Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературных источников 8
1.1. Хозяйственно-биологические особенности ячменя(НогсІеиіп vulgare L.) 8
1.2. Особенности регенерации ячменя в условиях in vitro 9
1.3. Методы трансформации растений 13
1.3.1. Агробактериальный метод трансформации растений 14
1.3.2. Методы прямого переноса ДНК 18
1.3.2.1. Электропор ация и ПЭГ-метод 18
1.3.2.2. Микроинъекции и упаковка ДНК в липосомы 18
1.3.2.3. Биолистический метод трансформации растений 19
1.4. Особенности трансформации злаковых культур 25
1.5. Особенности векторных конструкций, используемых для трансформации однодольных культур 28
1.5.1. Промотор 28
1.5.2. Интрон 30
1.5.3. Терминатор 31
1.5.4. Репортерный ген 32
1.5.5. Селективный ген 36
1.6 Основные направления генной инженерии ячменя 38
1.7. Заключение по обзору литературных источников 43
2. Экспериментальная часть 46
2.1. Материалы и методы 46
2.2. Результаты и обсуждение 56
2.2.1. Изучение условий, влияющих на рост незрелых зародышей в условиях in vitro 56
2.2.2. Изучение факторов, влияющих на эффективность биолистической трансформации ячменя сортов Виконт, Мамлюк и Стимул 70
2.2.2.1. Физические факторы 70
2.2.2.2. Биологические факторы 76
2.2.3. Биолистическая трансформация ячменя сортов отечественной селекции (Стимул, Виконт, Мамлюк), изучение первичных трансформантов (То) и их потомства (Ті) 79
Заключение 88
Выводы 92
Библиографический список 93
- Особенности регенерации ячменя в условиях in vitro
- Биолистический метод трансформации растений
- Изучение условий, влияющих на рост незрелых зародышей в условиях in vitro
Введение к работе
Ряд важнейших проблем человечества — здоровье, обеспечение населения продуктами питания, охрана окружающей среды - в значительной степени определяется уровнем развития биологии. За последние десятилетия в этой области научного знания произошел настоящий прорыв: была доказана роль ДНК как основного носителя наследственной информации, выяснены молекулярные механизмы процессов хранения и передачи наследственной информации, разработаны технологии рекомбинантных ДНК. Все это привело к развитию различных областей науки, но, прежде всего, создало необходимые предпосылки для появления биотехнологии и генной инженерии, причем последняя по сути является одним из разделов биотехнологии.
В историческом смысле биотехнология возникла тогда, когда дрожжи были впервые использованы при производстве пива, а бактерии -для получения йогурта. В настоящее время биотехнологию можно определить как использование живых организмов, биологических систем и процессов для промышленного производства новых продуктов (сорта сельскохозяйственных растений и породы сельскохозяйственных животных, лекарственные препараты, вакцины, пищевые добавки и т.д.).
Одним из основных направлений биотехнологических
экспериментов на растениях является создание новых
высокопродуктивных сортов. В растения вводятся гены, обеспечивающие их устойчивость к насекомым-вредителям, вирусам, гербицидам и неблагоприятным условиям окружающей среды. Кроме того, проводятся эксперименты по использованию растений в качестве «биореакторов».
Перенос генов в растение представляет собой разновидность селекции. Только путь создания нового сорта гораздо короче, и преодолевается такое существенное ограничение классической селекции, как половая несовместимость.
Можно привести три основных аргумента в пользу развития генетической инженерии растений. Во-первых, введение гена часто приводит к повышению сельскохозяйственной ценности и декоративных качеств культурных растений. Во-вторых, трансгенные растения могут служить живыми биореакторами при малозатратном производстве экономически важных белков или метаболитов. В-третьих, генетическая трансформация растений (трансгеноз) позволяет изучать действие генов в ходе развития растений и других биологических процессов (обратная генетика).
Однако, у ГМО (генетически модифицированных организмов) есть немало противников во всем мире. В случае использования трансгенных растений существует три типа потенциально возможных рисков: влияние на здоровье человека, перенос генов к другим видам, отдаленные экологические последствия. Вполне резонно согласиться с опасениями по поводу того, что сейчас трудно спрогнозировать отдаленные последствия влияния ГМО на окружающую среду. Следует также подчеркнуть, что за последний век вообще трудно найти примеры положительного влияния сельского хозяйства на экологическую среду. Вряд ли трансгенные растения смогут нанести больший вред природе, чем, скажем, бесконтрольное применение пестицидов или уничтожение лесов.
