Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 16
1.1. Современные принципы коррекции нарушений микробиоценоза пищеварительного тракта животных и птиц 16
1.2. Микробиологические и технологические аспекты конструирования препаратов с пробиотическим действием 24
1.3. Критерии отбора микроорганизмов и их метаболитов в состав пробиотиков 35
1.4. Биологически активные вещества, синтезируемые бактериями рода Bacillus subtilis 42
1.4.1. Антибиотики, продуцируемые аэробными спорообразующими бактериями 42
1.4.2. Биосинтез бактериями рода Bacillus ферментов, аминокислот и других биологически активных веществ 51
1.5. Перспективы применения в ветеринарии пробиотиков, иммобилизованных на цеолитах 58
1.6. Применение аэросилов для улучшения реологических свойств пробиотиков 67
1.7. Использование в составе пробиотиков гидролизатов белкового сырья 76
1.8. Характеристика пробиотиков в различных лекарственных формах 86
1.9. Эффективность применения пробиотиков при желудочно-кишечных болезнях животных и птиц 100
2. Собственные исследования 113
2.1. Материалы и методы исследований 113
2.1.1. Микроорганизмы 113
2.1.2. Экспериментальные животные 114
2.1.3. Материалы, питательные среды, растворы, реактивы 114
2.1.4. Технологическое оборудование 115
2.1.5. Методы исследований 117
2.2. Результаты исследований 130
2.2.1. Характеристика компонентного состава препарата Бактистатин 130
2.2.1.1. Биологическая активность фугата культуральной жидкости штамма-продуцента Bacillus subtilis 130
2.2.1.2. Свойства цеолита, как компонента препарата 147
2.2.1.3. Исследование свойств гидролизатов соевой муки 177
2.2.2. Усовершенствование технологии производства препарата... 206
2.2.2.1. Концентрирование нативной культуры B.subtilis ТЛИ 13 и отделение фугатов 206
2.2.2.2. Выбор способа обезвоживания компонентов препарата 213
2.2.3. Приготовление опытных образцов препарата 218
2.2.4. Изучение биологической активности препарата 228
2.2.4.1. Острая и хроническая токсичность 228
2.2.4.2. Влияние препарата Бактистатин на физиологические показатели периферической крови животных 230
2.2.4.3. Влияние препарата на микрофлору кишечника животных 23 2
2.2.4.4. Изучение иммуногенных и адъювантных свойств препарата Бактистатин 233
2.2.4.5. Изучение антивирусной активности препарата 236
2.2.4.6. Оценка эффективности протективного действия препарата Бактистатин в комплексе с антибиотиком доксициклином при сибирской язве экспериментальных животных... 240
2.2.5. Разработка методов контроля препарата Бактистатин 255
2.2.6. Исследование стабильности свойств препарата Бактистатин в процессе хранения 260
2.2.7. Экспериментальные и производственные испытания препарата Бактистатин при патологии органов пищеварения молодняка сельскохозяйственных животных 267
2.2.7.1. Лечебно-профилактическая эффективность препарата Бактистатин при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят 267
2.2.7.2. Эффективность Бактистатина при желудочно-кишечных болезнях поросят 292
2.2.7.3. Профилактическая эффективность препарата Бактистатин при нарушениях обменных процессов у кур 312
2.2.8. Экономическая эффективность технологии препарата Бактистатин 316
2.2.9. Экономическая эффективность применения препарата Бактистатин при желудочно-кишечных болезнях животных 318
3. Обсуждение результатов исследований 322
4. Выводы 332
5. Практическое использование полученных научных результатов 335
6. Рекомендации по использованию научных выводов 336
7. Список использованной литературы 338
Приложения 376
- Микробиологические и технологические аспекты конструирования препаратов с пробиотическим действием
- Перспективы применения в ветеринарии пробиотиков, иммобилизованных на цеолитах
- Биологическая активность фугата культуральной жидкости штамма-продуцента Bacillus subtilis
- Лечебно-профилактическая эффективность препарата Бактистатин при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят
Введение к работе
Актуальность темы. Болезни, связанные' с нарушениями деятельности пищеварительного тракта животных и птиц, занимают одно из основных мест среди причин отхода молодняка. В этой связи разработка и внедрение в практику ветеринарии новых отечественных высокоэффективных биологических препаратов для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней (ЖКБ) животных и птиц является одной из наиболее актуальных задач биотехнологии (Панин А.Н., 2005; Самуйленко А.Я., 2003).
