Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 13
1.1. Механизм действия пробиотиков на организм животных 13
1.2. Критерии отбора микроорганизмов в состав пробиотиков ветеринарного назначения 29
1.3. Характеристика лекарственных форм пробиотиков 36
1.4. Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus, используемые в ветеринарии 44
1.5. Лечебно-профилактическая эффективность пробиотиков при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят 55
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 66
2.1. Материалы и методы 66
2.2. Результаты исследований 75
2.2.1. Приготовление опытных образцов жидкой формы пробиотика Биод-5 75
2.2.2. Оценка биологических свойств жидкой формы Биод-5 82
2.2.2.1. Острая и хроническая токсичность препарата Биод-5 82
2.2.2.2. Влияние препарата Биод-5 на физиологические показатели периферической крови животных 83
2.2.2.3. Влияние Биод-5 на микрофлору кишечника животных 84
2.2.2.4. Изучение антивирусной активности Биод-5 86
2.2.3. Технология промышленного производства пробиотика Биод-5
в жидкой лекарственной форме 88
2.2.4. Методы контроля качества препарата Биод-5 100
2.2.5. Лечебно-профилактическая эффективность жидкой лекарственной формы пробиотика Биод-5 при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят 106
2.2.6. Экономическая эффективность применения жидкого пробиотика Биод-5 при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят 121
3. ОБСУЖДЕНИЕ'РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ. 125
4. ВЫВОДЫ 131
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. 132
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 133
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 135
ПРИЛОЖЕНИЯ
- Механизм действия пробиотиков на организм животных
- Материалы и методы
- ОБСУЖДЕНИЕ'РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Введение к работе
Актуальность темы. Болезни, связанные с нарушениями деятельности желудочно-кишечного тракта животных, занимают одно из основных мест среди причин отхода молодняка в хозяйствах промышленного типа. В этой связи, проблема профилактики желудочно-кишечных болезней молодняка, возбудителями которых являются условно-патогенные микроорганизмы, считается одной из наиболее актуальных задач ветеринарной практики (3, 17, 40).
Желудочно-кишечные болезни новорожденных телят распространены повсеместно, развиваются с первых часов жизни животного, сопровождаются тяжелыми токсическими явлениями, характеризуются высокой смертностью и наносят значительный экономический ущерб животноводческой отрасли. Согласно данным ежегодной статистической отчетности, представленной Департаментом ветеринарии РФ, заболеваемость телят, протекающих с поражением желудочно-кишечного тракта, достигает 65-70 % от числа народившихся, а падеж среди заболевших составляет 40-60 % (26,41).
Во многих странах отмечена тенденция роста желудочно-кишечных заболеваний у молодняка крупного рогатого скота. Имеется большое число работ, в которых обоснована взаимосвязь этих болезней с нарушениями в кишечной микроэкологии и, в первую очередь, с дефицитом нормальной кишечной микрофлоры. Замедление сроков формирования кишечного биоценоза у молодняка высокопродуктивных животных стало общепризнанным фактом (7, 14, 58, 217,245).
Опыт применения антибиотиков показал, что в данной ситуации они не обладают должной эффективностью. Безуспешные попытки контролировать проблему путем чередования схем применения антибиотиков и химиопрепа-ратов, в том числе и нового поколения, не дали желаемого результата, а напротив, усугубили ее. Негативные последствия фармакологического прессинга, усиленные антропогенной и техногенной нагрузкой на среду обитания животных, привели к резкому истощению резервов адаптационных систем организма молодняка и выразились в изменчивости циркулирующих в хозяйстве бактерий и вирусов, в развитии множественной лекарственной резистентности и усилении факторов патогенности у таких представителей микроорганизмов кишечника, как эшерихии, сальмонеллы, энтерококки, протей, клебсиеллы, кампилобактерии, стафилококки и другие. Наряду с этой проблемой значительно возросла угроза попадания остаточных количеств лекарственных веществ в пищу человека, что достаточно часто является причиной возникновения аллергических состояний у детей и взрослых, а также способствует появлению антибиотико-устойчивых инфекционных очагов (37, 218).
