы была выполнена совместно с профессором д.б.н Э.Я. Костецким и доцентом к.б.н. Н.М.Саниной
Трансфекция эмбрионов морских ежей
Концентрированная суспензия оплодотворенных яйцеклеток или эмбрионов морских ежей на разных стадиях развития (15, 45 минут и 6 часов после оплодотворения) была осаждена центрифугированием при 500 об/мин в течение 45 секунд (К-23, Heinz Janetzki K.-G. Maschinebau, Engelsdorf, Германия), осадок ресуспендирован в стерильной морской воде (2500-3000 эмбрионов/мл). Суспензия (500 мкл) была проинкубирована с плазмидной ДНК (0,01-2 мкг) в течение 1 минуты, затем добавлен раствор 15 % автоклавированного ПЭГ (Loba Feinchemie, м.м. 4000) на морской воде по каплям, до конечной концентрации 7,5 % (Odintsova et al., 2000; Bulgakov et al,, 2002). Эмбрионы инкубировали в климатической камере (19 С) в течение 15-20 минут, ступенчато отмывали в 9-ти объемах стерильной морской воды и осаждали при 500 об/мин (К-23) в течение 50-60 секунд. Осадок эмбрионов был ресуспендирован в стерильной морской воде (250-300 эмбрионов/мл) и перенесен в чашки Петри (40 мм, Ленинградский завод медицинских полимеров, Россия). Препараты наблюдали в течение 48-60 часов после трансфекции. В качестве контроля использовали эмбрионы, не подвергшиеся обработке ПЭГ и плазмидной ДНК.
Фотосъемка
При оплодотворении яйцеклеток морского ежа через 1-2 минуты появляется оболочка оплодотворения, после 20-30 минут развития для S. mirabilis или 30-40 минут для St. intermedins и St nudus, начинается первое деление. Появляется перетяжка и после 40-50 минут развития, появляются 2 бластомера, что свидетельствует о том, что первое деление закончилось. Через 13-14 часов после оплодотворения развивается бластула- первая стадия плавающей личинки, и через 24 часа - гаструла Аномалии в процессе развития морских ежей встречаются редко: в основном это экзогаструляция - когда по разным причинам не происходит полного впячивания эндодермы (Иванова-Казас, 1978).
При оплодотворении яйцеклеток М. yessoensis, М. trossulus через 24 и 12 часов соответственно развивается стерробластула, а через 24 часа для М. trossulus и 43 час для М. jessoensis - трохофора.
На рис. 4 представлены последовательно указанные стадии: оплодотворенная яйцеклетка плоского морского ежа через 20-30 (рис. 4 А) и 40-50 (рис. 4 Б) минут развития, соответственно. Трохофора моллюсков (рис. 4 В).
Рис. 4. Оплодотворенная яйцеклетка плоского морского ежа через 20-30 (А) и 40-50 (Б) минут развития. Трохофора моллюсков (В)
4.2. Криосохранение эмбриональных и соматических клеток морских беспозвоночных
4.2.1. Жизнеспособность личиночных и соматических клеток моллюсков и эмбриональных клеток морских ежей после замораживания-оттаивания
Создание источника клеток морских животных путем их криосохранення снимет проблему зависимости сроков исследования от сроков нереста животных. Кроме того, развитие этого направления необходимо и для создания генофонда редких и исчезающих видов морских беспозвоночных.
В общем, методика криосохранення или криоконсервирования сводится к тому, что биологический материал помещают в сверхнизкие температуры (жидкий азот, -196 С) в растворе со специальными веществами - криопротекторами, которые способны снизить повреждающие факторы при переохлаждении. Для успешной криоконсервации необходимо подобрать состав криопротекторных растворов.
Для морских беспозвоночных накоплен небольшой опыт работы по криоконсервации, поэтому поиск оптимальных криопротекторов для морских ежей и моллюсков является актуальной проблемой.
Важным при анализе криопротекторных свойств тестируемых веществ является способ оценки жизнеспособности клеток после замораживания-оттаивания. Об криопротекторных свойствах нельзя судить только по данным одного метода, поэтому мы оценивали жизнеспособность клеток по их способности включать в себя витальные красители и синтезировать РНК.
На основе используемых методов все клетки моллюсков и морских ежей в экспериментах по криоконсервации были разделены на 3 группы;
1) жизнеспособные: не окрашивались витальными красителями,
2) мертвые клетки: прокрашивались витальными красителями,
3)разрушенные клетки, которые были в пробах в виде обломков, их число считали по разнице между числом клеток до и после процедуры замораживания-оттаивания.
Данные, отражающие влияние разного состава криопротекторных растворов на жизнеспособность личиночных и соматических клеток моллюсков после замораживания-оттаивания, по сравнению с контрольными клетками, которые не подвергались воздействию низких температур, представлены на табл. 1.