Перспективным направлением в данной области, по мнению многих отечественных и зарубежных специалистов, является конструирование пробиотиков нового поколения, разработка и совершенствование технологии их производства: изучение питательных потребностей перспективных пробиотических штаммов с целью подбора питательных сред для их культивирования; выяснение роли продуктов метаболизма и биологически активных веществ (БАВ) микробной клетки для определения-природы адгезинов, механизма колонизации слизистой и антагонизма; разработка технологий изготовления комплексных препаратов на основе консорциумов бактерий с широким спектром антагонистической активности (Воронин Е.С., 2003; Малик Н.И., 2002; Fuller R., Gibson., 2000 идр.).
К пробиотикам нового поколения ученые относят биопрепараты с иммобилизованными пробиотическими штаммами и их метаболитами, а также синтетические композиции препаратов-аутостимуляторов, конструируемых на основе принципа "Quorum Sensing".
По мнению Бондаренко В.М. (2005), одним из наиболее современных направлений в конструировании и совершенствовании пробиотиков является применение метаболитов бактерий, иммобилизованных на ионообменной матрице, при этом микроорганизмы и БАВ длительно сохраняют свою активность в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) животных.
Из представителей экзогенной микрофлоры бациллы и их метаболиты имеют ряд преимуществ, которые позволяют считать их наиболее перспективными в качестве основы пробиотиков нового
поколения (Сорокулова И.Б., 2000; Грязнева Т.Н., 2005). Эти бактерии (кроме B.anthracis и B.cereus), как правило, являются безвредными для организма животных даже в высоких концентрациях, обладают антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, характеризуются высокой ферментативной активностью, что может обусловить существенное регулирование и стимулирование пищеварения; способны оказывать противоаллергенное и антитоксическое действие; технологичны в производстве и стабильны при хранении.
В связи с этим конструирование препаратов на основе метаболитов бацилл, комбинаций их с ионообменными матрицами и питательными компонентами для профилактики ЖКБ сельскохозяйственных животных представляет собой актуальную проблему.
Цель работы. Создание комбинированного препарата с пробио-тическим действием на основе безотходной технологии и оценка его лечебно-профилактической эффективности при желудочно-кишечных болезнях сельскохозяйственных животных.
Задачи исследования.
1. Обосновать компонентный состав препарата с пробиотическим
действием и оценить биологические свойства его компонентов.
2. Выбрать метод выделения и концентрирования экзопродук-
тов микробного синтеза B.subtillis ТПИ 13 по безотходной техно
логии.
-
Приготовить лабораторные образцы препарата и изучить его биологические свойства.
-
Усовершенствовать существующую технологию пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus и определить методы контроля качества препарата.
-
Изучить лечебно-профилактическую эффективность препарата Бактистатин при ЖКБ разных видов сельскохозяйственных животных.
6. Рассчитать экономическую эффективность безотходной
технологии препарата Бактистатин и его применения при ЖКБ жи
вотных.
7. Разработать и утвердить нормативную документацию на пре
парат Бактистатин и внедрить его в ветеринарную практику.
Научная новизна. Впервые на основе инактивированного фуга-та культуральной жидкости спорообразующего штамма B.subtilis ТПИ 13, иммобилизованного на природном цеолите в смеси с гид-ролизатом соевой муки и аэросилом, получен отечественный комбинированный препарат с пробиотическим действием Бактистатин широкого спектра лечебно-профилактической эффективности.для ветеринарии.
Обоснована возможность использования в составе препарата эк-зопродуктов микробного синтеза B.subtilis, природного цеолита, гидролизата соевой муки (ГСМ) и аэросила.
Создана промышленная безотходная технология производства пробиотического препарата Бактистатин и пробиотиков Биоспорин и БИОД-5 на единой аппаратурно-технологической линии, за один технологический цикл, в различных лекарственных формах (сухой, таблетированной, капсулированной), с использованием отечественного технологического оборудования и материалов.
Определены биологические свойства-, препарата Бактистатин, отличающие его от существующих пробиотиков возможность его применения в комплексе с антибиотиками при инфекционных болезнях животных и птиц, в том числе при особо опасных зооантро-понозных заболеваниях; способность подавлять размножение сальмонелл, кандид и стафилококков; стимулировать рост лакто-бацилл и; бифидобактерий in vitro ив ЖКТ животных; улучшать перевариваемость кормов; проявлять адсорбционное, противовирусное, антитоксическое, иммуностимулирующее и адъювантное действия.
Показана высокая (96-100 %) лечебно-профилактическая эффективность готовых лекарственных форм препарата Бактистатин при ЖКБ телят, поросят, кур.