Ужесточение требований к экологической безопасности продукции животноводства заставило во всем мире пересмотреть многие методологические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, возбудителями которых является условно-патогенная микрофлора. Актуальная задача ветеринарной практики - снижение потерь от желудочно-кишечных заболеваний, неразрывно связана с изысканием способов нормализации кишечного биоценоза и снижения риска контаминации желудочно-кишечного тракта условно-патогенной микрофлорой с повышенными вирулентными свойствами (87, 103, 146).
Это обстоятельство заставило признать необходимость получения нового поколения экологически безопасных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты животных (2, 47, 85,235).
Наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотические препараты, в состав которых входят живые бактерии из числа основных представителей нормального кишечного биоценоза, такие как лактобациллы, би-фидобактерии, стрептококки и другие (81, 94, 164, 275).
Исследования последних лет показывают, что нормальная микрофлора кишечника является весомым физиологическим компонентом, эволюционно связанным с макроорганизмом, положительное влияние которой далеко не ограничивается антагонистическим эффектом. Нормальная кишечная микрофлора обеспечивает физиологическую целостность многих систем организма, связанных с формированием общей лимфоретикулярной иммунной системы и локального местного иммунитета слизистой кишечника, периферической иммунной системы, гормональной и эндокринной систем. Бактерии-пробионты осуществляют в кишечнике животных синтез аминокислот, ферментов и витаминов, участвуют в общем метаболизме, частично восполняют недостаток белков животного происхождения, ускоряют процессы переваривания и усвоения кормов (131,159,208,222,239).
В последние годы установлено, что не менее важны в микро биоценозе желудочно-кишечного тракта животных и человека и некоторые экзогенные бактерии, например, рода Bacillus. Среди различных представителей экзогенной микрофлоры, бациллы (кроме B.antracis и В,cereus) характеризуются рядом преимуществ, которые позволяют считать их перспективными в качестве основы новых пробиотиков. Эти микроорганизмы широко распространены в природе; являются безвредными для человека и животных; характеризуются высокой ферментативной активностью; являются устойчивыми к литическим и: пищеварительным ферментам; синтезируют различные бактериоцины, что обуславливает их антагонистическую активность в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Кроме того, эти бактерии технологичны в производстве, устойчивы к широкому диапазону температур, стабильны при хранении, экологически безопасны (170, 265).
Ветеринарной практикой востребованы препараты в различных лекарственных формах (жидкой, сухой, гранулированной, таблетированной и др), в зависимости от вида животных и способов их содержания (64).
Однако традиционными лекарственными формами для пробиотиков являются, в основном, лиофильно высушенные препараты, технология производства которых предусматривает использование дорогостоящего оборудования, трудоемкие и длительные по времени технологические стадии, что приводит к повышению себестоимости препаратов (88).
Таблеточные лекарственные формы, содержащие лактобациллы и бифи-добактерии, хотя и были разработаны в свое время, однако массового их выпуска не осуществлялось, вследствие высокой инактивации бактерий при прессовании и низкой последующей сохраняемости биологических свойств (108).
Пробиотики в жидкой форме особенно удобны для применения в животноводстве, не нуждаются в предварительной подготовке перед дачей животным, равномерно смешиваются с сухим и жидким кормом, с водой, молоком и др., а себестоимость таких препаратов сравнительно невысока, т.к. при их производстве не требуется дорогостоящих операций по высушиванию, измельчению, прессованию и т.д. (45, 51).
Известно, что при производстве жидких биопрепаратов на основе живых микроорганизмов в них добавляют стабилизаторы, которые, с одной стороны, не должны разрушать, биологические компоненты, ас другой - должны поддерживать жизнеспособность и стерильность препарата (197).
Однако для ветеринарии пробиотики из эндогенной микрофлоры в жидком виде практически не производятся, в связи с коротким сроком их хранения (206, 213, 249).