Таким образом, проблема разработки методов молекулярной селекции и создание трансгенных сортов основных сельскохозяйственных культур в России приобретает стратегическое значение с точки зрения продовольственной безопасности и независимости, а владение современными методами биотехнологии и диагностики растений является основой для предотвращения превращения России в свалку отходов биотехнологической индустрии развитых стран.
Существует несколько способов получения трансгенных растений (агробактериальная трансформация, биолистическая трансформация, электропорация, микроинъекции и т.д.). Следует отметить, что первые два метода трансформации являются наиболее часто используемыми.
Системы переноса генов с помощью Agrobacterium tumefaciens эффективно работают только в случае некоторых видов растений. В частности, однодольные растения, включая основные зерновые культуры, практически не трансформируются A. tumifaciens. И если в результате модификации методики и при строгом контроле за условиями проведения опытов удалось добиться успешной агробактериальной трансформации риса и кукурузы некоторых сортов, то для большинства других видов зерновых растений основным методом переноса генов остается метод биолистической трансформации. К таковым относится и ячмень, являющийся важной продовольственной культурой. Следует отметить, что клетки и ткани данной культуры при проведении работ в условиях in vitro с большим трудом поддаются регенерации и генетической трансформации. В1 связи с этим работ, описывающих успешную трансформацию ячменя, немного. Кроме того, большинство из них содержит данные о трансформации так называемых модельных сортов, не имеющих какого-либо коммерческого значения в настоящее время.
Целью наших исследований являлось изучение факторов, влияющих на эффективность индуцированного морфогенеза и биолистической трансформации соматических тканей ячменя сортов отечественной селекции.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) Изучение особенностей индуцированного морфогенеза и разработка
протокола эффективной регенерации растений из соматических тканей
ячменя сортов отечественной селекции.
2) Оценка влияния физических параметров и биологических
характеристик эксплантов на уровень транзиентной экспрессии
гетерологичных генов при биолистической трансформации ячменя сортов
отечественной селекции.
3) Молекулярно-биологический анализ присутствия гетерологичных
последовательностей ДНК в геноме первичных трансформантов.
4) Изучение характера наследования перенесенных генов в потомстве
трансгенных растений.
Научная новизна; впервые разработана эффективная система регенерации ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк (селекция КНИИСХ), позволяющая получать интактные растения с частотой 70-80 %. Определены оптимальные условия биолистической трансформации соматических тканей ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк с использованием интенсивности транзиентной экспрессии гена gfp в качестве критерия оценки эффективности трансформации.
Практическая значимость работы: разработанный нами протокол получения фертилъньтх растений-регенерантов ячменя в культуре in vitro может быть использован при клеточной селекции, соматической гибридизации и генно-инженерных экспериментах с сортами ячменя отечественной селекции. Полученные экспериментальные данные являются основой при планировании и проведении исследований, связанных с трансформацией ячменя и/или других злаковых культур.
Данная работа была выполнена в лаборатории генной инженерии растений ГНУ ВНИИСБ РАСХН под руководством в.н.с. к.б.н. М.А. Чернобровкиной и заведующего лабораторией к.с.-х.н. СВ. Долгова.
Особенности регенерации ячменя в условиях in vitro
Вне зависимости от метода трансформации для ее успешной реализации, прежде всего, необходимо иметь надежную и высокоэффективную систему регенерации целых растений в условиях in vitro (Bregitzer et al, 1998). Регенерационная способность является свойством генотипа и зависит не только от видов и сортов, но даже от отдельных растений (Козырева, Дунаева, 1994; Шаяхметов, 2001; Чернобровкина и др., 2004; Magnusson and Bommann, 1985; Luhrs, Lorz, 1987; Bregitzer, 1992; Lemaux et al., 1998; Jacobsen et al., 1999; Barro et al. 1999; Klcova et al., 2004; Filippov et al., 2006).
Для ячменя характерны значительные генотипические различия по регенерационной способности вплоть до полного ее отсутствия (Чернобровкина и др., 2004; Dale and Deambrogio, 1979; Miflin, 2000).
В то же время успешное культивирование клеток и тканей в условиях in vitro в значительной степени определяется типом экспланта.
На ранних этапах экспериментов по изучению регенерационной способности ячменя в конце 80-х — начале 90-х годов использовали различные экспланты из соматических тканей, микроспоры, меристемные ткани, протопласты (Cheng and Smith, 1975; Weigel and Hughes, 1985; Jahne et al. 1994; Yao and Kasha, 1997; Ryan et al., 1999; Zhang et al., 1999; Repellin et al., 2001).