Научная новизна работы подтверждена положительным решением Российского агентства по патентам и товарным знакам по заявке № 2005138934 от 15.12.2005 г. «Препарат для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта «Бактистатин».
Практическая значимость работы. В практику ветеринарии Российской Федерации внедрен первый отечественный комбинированный пробиотический препарат Бактистатин, обладающий
6 широким спектром лечебно-профилактической эффективности.
Разработаны и утверждены ТУ 9384-002-71368318-06 на препарат Бактистатин; промышленный регламент производства препарата Бактистатин в сухой, таблетированной и капсулированной формах (12.01.2006 г. № 3457); разработана инструкция по применению препарата Бактистатин для лечения и профилактики дисбакте-риозов ЖКТ и повышения естественной резистентности организма сельскохозяйственных животных.
В соответствии с порядком регистрации ветеринарных препаратов в Российской Федерации, нормативная документация и отчеты об испытании препарата Бактистатин прошли экспертизу в профильной лаборатории ФГУ ВГНКИ. Регистрационные испытания подтвердили соответствие показателей качества препарата Бактистатин требованиям ТУ (экспертное заключение от 11.09.2006).
На аппаратурно-технологической линии пробиотиков Биоспо-рин и БИОД-5 в Центре военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ (ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, г. Екатеринбург) создана безотходная технология производства препарата Бактистатин в различных лекарственных формах (акт внедрения от 20.12.2005 г.).
На телятах, поросятах и курах изучен механизм действия препарата Бактистатин. Дана оценка его влияния на микробиоценоз кишечника, обменные и иммунные процессы организма животных, показана высокая лечебно-профилактическая эффективность, что подтверждено актами, утвержденными руководителями хозяйств Московской и Челябинской областей.
Протективное действие препарата Бактистатин на микрофлору организма животных при комплексном применении его с антибиотиками позволяет существенно снизить последствия химиотерапии.
Установленные противовирусные адсорбционные свойства препарата Бактистатин значительно расширяют спектр его лечебно-профилактической эффективности.
Разработаны и утверждены ВНИИМС методики «Активность микроорганизмов (бактерий и грибов) метаболическая. Методика экспресс-обнаружения в продовольственном сырье и пищевых
/S
7 продуктах при помощи кондуктометрического анализатора «Маль-тус-V» (МИ 2467-98) и «Хроматографическис параметры бактерий в биологических жидкостях, смывах и .продуктах питания. Методика идентификации по количественному содержанию жирных кислот при помощи газовых хроматографов «Кристалл-2000М», «Хромпак СР 2002» и аналогичных» (МИ 2468-98), в которых изложены количественные и качественные методы исследований нормофлоры, выявления и идентификации патогенных микроорганизмов, для диагностики ЖКБ и дисбактериозов, а также оценки физиологического состояния по выявлению метаболизма жирных кислот (липидный обмен).
Разработаны и утверждены Комитетом по здравоохранению правительства Санкт-Петербурга методические рекомендации «Коррекция нарушений кишечного микробиоценоза пробиотиком на основе природного адсорбента» (от 26.04.2005 г.).
Результаты исследований по усовершенствованию технологии пробиотиков БИОД-5 и Биоспорини созданию безотходной технологии препарата с пробиотическим действием Бактистатин используются в учебном. процессе по дисциплине «Биотехнология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина.
На защиту выносятся следующие положения и результаты.
-
Теоретическое и экспериментальное обоснование компонентного состава и формы выпуска препарата Бактистатин на основе инактивированной культуральной жидкости, содержащей экзопро-дукты метаболизма B.subtilis ТПИ-13, иммобилизованные на природном адсорбенте-цеолите в смеси с гидролизатом соевой муки и аэросилом.
-
Промышленная безотходная технология производства пробиотиков Биоспорин, БИОД-5 и пробиотического препарата Бактистатин за один технологический цикл производства, на единой ап-паратурно-технологической линии.
3. Результаты лечебно-профилактической эффективности'ком
бинированного препарата с пробиотическим действием Бактиста
тин при желудочно-кишечных болезнях разных видов сельскохо
зяйственных животных.