Учитывая, что бактерии рода Bacillus, относятся к экзогенной микрофлоре, за счет спорообразования устойчивы к факторам внешней среды, в том числе и к различным химическим веществам. Поэтому пробиотики на основе бацилл являются наиболее перспективными в плане создания жидких лекарственных форм (42-44),
Пробиотик Биод-5 включает 2 штамма бактерий рода Bacillus - B.subtilis ТПИ 13 и B.lichemformis ТЛИ 11 (48, 50, 55). Препарат в различных лекарственных формах был широко испытан в производственных условиях при желудочно-кишечных болезнях разных видов животных и показал высокую лечебно-профилактическую эффективность.
Однако технология производства жидкой формы пробиотика Биод-5 требует совершенствования на стадии культивирования бацилл-компонентов препарата с целью повышения выхода биомассы в споровой форме.
Кроме того, жидкая форма пробиотика Биод-5 не испытывалась при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят, отсутствуют данные о влиянии жидкой формы препарата на показатели периферической крови телят и микрофлору желудочно-кишечного тракта этого вида животных.
Поэтому исследования по совершенствованию технологии производства пробиотика Биод-5 в жидкой лекарственной форме, направленные на снижение себестомости препарата, и оценка его эффективности при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят являются актуальными и важными для ветеринарной науки и практики.
Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований - совершенствование технологии производства пробиотика Биод-5 в жидкой лекарственной форме и оценка его лечебно-профилактической эффективности при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Усовершенствовать технологические стадии производства пробиотика Биод-5 в жидкой лекарственной форме, определив оптимальный компонентный состав производственной питательной среды для культивирования B.subtilis ТПИ 13 и B.Iicheniformis ТПИ 11 глубинным методом в биореакторах.
2. Подобрать стабилизирующие вещества-консерванты и изучить их влияние на сохраняемость и выживаемость бацилл-компонентов препарата.
3. Приготовить опытные образцы жидкой формы пробиотика Биод-5.
4. Оценить биологические свойства препарата Биод-5, полученного по усовершенствованной технологии. 5. Изучить лечебно-профилактическую эффективность жидкой формы Биод-5 при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят.
6. Рассчитать экономическую эффективность применения жидкой формы пробиотика Биод-5.
Научная новизна.
1. Усовершенствованна технология производства жидкой формы пробиотика Биод-5, позволяющая сохранять биологическую активность препарата не менее 18 месяцев.
2. Теоретически обоснован и разработан: компонентный состав питательной среды № 5 для глубинного культивирования штаммов B.subtilis ТГТИ 13 и B.licheniformis ТЛИ 11 для производства пробиотика Биод-5 в жидкой лекарственной форме, позволяющий получить бактериальную суспензию, содержащую не менее 80 % зрелых спор.
3. Показано, что жидкая форма Биод-5 обладает уникальными биологическими свойствами отличающими его от других пробиотиков: подавление размножения сальмонелл, кандид и стафилококков; стимуляция роста лакто-бацилл и бифидобактерий in vitro и в желудочно-кишечном тракте новорожденных телят.
4. Использованные методы контроля качества пробиотика Биод-5 в жидкой лекарственной форме позволяют дать объективную оценку биологической активности бактерий-компонентов препарата.
5. Показана высокая (90%) лечебно-профилактическая эффективность жидкой формы пробиотика Биод-5 при желудочно-кишечных болезнях ново рожденных телят.
Практическая значимость.
1. Результаты исследований включены в ТУ 9337-007-59088697-004 на пробиотик Биод-5, промышленный регламент производства препарата, временное наставление по применению пробиотика Биод-5 в ветеринарии.
2. На базе ФГУП «Покровский завод биопрепаратов» получены 3 серии жидкой формы препарата Биод-5, которые прошли производственные испытания.
3. На базе ООО «НГЇЇС ЦМВЭИ» (г. Москва) организовано серийное производство пробиотика Биод-5 в жидкой лекарственной форме.