У зерновых культур в целом, и у ячменя в частности, практически только незрелые ткани или клетки могут вызвать индукцию каллусообразования и последующую регенерацию (Luhrs and Lorz, 1987; Altpeter et al., 2000; Oldach et al., 2001). В настоящее время наилучшим типом экспланта для успешной трансформации ячменя признаны незрелые зиготические зародыши (King and Kasha, 1994; Oka et al., 1995; Stiff et al., 1995; Lemaux et al, 1999; Chang et al, 2003). Их получают от донорных растений, выращиваемых в теплице при контролируемых условиях.
Рядом исследователей было показано, что важнейшим фактором образования морфогенного каллуса и последующей регенерации является возраст вводимого в культуру in vitro зародыша. При цито-гистологическом анализе зародышей пшеницы установлено, что оптимальной для инокуляции стадией развития зародышей является стадия, на которой происходит формирования апекса побега, почечки, зародышевого корня, колеоризы, эпибласта и лигулы (т.е. образование органов, имеющих значительное количество меристематических клеток, способных к морфогенезу) (Сельдимирова и Катасонова, 2006). Такое морфо-физиологическое состояние достигалось через 13-17 дней после опыления; размер зародышей при этом составлял 1,0-1,5 мм. Ченг и др. показали, что у ячменя использование зародышей такого же размера (12-15 сут. после опыления) приводило к получения плотного морфогенного каллуса и последующей эффективной регенерации (Chang et al., 2003).
Таким образом, частота регенерации напрямую зависит от частоты каллусообразования, морфологии каллусов и количественного соотношения морфогенного и неморфогенного каллуса на экспланте. Для злаков характерно наличие двух типов каллусной ткани: 1) компактный, состоящий из мелких клеток, каллус коричневатого цвета с гладкой блестящей поверхностью, способный к образованию морфогенных очагов и регенерации; 2) рыхлый белый каллус с крупными клетками, образующий, при определенных условиях, многочисленные корни. Поверхностные слои морфогенного каллуса состоят из меристематических, богатых цитоплазмой клеток. Центральная часть каллуса представлена крупными вакуолизированными клетками с пикнотическими ядрами, которые чередуются с меристематическими участками (Hanzel et al., 1985; Luhrs and Lorz, 1987; Bregitzer,1992).
Биолистический метод трансформации растений
Система биолистической трансформации является одной из; самых распространенных наряду с агробактериальной. Данный метод, предусматривающий использование ускоряющихся (до 300-600 м/с) частиц для доставки экзогенного материала в растительные клетки, бьш разработан Джоном Сэнфордом вместе с Тедом Кляйном, Эдом Вульфом и Нельсоном Алленом в 1987 году (John Sanford, Ted Klein, Ed Wolf and Nelson Allen) (Sanford et al., 1988; Sanford et al., 1990). В этом исследовании проникновение частиц наблюдали на монослое крупных эпидермальных клеток лука. Сообщения о первых трансформированных биолистическим способом растениях появились в 1988 году: это были соя и табак (Christou et al., 1988; Klein et al., 1987). Данный метод может быть использован для проведения трансформации широкого круга растений (как однодольных, так и двудольных). Биолистическая трансформация относится к прямым методам трансформации, т.е. она не зависит от каких-либо биологических переносчиков.
Размер частиц при этом методе составляет 0,5-5 мкм. Они могут быть изготовлены из золота или вольфрама. Частицы из золота абсолютно инертны и не оказывают никакого токсического действия на клетку. Кроме того, они более однородны по размеру в сравнении с вольфрамовыми частицами. Последние лее, напротив, обладают некоторым цитотоксическим действием. ДНК наносится на частицы посредством ее осаждения с помощью этанола или ледяного хлористого кальция. К смеси также может быть добавлен спермидин, который, по-видимому, защищает ДНК от деградации и изменения ее структуры. Введенная ДНК зачастую экспрессируется лишь кратковременно. Пока чужеродная ДНК не встроится в геном растения, она с большой вероятностью утрачивается при делении трансформированных клеток.