4. Протективное действие препарата Бактистатина при ком-
плексном его применении с антибиотиком на модели острого инфекционного процесса.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и представлены в материалах IV Международной научной конференции «Методы кибернетики химико-технологических процессов» (Москва, 1994); научной конференции «Медико-биологические и профилактические проблемы адаптации населения к современным экологическим условиям жизни» (Архангельск, 1994); Всероссийской научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний» (Биотехнология. - Киров, 1998); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 2003); научно-практической конференции, посвященной 55-летию образования Центра ВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Эпидемиология. Микробиология. Биотехнология. Экология» (Екатеринбург, 2004); Ш съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2005); II Международной научно-практической конференции Медбиотек «Перспективы развития биотехнологии в России» (Пущино, 2005); VIII Международного Славяно-Балтийского научного форума "Санкт-Петербург — Гастро-2006"; Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова (Санкт-Петербург. 2006); Международном симпозиуме по ядерной, биологической и химической безопасности (Тампере, Финляндия, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 научных работ, из них 9 статей в научных журналах, 13 - в материалах научных конференций; методические рекомендации, утвержденные Комитетом по здравоохранению правительства Санкт-Петербурга; 2 главы книги «Питание, микробиоценоз и интеллект человека».
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 375 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию
9 научных выводов, список использованной литературы (362 источника, из которых 259 отечественных и 103 иностранных). Работа содержит 161 таблицу, 27 рисунков, 42 страницы приложений.
Микробиологические и технологические аспекты конструирования препаратов с пробиотическим действием
В ряду важнейших достижений современной биологической науки главное место занимает фундаментальное познание многих сторон взаимодействия организма человека и животных с эндогенной и экзогенной микрофлорой, создание и широкое внедрение в практику здравоохранения и ветеринарии биопрепаратов из живых микробных культур, в частности, пробиотиков/3, 6, 20,97, 124, 135, 255/.
Впервые термин "пробиотик " был предложен Lilly D.M. и Stilwell R.H. в 1965 г. /331/ как антоним антибиотику для обозначения микробных метаболитов, обладающих способностью стимулировать рост каких либо микроорганизмов. Последующие достижения позволили внести изменения в первоначальное определение пробиотиков. В 1974 г. Parker R. /338/ использовал термин "пробиотики" для обозначения микробных препаратов, обладающих способностью регулировать микробную экологию кишечника. По его определению пробиотики - это микроорганизмы или их компоненты, способные поддерживать баланс кишечной микрофлоры.
По мнению Шендерова Б.А. и др. /249-254/, любые живые или убитые микроорганизмы, их структурные компоненты, метаболиты, а также вещества другого происхождения, оказывающие позитивное влияние на функционирование микрофлоры хозяина, могут рассматриваться как пробиотики. Исходя из этого определения, авторы предлагают выделять следующие группы пробиотиков: препараты, содержащие живые микроорганизмы; препараты, содержащие структурные компоненты микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры или их метаболиты; препараты микробного или иного происхождения, стимулирующие рост и активность нормальной микрофлоры; препараты, представляющие собой комплекс живых микроорганизмов, их структурных компонентов и метаболитов в различных сочетаниях и соединений, стимулирующих рост представителей нормальной микрофлоры; препараты на основе живых генно-инженерных штаммов микроорганизмов, их структурных компонентов и метаболитов; продукты функционального питания на основе живых микроорганизмов, их метаболитов, других соединений микробного, растительного или животного происхождения, способных поддерживать и восстанавливать здоровье через коррекцию микробной экологии организма хозяина.
По мнению Малик Н.И., Панина А.Н., Смирнова В.В. /123-125, 153-156, 196-206/, штаммы бактерий, включаемые в состав пробиотиков должны: быть изолированы из организма хозяина; быть полезными для организма хозяина, что должно быть подтверждено лабораторными исследованиями и клиническими испытаниями; быть безопасными при длительном применении; обладать высоким колонизирующим потенциалом (устойчивыми к низким значениям рН, желчным кислотам, антимикробным субстанциям, высокой адгезией к эпителию слизистой); обладать стабильными характеристиками в клиническом и технологическом плане; при введении в больших количествах обладать минимальной способностью к транслокации во внутреннюю среду организма; обладать высокой скоростью роста.
Рядом авторов показано, что пробиотики эффективны не только при ЖКБ, но и при эндометритах коров, радиационных и радиационно-термических поражениях/49, 56, 57, 140, 188, 282, 292, 293, 308/.
В соответствии с этой концепцией в РФ и за рубежом при конструировании пробиотических препаратов для медицинских и ветеринарных целей используют два методологически различающихся принципа выбора микроорганизмов-антагонистов/181,193, 199,209/.