4. В опытах на новорожденных телятах изучен механизм действия жидкой формы пробиотика Биод-5, дана оценка его влияния на микробиоценоз кишечника, обменные и иммунные процессы организма животных, показана высокая лечебно-профилактическая эффективность препарата, что подтверждено актами, утвержденными.руководителями хозяйств Московской:и Нижегородской областей.
5. Результаты исследований по созданию технологии производства пробиотика Биод-5 в жидкой лекарственной форме используются в учебном процессе на кафедре биотехнологии МГАВМиБ имени К.И. Скрябина.
Личный вклад соискателя. Автору принадлежат непосредственное осуществление исследований по оценке биологических свойств штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 и жидкой формы Биод-5, совершенствование компонентного состава лабораторных и производственных питательных сред и технологии производства жидкой формы пробиотика Биод-5, испытание лечебно-профилактической эффективности пробиотика при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят, анализ и теоретическое обобщение полученных данных.
В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с Грязневой Т.Н, которой выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований изложены в 2 научных отчетах («Экспериментальные испытания безопасности, реакто генно сти и специфической активности пробиотика Биод-5», «Испытание профилактической и терапевтической эффективности разных форм пробиотика Биод-5 при желудочно-кишечных болезнях животных в производственных условиях») и доложены на международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им, К.И. Скрябина (Москва, 2004); на научно-практической конференции ветеринарных врачей-эпизоотологов Москвы и Московской области (Москва, 2004).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 научные работы, в том числе 2 статьи в научных журналах; 1 - тезисы в сборнике статей международной учебно-методической и научно-практической конференции.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 167 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (312 источников, из которых 215 отечественных и 97 иностранных). Работа содержит 29 таблиц, 13 рисунков и 24 страницы приложений.
На защиту выносятся следующие положения и результаты:
1. Экспериментальное обоснование состава жидкой формы пробиотика Биод-5.
2. Усовершенствованная технология производства пробиотика Биод-5 в жидкой лекарственной форме.
3. Результаты изучения лечебно-профилактической эффективности жидкой формы пробиотика Биод-5 при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят.
Механизм действия пробиотиков на организм животных
Изучение многочисленных источников литературы о положительных свойствах пробиотиков, указывает на то, что механизм их действия все еще недостаточно изучен, а научный, теоретический и практический базис, на котором основана концепция применения пробиотиков, требует дополнительных исследований. И хотя высказаны различные гипотезы и проведены экспериментальные исследования, многие вопросы остаются без ответа. В научной литературе при описании эффектов, которые оказывают пробиотики на гомеостаз животного, выделяют такие главные феномены, как нормализация кишечного биоценоза, защита от инфицирования условно-патогенными бактериями и положительное влияние на иммунный статус (1, 73, 305).
Одним из важных свойств бактерий пробиотиков считают их способность к адгезии на поверхности эпителия кишечника (107).
Fuller R. и Gibson G. (240-243, 246-248) установили, что наиболее выраженный лечебно-профилактический эффект при кишечных инфекциях и дис-бактериозах оказывают штаммы с высокой адгезивной активностью.
Другим важным аспектом эффективности пробиотиков является антагонистическая активность бактерий-компонентов в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Антагонизм может быть обусловлен продукцией бактериоцинов, органических кислот, перекиси водорода, ферментов и др. У лактобацилл, например, ингибирующий эффект связан с продуцируемой молочной кислотой (228).
Rowland I. и Tanaka R. (294, 303) считают, что наиболее важной стороной положительного воздействия пробиотиков на организм хозяина является их способность модифицировать метаболические процессы, которые происходят в кишечнике. Теоретически это может происходить различными путями:
- подавление реакций, которые ведут к образованию токсических или онкогенных метаболитов;
- стимуляция ферментативных реакций, участвующих в детоксикации потенциально токсических веществ, либо эндогенное разложение или преобразование таких веществ;
- стимуляция пищеварительных ферментов хозяина, либо, в случае отсутствия таких ферментов (обусловленных генетически или болезнью), обеспечением их наличия за счет бактерий;
- синтез витаминов и других питательных веществ, которые не могут быть в достаточном количестве получены с пищей.