Первая генная пушка бьша предназначена для стрельбы вольфрамовыми частицами с нанесенной на них ДНК. Эта суспензия наносилась на, конец пластиковой пули: Последняя, в свою очередь, помещалась в узкую трубку, трубка находилась перед картриджем с порохом. Когда порох сгорал, пластиковая пуля летела по направлению к клеткам-мишеням. Однако на ее пути помещалась пластина с отверстием в центре. Она останавливала пулю (макроноситель), а нанесенные на нее микрочастицы продолжали движение через это отверстие (Sanford et al., 1988).
Последующие устройства для биолистической трансформации были более эффективными, а ударная волна от сгорания пороха бьша заменена волной, создаваемой гелием или электрическим полем.
Так, в 1992 году Файнером с сотр. бьша разработана генная пушка, получившая название PIG (Particle Inflow Gun-Пушка с притоком частиц) (см. рис.1). В данной модели приток гелия контролируется с помощью соленоида. Частицы наносятся на специальный фильтр, который помещается в специальную камеру, где создается частичный вакуум. Затем соленоид подает волну гелия, который проходит через фильтр, что ведет к ускорению частиц, и они летят по направлению к клеткам-мишеням (Finer et al., 1992). Данная установка не требует наличия макроносителей и останавливающих экранов.
С помощью PIG была проведена трансформация ячменя (Koprek et al., 1996) и пшеницы (Филиппов и др., 2004).
Изучение условий, влияющих на рост незрелых зародышей в условиях in vitro
При биолистической трансформации целевые ткани (экспланты) подвержены целому ряду стрессов, например, физическое проникновение частиц золота или вольфрама, дегидратация при обработке осмотиками, контакт с селективными агентами. В связи с этим, регенерация целого растения является одним из самых критических этапов всей процедуры переноса гетерологичной ДНК, что требует проведения ряда экспериментов, направленных на разработку протокола эффективной и стабильной регенерации целых растений в культуре in vitro с частотой не ниже 70-80 %.
Поскольку способность к регенерации целых растений in vitro довольно часто рассматривается как генетическое свойство сорта, то подбор последнего является важным этапом всей работы.
В предыдущие годы в лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ РАСХН были проведены исследования, позволившие оценить регенерационные потенциалы некоторых сортов ячменя, приуроченных к разным экологическим регионам (Чернобровкина и др., 2004). Результаты данных опытов представлены в таблицах 1 и 2. Частота каллусообразования варьировала здесь от 0 до 72 %. Наилучший каллусогенез (табл. 1), как в количественном, так и в качественном отношении, наблюдался при этом у модельных сортов Golden Promise и Hymalaya и трех сортов, имеющих промышленное значение — Korinna, Рахат и Нутанс 553. Остальные сорта в проведенных экспериментах оказались неэффективными для проведения работ в культуре in vitro в связи с их низкой каллусообразующей способностью (либо полным отсутствием таковой) и плохим качеством каллусов. Эффективность же регенерации находилась в пределах от 0 до 68 %. При этом хорошими показателями, наряду с сортами Golden Promise и Hymalaya, характеризуются! лишь сорта Рахат и Korinna (табл. 2); причем у сорта Рахат довольно высокий процент регенерации, но небольшое количество побегов, приходящихся на единицу каллу сной ткани (2,3 шт.). А у сорта Korinna, напротив, при регенерационной способности, находящейся на уровне модельных сортов, образуется и большое количество побегов с единицы каллусной ткани.
Дальнейшая экспериментальная работа проводилась с сортами Виконт, Мамлюк и Стимул селекции КНИИСХ. Следует отметить, что данные сорта ячменя по своей регенерационной способности превосходили изученные ранее сорта.
Успешное достижение регенерации также напрямую связано t с эффективностью каллусогенеза. Одним1 из условий формирования in vitro каллусов с высокой регенерационной способностью является использование экспланта (в нашем, случае это были незрелые зародыши размером 0,5-1,5 мм) на оптимальной стадии развития. На рис. 5 показан весь, цикл регенерации растений ячменя от выделения незрелых зародышей до укоренения побегов. Выделение зародышей производили, на 10-15 день после опыления. Именно на зародышах такого возраста наиболее интенсивно образуются морфогенетические очаги, состоящие из меристематических клеток. От дальнейшего развития данных очагов в значительной степени зависит весь успех регенерации.
Поскольку нарастание морфогенной каллусной массы происходит на щитке, незрелые зародыши, выделенные в асептических условиях, выкладывали на среду так, чтобы щиток располагался сверху. Помещение же их на среду противоположной, осевой, стороной вверх приводило к образованию мягкого полупрозрачного каллуса, отличающегося низким морфогенным потенциалом.