Первый из них, наиболее распространенный и интенсивно развивавшийся в течение нескольких десятилетий, прежде всего учеными и медиками России Л.Г.Перетцом, Г.И.Гончаровой, Р.П.Чуприниной и др. /61, 162/, исходит из распространенного представления о нормомикрофлоре, наиболее характерными представителями, которой считаются бифидобактерии, колибактерии, лактобактерии и бактероиды. Эти микробы колонизируют слизистую оболочку кишечника, образуя за счет присущих им адгезионных свойств на ней своего рода защитную "биопленку". Значение данных микроорганизмов для организма человека и животного бесспорно, многогранно, что признается всеми авторами. На сегодня достаточно широко изучены и описаны в учебной, научной и методической литературе изменения микробиоценоза при инфекционных и других заболеваниях, приводящих к дисбактериозу. В числе главных симптомов существенные количественные и качественные нарушения нормомикрофлоры, и, как следствие - локальные или распространенные участки слизистой кишечника, лишенные защитной "микробной пленки". Поэтому коррекция подобных нарушений посредством так называемого "повторного заселения" кишечника при использовании пробиотиков представителями нормомикрофлоры теоретически логична и практически оправдана, что подтверждается многолетним лечебным опытом.
Другой принцип заключается в применении для создания пробиотических препаратов непатогенных аэробных спорообразующих бацилл. Микробы рода Bacillus распространены во внешней среде и обладают более выраженными полезными биологическими свойствами (прежде всего, антагонистической активностью и ее спектром) по сравнению с бифидо-, коли- и лактобактериями. В составе данных препаратов, помимо собственно бактерий-антагонистов, содержатся также различные биологически активные вещества (БАВ), являющиеся продуктами метаболизма этих базовых (производственных) штаммов микробов при их росте, развитии и размножении на плотных и в жидких питательных средах, используемых для накопления биомассы. В числе таких метаболитов могут идентифицироваться различные БАВ: бактериоцины, антибиотикоподобные субстанции и, даже, антибиотики, аминокислоты, ферменты, пептиды и полипептиды, полисахариды, витамины и провитамины, нуклеотиды и др. Спектр рассматриваемых БАВ индивидуален для каждого конкретного пробиотического штамма и по основным слагаемым детерминирован, в первую очередь, метаболическими характеристиками, используемых в нем базовых штаммов микроорганизмов-продуцентов /206/.
Перспективы применения в ветеринарии пробиотиков, иммобилизованных на цеолитах
По определению Кощеенко К.А. и Бирюкова В.В. /38, 109/, иммобилизованные пробиотики - это искусственно связанные живые микроорганизмы естественной микрофлоры теплокровных организмов или их активные метаболиты с нерастворимым носителем без изменения своих каталитических свойств.
Коадгезия прокариот является общебиологическим свойством и обеспечивает эндотрофной микрофлоре биотопов селективное преимущество. Идея создания иммобилизованных пробиотиков основана на лий ииридш IVlb.
Несколько лет в отделе экологической геологии Сибирского научно-исследовательского института геологии, геофизики и минерального сырья (СНИИГГиМС) под руководством профессора В.И.Бгатова изучался вещественный состав «зверовых солонцов» - мест активного посещения дикими животными. Исследование животных показало, что материал, обнаруживаемый в их экскрементах, по минеральному составу не идентичен съеденному. Изменения «съедобных», нерастворимых в воде минералов, прошедших пищеварительный тракт животных, выражаются, по данным многочисленных анализов, в некотором обогащении или обеднении их обменными элементами или элементами-примесями. В результате одного из многочисленных исследований, месторождений в Центральном Сихотэ-Алине, были отобраны и проанализированы две специальные пробы. Одна из них - порода из поедок лося, другая - отмытая из его экскрементов. Главные минералы и в поедах, и в экскрементах на 90% были представлены цеолитами (преимущественно гейландитом, меньше клиноптилолитом), в примеси 10% - монтмориллонитом /23-29/.
Цеолиты - кристаллические каркасные алюмосиликаты, представляющие нестехиометрические кристаллогидраты. Они широко распространены в земной коре и являются породообразующими минералами. В природе известно около 50 структурных типов цеолитов, но лидирующее место по практическому применению в настоящее время занимает клиноптилолит.
Минерал является молекулярным ситом с антиситовым механизмом действия и обладает строго калиброванным размером пор (3-6 А). Следовательно, он способен проявлять сорбционные свойства только по отношению к ионам макро- и микроэлементов и соединениям с небольшими размерами молекул (метан, аммиак, сероводород и др.), не вступая в прямое взаимодействие с витаминами, белками, аминокислотами и другими сложными органическими соединениями (рис. 2).
