Содержание к диссертации
Введение
1. Сывороточный альбумин: взаимодействие с лигандами и каталитические свойства 10
1.1. Структура и взаимодействие сывороточного альбумина с лигандами 10
1.2. Каталитические свойства сывороточного альбумина 14
1.2.1. Сывороточный альбумин как гидролаза 14
1.2.1.1. Гидролиз сложных эфиров 14
1.2.1.2. Гидролиз тиоэфиров 24
1.2.1.3. Гидролиз производных фосфорной и фосфоновой кислот 25
1.2.1.4. Гидролиз амидов и амидофосфатов 28
1.2.1.5. Гидролиз Р-лактамных антибиотиков 30
1.2.1.6. Гидролиз бензизоксазола 31
1.2.2. Сывороточный альбумин как лиаза 32
1.2.3. Сывороточный альбумин как изомераза 34
1.2.3.1. Кето-енольная таутомерия и структурная изомеризация эпоксисоединений 34
1.2.3.2. Перемещение двойной связи 36
1.2.4. Сывороточный альбумин как оксидоредуктаза 37
1.2.5. Роль лизина в реакциях, катализируемых сывороточным альбумином 39
1.3. Заключение 42
2. Экспериментальная часть 43
2.1. Материалы и методы 43
2.2. Адсорбция полирибонуклеотида на носителе 47
2.3. Разделение суммарного белка плазмы крови на аффинных сорбентах 48
2.4. Иммуноферментный анализ белков 48
2.5. Очистка альбумина 49
2.6. Получение гликированного и TV-гомоцистеинилирован-ного альбумина 50
2.7. Сравнительный анализ связывания нативного, гликированного и iV-гомоцистеинилированного альбумина с поли(А) 50
2.8. Флуоресцентное титрование гликированного альбумина растворами полирибонуклеотидов 51
2.9. Определение РНК-гидролизующей активности альбумина in situ 51
2.10. Введение Р-метки по 5'-концевой фосфатной группе олигонуклеотидов и транскрипта РНК HIV-1 52
2.11. Определение активности человеческого сывороточного альбумина в реакции гидролиза олигодезокси- и олигорибонуклеотидов 53
2.12. Аффинная модификация альбумина фосфорилирующим производным р(Ц)б 55
2.13. Ферментативный гидролиз продуктов аффинной модификации альбумина 56
3. Взаимодействие нативного и химически модифицированных сывороточных альбуминов - аналогов клинически значимых форм белка человека - с олиго- и полирибонуклеотидами 57
3.1. Сывороточный альбумин как один из основных полирибонуклеотид- связывающих белков плазмы крови человека 57
3.1.1. Аффинная сорбция белков плазмы крови на полинуклеотид-содержащих сорбентах 58
3.1.2. Анализ белков, полученных аффинной сорбцией на полинуклеотид-содержащих сорбентах 61
3.2. Влияние клинически значимых химических модификаций альбумина на связывание белком гомополирибонуклеотидов 65
3.2.1. Получение in vitro химически модифицированных сывороточных альбуминов - аналогов клинически значимых форм белка человека 65
3.2.1.1. Получение гликированного альбумина и его характеризация 65
3.2.1.2. Получение iV-гомоцистеинилированного альбумина и его характеризация 71
3.2.1.3. Влияние модификации альбумина на его вторичную структуру 72
3.2.2. Влияние гликирования и iV-гомоцистеинилирования на эффективность связывания альбумином поли(А) 73
3.2.3. Взаимодействие гликированного альбумина с гомополинуклеотидами 75
3.3. РНК-гидролизующая активность сывороточного альбумина 77
3.3.1. Некоторые механизмы гидролиза фосфодиэфирных связей в РНК 78
3.3.2. Анализ гомогенности используемого в работе препарата альбумина 80
3.3.3. Тестирование альбумина на РНК-гидролизующую активность 81
3.3.4. Определение кинетических параметров реакции расщепления фосфодиэфирных связей в РНК в присутствии альбумина 85
3.3.5. Субстратная специфичность альбумина в реакции расщепления фосфодиэфирных связей в РНК 88
3.3.6. Зависимость эффективности расщепления фосфодиэфирных связей в РНК в присутствии альбумина от рН 99
3.3.7. Исследование влияния ионов металлов, связанных с человеческим сывороточным альбумином, на его РНК-гидролизующую активность 101
3.4. Влияние гликирования и JV-гомоцистеинилирования на РНК-гидролизующую активность альбумина 103
3.5. Установление сайта связывания альбумина с олигорибонуклеотидами 105
3.5.1. Аффинная модификация альбумина фосфорилирующим аналогом P(U)6 105
3.5.2. Анализ модифицированных пептидов методами гель-электрофореза и MALDI-TOF масс-спектрометрии 110
Приложения 112
Выводы 114
- Каталитические свойства сывороточного альбумина
- Сывороточный альбумин как изомераза
- Флуоресцентное титрование гликированного альбумина растворами полирибонуклеотидов
- Влияние модификации альбумина на его вторичную структуру
Введение к работе
Сывороточный альбумин — важнейший транспортный белок, осуществляющий депонирование и перенос многих эндогенных метаболитов и ксенобиотиков в плазме крови, межклеточной жидкости и лимфе [1]. Универсальность транспортной функции альбумина обеспечивается его уникальной способностью связывать лиганды различной химической природы: жирные и желчные кислоты, билирубин, стероидные и тиреоидные гормоны, а также многие лекарственные вещества.