Учитывая доминирующее положение бифидофлоры. в кишечнике здоровых животных, а также данные клинических и.микробиологических исследований, многие авторы считают, что представители рода бифидобактерий основная таксономическая группа микрофлоры ЖКТ, являющаяся показателем здоровья макроорганизма (132).
Так, при дисбактериозе, из желудочно-кишечного тракта первой исчезает бифидофлора, то есть патологические сдвиги в организме напрямую зависят от элиминации бифидобактерий. С исчезновением последних снижается иммунологическая активность организма из-за нарушений процессов пищеварения, всасывания и всех видов обмена веществ. Понижается усвоение железа, кальция, страдает витаминосинтезирующая и ферментная функции кишечной микрофлоры (134, 304).
В процессе жизнедеятельности бифидобактерий в организме накапливаются лизин, аргинин, глютаминовая кислота, валин, метионин, лейцин, тирозин. На долю незаменимых аминокислот приходится около 40 % от общего количества аминокислот, продуцируемых бифидобактериями (311).
Такие бифидобактерий как B.infantis, B.breve, B.bifidum, B.longum, B.ado lescentis аккумулируют витамины Bj, B2, B6 B C, никотиновую и фолиевую кислоты, продуцируют в культуральную среду витамины Вбі Ві2 и фоливую
кислоту. Бифидобактерий синтезируют витамин К, о чем свидетельствует снижение эндогенного синтеза его при дефиците бифидофлоры (300).
Установлено, что частота встречаемости штаммов бифидобактерий с высокой кислотообразующей активностью была выше у B.globosum, В. adoles-centis и B.thermophilum. Низкой кислотообразующей активностью обладали штаммы, отнесенные к виду B.infantis (107, 108).
Достоверно установлено, что у дефицитных по лакто- и бифидофлоре животных снижается способность к детоксикации кормовых токсинов, нарушаются процессы развития иммунокомпетентных органов и регуляции минерального, ферментного, гормонального и витаминного обменов. В конечном итоге формируется иммунодефицитная популяция животных с недостаточным энергетическим обеспечением функций генетического аппарата, что приводит к резкому снижению жизнеспособности организма. Недостаток нейроэндокринных факторов вызывает нарушение секреции и транспорта иммуноглобулина А на поверхность слизистой, вследствие чего, для представителей условно-патогенных микроорганизмов создаются благоприятные условия адгезии на эпителиальных клетках кишечника, а сроки колонизации его нормальной микрофлорой существенно замедляются. Это состояние способствует развитию дисбактериозов, усилению патогенных свойств у ассоциации энтеробактерий, приводит к нарушению морфофункционального развития иммунокомпетентных органов, извращению процессов микробного кишечного пищеварения, метаболизма, всасывания и транспорта питательных веществ корма. Лишенный лакто- и бифидофлоры организм становится повышенно восприимчив к воздействию патогенных и условно патогенных бактерий, вирусов, простейших и гельминтов (150).
Материалы и методы
Работа выполнена в период с 2001 по 2004 год на кафедре биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина и ФГУП«Покровский завод биопрепаратов». Эксперименты на животных проводили в ЗАО «Медвежьи озера» Щелковского района Московской области и СПХ «Горьковский» Кана-вин ского района Нижегородской области.
Микроорганизмы. Для приготовления пробиотика Биод-5 в жидкой ле карственной форме использовали штаммы В. subtilis ТЛИ 13-07.06.21 ДЕП/ВГНКИ и B.licheniforaiis ТПИ 11-07.06.22-ДЕП/ВГНКИ, депонированные во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГУ ВГНКИ).