Многолетние комплексные минералого-физико-химические исследования природных цеолитов показали их высокую ионообменную емкость (2,5 мл-экв/г) и селективность по отношению к ряду ионов в электролитах сложного состава. Эта специфическая кристаллическая минеральная структура цеолита не разрушаемая при измельчении, отлично проявляет себя в организме, привязывая к себе такие токсические вещества как аммиак и другие соединения азота, а также тяжелые металлы и выделяя их из кишечника обменными процессами. Удаленные токсические вещества заменяются теми минералами, в которых настоятельно нуждается организм. Таким способом поддерживается или восстанавливается гомеостаз организма, и особенно минеральный обмен. Благодаря этому наиболее уязвимые системы органов как мозг, нервная, гормональная, иммунная системы, печень не только получают защиту от токсинов, но и увеличивают свою сопротивляемость вредным патогенным воздействиям.
Области применения природных цеолитов обусловлены их адсорбционными и ионообменными свойствами, химическим составом, а также термической, химической и радиационной устойчивостью. Биогенность химического состава природных цеолитов, в частности, его потенциал в качестве источника макро- и микроэлементов, обуславливает их применение в здравоохранении, ветеринарии и пищевой промышленности.
Результат воздействия препаратов цеолита и кремниевого геля на физиологические функции при пероральной аппликации наблюдается в увеличении абсорбционной поверхности стенок кишечника и ткани на месте воздействия, увеличении значений кислотно-щелочного баланса в клетке и во внеклеточной матрице, селективной пролиферации аминокислот, пептидов и протеидов, активации и оптимизации калийно-натриевого нагнетания в клетке, связанных свободных радикалов, транспортировке (доставке) сахара из крови в клетку без помощи инсулина, связывании токсических и вредных веществ, регуляции гомеостаза минерального обмена.
Химический состав цеолита Холинского месторождения представлен: Si20 - 66,42-66,5%; СаО - 1,89%; Ті20 - 0,086-0,09%; MgO - 0,23-0,59%; АІ203 -12,24-12,5%; К20 - 2,2-2,69%; Fe203 - 1,39-1,51%; Na20 - 1,75-1,98%; FeO -0,04-, 12%; MnO - 0,19-0,2%; CaO - 1,61-1,65%; H20 - 10,0%, а также титана -0,06-0,13%, марганца - 0,12-0,18%, молибдена - до 0,0002%, меди - 0,0005%», свинца - до 0,0054%, цинка - до 0,006%).
В 1970-х годах было установлено, что кремний является минеральным веществом, необходимым для жизнедеятельности человека и животных. Эксперименты на животных показали, что наибольшие концентрации кремния содержатся в коже и соединительной ткани (хрящах, костях и др.). У цыплят, выращенных на рационе, в котором не было кремния, наблюдались серьезные деформации в строении черепа, костей, суставов и хрящевой ткани. Было также установлено, что в цыплятах, выращенных на рационе, включающем кремниевую добавку, было значительно больше хряща и воды по сравнению с группой цыплят, выращенных на фоне дефицита кремния. Более высокие уровни воды в костях кур, получавших кремниевую добавку, коррелируют с высоким уровнем в хрящевой ткани глюкозаминогликаноь, полисахаридов с длинной цепью, образующих жидкие вещества, которые содержатся в суставах, хряще и сухожилиях. С учетом того факта, что кремний является незаменимым микроэлементом, специалисты в области питания предположили, что его дефицит имеет отношение к причинам развития ряда заболеваний, в том числе атеросклероза, остеартрита и гипертензии, а также процесса старения /271/.
Биологическая активность фугата культуральной жидкости штамма-продуцента Bacillus subtilis
Штамм Bacillus subtilis ТПИ 13-07.06.21-ДЗП/ВГНКїї выделен в естественных условиях внешней среды животноводческих помещений и депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ООО «Научно-производственной компании Центр медико-ветеринарных экологических исследований» и является одним из основным компонентов пробиотика БИОД-5. Результаты изучения культурально - морфологических и биохимических свойств штамма-продуцента представлены в таблице 9.
Результаты изучения основных физиолого-биохимических свойств штамма-продуцента представлены в таблице 10.
Выбранный штамм характеризуется отсутствием гемолитической активности, у него не обнаружены ферменты, которые могут обуславливать патогенные свойства (лецитиназа, гиалуронидаза). При изучении иммуномодулирующей активности B.subtilis ТЛИ 13 и ее фугатов было установлено, что на фоне их применения фагоцитарная активность макрофагов у экспериментальных животных увеличилась в среднем на 5 % для бацилл и на 3,2 % для фугатов по сравнению с контрольными животными (табл. 11).