Для определения антагонистической активности бактерий-компонентов препарата Биод-5 были использованы следующие штаммы, полученные нами ранее из коллекции штаммов Центра ВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ и хранящиеся на кафедре биотехнологии МГАВМиБ имени К.И.Скрябина:
-Е.со1і117,Е.со1іК-99;
- L.fermentum 90N-S4, L.plantarum 8Р-АЗ, L.fermentum Ф-36;
- B.globosum БФ-4, B.bifidum 1 (791);
- S.enteriditis 3, S.paratyphi 2606, S.typhimurium 11; m - S.aureus 209, S.epidermidis 685; - P.aeruginosa 9, P.aeruginosa 32;
- P.vulgaris 491,P.mirabiIis 237;
- K.pneumoniae 1245, K.pneumoniae 5055;
- C.freundii381;
- C.tropicalis 165, C.albicans 690;
- C.coli 382, C.jejuni 418.
Экспериментальные животные. В опытах по изучению биологических свойств штаммов B.subtillis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 и оценке эффективности жидкой формы пробиотика Биод-5 были использованы следующие животные: 200 белых беспородных мышей массой 18-20 .г; 10 кроликов массой 2,0-2,5 кг; ПО новорожденных телят, 40 телят в возрасте 15-30 дней.
Материалы, питательные среды, растворы, реактивы. В процессе работы было отобрано и исследовано 258 проб фекалий новорожденных телят и 70 - от белых мышей, 40 проб крови телят и 10 - от кроликов.
При определении острой и хронической токсичности жидкой формы Биод-5 было исследовано 210 гистосрезов органов и тканей экспериментальных животных.
Для выделения и идентификации микроорганизмов использовали следующие питательные среды (ПС): МПА, МПБ, МРС-2, среды Гаузе № 2, Эн-до, Плоскирева, Блаурока, Сабуро, Чапека, Клиглера, Олькеницкого, солевой агар, висмут-сульфит агар, желточно-солевой агар, агар Эндо с желчью, кровяной агар, среда 199, среда Игла, гидролизат-молочная среда.
При совершенствовании технологии глубинного культивирования бактерий-компонентов пробиотика Биод-5 использовали стандартные и модифицированные плотные и жидкие ПС, а также разработанные и усовершенствованные нами в ходе проведения исследований: ПС № 4 - для культивирования B.subtillis ТПИ 13, ПС № 7 - для B.licheniformis ТПИ 11, ПС № 5 - универсальная среда для культивирования B.subtillis ТПИ 13 и B.licheniformis тип.
Стандартные и модифицированные ПС готовили из следующих питательных основ: ферментативный гидролизат мяса, солянокислотный гидролизат казеина, кукурузный экстракт. Для приготовления гидролизатов использовали говяжью вырезку (ГОСТ 779-87); казеин технический (ГОСТ 17626-81); поджелудочную железу (ГОСТ 11285-73); панкреатин (ГФ, изд. 9-е, С. 353), экстракт кукурузный сгущенный (ТУ 10-04-08-14-88).
В работе также применяли дистиллированную воду, концентрированную соляную кислоту, фосфатный буфер, 50 %-ный раствор глюкозы, прошедшие контроль в ОБТК на соответствие ГОСТ, ОСТ, ТУ, некоторые другие химические реактивы и растворы, необходимые для выполнения настоящей работы.
Использовали сырье, реактивы и материалы, прошедшие входной контроль и отвечающие требованиям действующих нормативных документов.
Технологическое оборудование. Культивирование В.subtillis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 проводили во флаконах (объемом ОД дм3) на качалках New Brunswick (США, модель G-53), в аппаратах Ф-1 (объемом 12 дм3) и КМ-0,1 (объемом 100 дм), а также в ферментерах марки «БИОР-0,1» и «БИОР-0,25».
Обсуждение результатов исследований
В наше время, которое называют "наступающей эпохой пробиотиков", биопрепараты на основе живых бактерий широко применяются в медицине и ветеринарии для коррекции микрофлоры ЖКТ. Широкое использование лак-тобактерина, бифидумбактерина, колибактерина, бификола и др. для лечения и профилактики ОКИ и дисбактериозов показало их эффективность.