Штамм-продуцент Bacillus subtilis характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Зоны угнетения роста тест-культур представлены в таблице 12.
Установлено, что штамм B.subtilis ТПИ 13 характеризуется широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных (Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Pseudomonas и др.) и условно-патогенных (Proteus, Klebsiella, Candida и др.) микроорганизмов и не оказывает ингибирующего действия на лактобациллы и бифидобактерии. Кроме того, штамм-продуцент проявляет внутриродовой антагонизм по отношению к вакцинным штаммам возбудителя сибирской язвы.
Характерной особенностью штамма B.subtilis является способность подавлять развитие кандид и стафилококков. Высокая антагонистическая активность к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам является наиболее значимым свойством, определяющим выбор пробиотических штаммов и их метаболитов для конструирования пробиотиков.
Биологические свойства фугата В. subtilis в полной мере соответствуют свойствам микроорганизмов-продуцентов. Синтезируемые ими биологически активные вещества концентрируются в процессе ферментации в культуральной жидкости, а после отделения живых клеток зачастую не используются. На этапе исследований биологической активности выделенных из культуральной жидкости продуктов метаболизма B.subtilis было установлено, что при выпуске согласно принятой технологии пробиотика БИОД-5 ряд из синтезируемых бациллами экзо- и эндогенных БАВ (в первую очередь протеолитические и амилолитические ферменты, гексозамины и др.), накапливающихся в культуральной жидкости к завершению цикла получения микробной биомассы в ферментерах, после концентрирования на сепараторах определяется в значительных количествах в фугатах, подлежащих утилизации.
Перечень определяемых при производстве БИОД-5 БАВ, синтезируемых B.subtilis при глубинном выращивании, согласно данным литературы и результатам собственных исследований, достаточно представительный, а проявление их биологической активности является неотъемлемой составляющей лечебно - профилактических свойств нового пробиотика Бактистатина.
С учетом высоких продуцирующих свойств микроба B.subtilis правомерно ожидать продукцию им пиримидиновых и пуриновых оснований и соответствующих цуклеотидоз и накопление их Б культуральной жидкости. Для решения этой задачи был разработан метод хроматографического анализа с использованием референсных образцов пуриновых и пиримидиновых оснований. В данной работе использовали ВЭЖХ фирмы "Шимадзу" с соответствующим программным обеспечением.
В таблице 13 приведены биологические и физико-химические характеристики фугатов культуры B.subtilis ТЛИ 13, выращенной в среде № 5 в течение 32 ч в биореакторе БИОР-0,25, после приготовления 2-х дозного БИОД-5, результаты определения в них протеолитической (ПА) и амилолитической (АА) активности, концентрации общих и свободных (внеклеточных) гексозаминов и диаминопимелиновой кислоты.
Лечебно-профилактическая эффективность препарата Бактистатин при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят
Дачу препарата Бактистатин осуществляли во время утреннего и вечернего кормления телят, добавляя различные дозы препарата в молоко животным опытных групп и выпаивая из сосковой поилки или из ведра. На первом этапе были определены дозы, кратность и продолжительность применения препарата новорожденным телятам. Были сформированы 5 опытных групп по 10 голов в каждой из новорожденных телят в возрасте 2-3 дней, которые получали препарат Бактистатин с молоком в следующих дозах: 0,3 г/гол; 0,5 г/гол; 1,0 г/гол; 1,5 г/гол; 2,0 г/гол 2 раза в день в течение 6 дней. Кроме того, из телят-аналогов были сформированы 2 контрольные группы по 10 голов в каждой. Животные I контрольной группы получали бифидумбактерин, согласно наставлению, по 1 дозе 3 раза в день в течение 3 дней. Животные II контрольной группы не получали никаких препаратов. От телят опытных и контрольных групп брали кровь из яремной вены -до начала опыта, на 3, 7 и 14 дни для гематологических исследований и определения уровня сывороточных иммуноглобулинов. Для проведения бактериологических исследований от опытных и контрольных животных брали фекалии на 3, 7 и 14 дни опыта для определения количественного и качественного состава кишечной микрофлоры по методу F. Б. Эпштейн-Литвак и Ф. К. Вилынанской в модификации К. Я. Соколовой /40/. Определяли антибиотикочувствительность выделенных бактерий. Телята опытных и контрольных групп находились под ежедневным клиническим наблюдением, при этом особое внимание обращалось на деятельность желудочно-кишечного тракта, учитывались наличие, характер и продолжительность отклонений организма телят от возрастной и физиологической нормы. В результате проведенных исследований было установлено, что использование препарата Бактистатин в дозе 1,0 г 2 раза в день в течение 6 дней обеспечивало высокий профилактический эффект при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят (90 %) и в дальнейшем мы ориентировались на дозу препарата - 2 г в сутки. Результаты исследований профилактической эффективности препарата Бактистатин представлены в таблице 128.
Оценивая клиническое состояние животных, получавших препарат Бактистатин, следует отметить, что все подопытные животные за весь период наблюдения (20 дней) хорошо развивались, имели блестящий шерстный покров, были более активными в поведении и приеме корма, что подтверждается результатами контрольного взвешивания телят. У телят опытных профилактических групп привесы составили от 510,0 до 600,0 г в сутки, тогда как в контроле привесы не превышали 400,0 г (от 370,0 до 400,0). Клинический контроль за телятами опытных профилактических групп показал наибольшую профилактическую эффективность препарата Бактистатин в III, IV и V опытных группах. В опытных группах, где использовали препарат Бактистатин в дозах от 1,0 до 2,0 г 2 раза в сутки заболело по 1 теленку и профилактическая эффективность препарата в этих группах была одинаковой и составила 90 %. В I опытной группе, где телята получали препарат Бактистатин в дозе 0,3 г 2 раза в день, заболело 3 теленка, профилактическая эффективность составила 70 %, а длительность заболевания равнялась 4-6 дням. Во II опытной группе, где телята получали препарат Бактистатин в дозе 0,5 г 2 раза в день, заболело 2 теленка, профилактическая эффективность составила 80 %, а длительность заболевания равнялась 3-4 дням. Профилактическая эффективность бифидумбактерина составила 60 %. В контрольной группе, где с профилактической целью никакие препараты не применялись, клиническая картина диареи наблюдалась у всех животных, заболевание протекало тяжелее, чем у заболевших телят опытных групп и продолжительность болезни составила 7-9 дней. Учитывая результаты данного опыта, для определения оптимальной кратности и длительности введения препарата Бактистатин с профилактической целью нами было создано 4 группы новорожденных телят-аналогов, но 10 голов в каждой - 3 опытные и і контрольная. Телятам I опытной группы препарат давали с молоком в дозе 1,0 г 2 раза в день 6 дней подряд; телятам II опытной группы препарат давали в дозе 1,0 г 1 раз в день 6 дней подряд; телятам III опытной группы препарат давали в дозе 1,0 г 1 раз в день 3 дня подряд; телятам контрольной группы никаких препаратов с профилактической целью не давали. Результаты исследований представлены в таблице 129. Как следует из таблицы 129, в I опытной группе телят, получавших препарат, где телята получали препарат Бактистатин в дозе 1,0 г 2 раза в сутки, заболел 1 теленок. Профилактическая эффективность препарата составила 90 %. Было установлено, что применение препарата Бактистатин в дозе 1,0 г 1 раз в день в течение 6 дней и в дозе 1,0 г 1 раз в день в течение 3 дней не обеспечивает такую же профилактическую эффективность при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят и составляет только 80 %. Анализируя полученные результаты, мы сделали следующие выводы: 1. Оптимальной профилактической дозой препарата Бактистатин при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят является 1,0 г при кратности его введения 2 раз в день в течение 6 дней. При этом профилактическая эффективность препарата составляет 90 %. 2. Профилактическая эффективность бифидумбактерина при желудочно- кишечных болезнях новорожденных телят составила 60 %. Оценивали в динамике гематологические показатели телят опытных и контрольных групп. Результаты гематологических исследований представлены в таблице 106. Анализируя лейкограмму телят опытных и контрольных групп, можно отметить, что гематологические показатели, представленные в таблице 106, согласуются с клиническим состоянием телят, а все показатели крови перед экспериментом соответствовали физиологической норме. У телят как опытных, так и контрольных групп, к 7 дню эксперимента увеличивается число эозинофилов. Так как основной функцией этих клеток является участие в аллергических реакциях, то возможно, что увеличение концентрации эозинофилов объясняется стрессом, связанным с взятием крови в эти сроки. У телят опытных групп наблюдается увеличение числа эозинофилов, моноцитов и высокий уровень сегментоядерных нейтрофилов, что свидетельствует о более стабильном клиническом состоянии телят опытных групп, по сравнению с контролем.
Похожие диссертации на Комбинированный пробиотический препарат Бактистатин и его эффективность при желудочно-кишечных болезнях сельскохозяйственных животных