Перспективным направлением в конструировании и совершенствовании пробиотиков является применение бактерий рода Bacillus, Эти микроорганизмы, благодаря высоким адаптивным возможностям, широко распространены в природе, являются устойчивыми к литическим и пищеварительным ферментам, длительно сохраняют жизнеспособность в желудочно-кишечном тракте животных.
Среди различных представителей экзогенной микрофлоры бациллы характеризуются рядом преимуществ, которые позволяют считать их наиболее эффективными в качестве основы новых пробиотиков. Эти бактерии (кроме B.anthracis и B.cereus), как правило, являются безвредными для организма животных даже в высоких концентрациях; среди них могут быть селекционированы штаммы, антагонистическая активность которых проявляется к более широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов, чем у других представителей экзогенной и эндогенной микрофлоры; бациллы характеризуются высокой ферментативной активностью, что может обусловить существенное регулирование и стимулирование пищеварения; они способны оказывать противоаллергенное и антитоксическое действие; эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабильны при хранении и экологически безопасны.
Ветеринарной практикой востребованы препараты в различных лекарственных формах (жидкой, сухой, гранулированной, таблетированной и др), в зависимости от вида животных и способов их содержания. Однако именно пробиотики в жидкой форме особенно удобны для применения в животноводстве, не нуждаются в предварительной подготовке перед дачей животным, равномерно смешивается с сухим и жидким кормом, с водой, молоком и др., а себестоимость таких препаратов сравнительно невысока, т.к. при их производстве не требуется дорогостоящих операций по высушиванию, измельчению, прессованию и т.д. (45, 51).
Известно, что при производстве жидких биопрепаратов на основе живых микроорганизмов, в них добавляют стабилизаторы, которые, с одной стороны, не должны разрушать биологические компоненты, а с другой - должны поддерживать жизнеспособность и стерильность препарата (197).
Однако для ветеринарии пробиотики из эндогенной микрофлоры в жидком виде практически не производятся, в связи с коротким сроком их хранения (206,213, 249).
Учитывая, что бактерии рода Bacillus, относящиеся к экзогенной микрофлоре, устойчивы к факторам внешней среды, в том числе и к различным химическим веществам, именно пробиотики на основе бацилл можно рассматривать как перспективные в плане создания жидких лекарственных форм (42-44).
Ранее разработанный состав пробиотика Биод-5 (48, 50, 55), включает 2 штамма бактерий рода Bacillus - B.subtUis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11. Препарат в различных лекарственных формах был широко испытан в производственных условиях при желудочно-кишечных болезнях разных видов животных и показал высокую лечебно-профилактическую эффективность.
Однако технология производства жидкой формы пробиотика Биод-5 потребовала совершенствования на стадии культивирования бацилл-компонентов препарата с целью повышения выхода биомассы в споровой форме.
Кроме того, жидкая форма пробиотика Биод-5 не испытывалась при желудочно-кишечных болезнях новоролсденных телят, отсутствуют данные о влиянии жидкой формы препарата на показатели периферической крови телят и микрофлору желудочно-кишечного тракта этого вида животных.
Нами были приготовлены 2 лабораторные серии пробиотика Биод-5. Было установлено, что биокомпоненты жидкой формы Биод-5 характеризуются широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных (Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Pseudomonas и др.) и условно-патогенных (Proteus, Klebsiella, Candida и др.) микроорганизмов и не оказывают ингибирующего действия на лактобациллы и бифидобактерии.
Характерной особенностью пробиотика Биод-5 является его способность подавлять развитие кандид и стафилококков.
При электронной микроскопии препаратов, приготовленных из 24-часовых смешанных культур тест-штаммов и бактерий-компонентов пробиотика Биод-5, было выявлено бактерицидное действие В. subtilis ТПИ 13 и В. licheniformis ТПИ 11, характеризующееся деформацией и разрушением клеток стафилококков, сальмонелл и кандид, за счет нарушения структуры клеточной стенки. В результате этого биокомпоненты Биод-5 проявляли in vitro и in vivo высокую антагонистическую активность в отношении грамположи-тельных и грамотрицательных условно-патогенных и патогенных бактерий.