Кроме низкомолекулярных лигандов, альбумин связывает также и биополимеры, например, пептиды [2] и нуклеиновые кислоты [1, 3,4]. На данный момент получены убедительные доказательства того, что альбумин не только связывает дезоксирибонуклеиновые кислоты, но и способствует их проникновению в клетки [5, 6]. В то же время взаимодействие человеческого сывороточного альбумина с РНК ограничено исследованиями на уровне определения констант связывания с тРНК [7].
Одной из важных функций, присущей сывороточному альбумину, является его способность катализировать многие химические реакции [1, 8]. В последние годы было показано, что в присутствии бычьего сывороточного альбумина наблюдается деполимеризация РНК [9]. Что касается человеческого сывороточного альбумина, на момент выполнения настоящей работы данные по РНК-гидролизующей активности белка в литературе отсутствовали. Так как концентрация данного белка в плазме крови высока (~ 0,6 мМ), взаимодействие альбумина с внеклеточными РНК может существенно влиять на их стабильность в крови, биораспределение и метаболизм.
Фракция альбумина в сыворотке крови гетерогенна и содержит, наряду с нативным белком, ряд пост-трансляционно модифицированных форм. Различные модифицированные формы человеческого сывороточного альбумина обнаруживаются, главным образом, при патологии. Так, например, альбумин в крови подвергается гликированию с образованием продуктов, ответственных за развитие осложнений при сахарном диабете [10]. Взаимодействие альбумина с циркулирующим в крови тиолактоном гомоцистеина приводит к образованию iV-гомоцистеинилированного белка, вызывающего аутоиммунный ответ и способствующего развитию атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний [И]. Модификация альбумина может привести к изменению его структуры и, как следствие, лиганд-связывающей способности. Если для комплексов нативного альбумина с нуклеиновыми кислотами получены некоторые физико-химические характеристики, то в случае модифицированных альбуминов не исследована ни эффективность их связывания с нуклеиновыми кислотами, ни их
способность гидролизовать данные лиганды. Развитие работ в этом направлении может не только привести к расширению знаний о роли и функции альбумин-нуклеиновых комплексов в процессах жизнедеятельности человека в норме и при патологии, но и представляет определенный клинический интерес, так как будет способствовать разработке новых диагностических и прогностических методов и созданию новых лекарственных средств.
Таким образом, для установления причин исключительной полифункциональности человеческого сывороточного альбумина, обуславливающего его биологическую роль в организме, а также в связи с перспективой использования антисмысловых олигонуклеотидов или интерферирующих РНК в качестве терапевтических средств, детальное изучение процессов взаимодействия как нативного человеческого сывороточного альбумина, так и его клинически значимых химически модифицированных форм альбуминов с такими важными молекулами как РНК представляется актуальным.
Целью настоящей работы являлось исследование взаимодействия нативного и химически модифицированных форм (гликированного и JV-гомоцистеинилированного) человеческого сывороточного альбумина с РНК, а также сравнительный анализ способности альбумина и других белков нефракционированной плазмы крови связывать гомополирибонуклеотиды и их комплементарные комплексы.
В ходе исследования решались следующие задачи:
анализ эффективности и специфичности взаимодействия препарата альбумина и белков плазмы крови с полирибонуклеотидами (поли(А), поли(О), поли(и), и поли(С)) и их дуплексами (поли(А).поли(Ц) и поли(С).поли(С));
исследование способности альбумина катализировать гидролиз олигорибонуклеотидов, полирибонуклеотидов, и РНК;
изучение каталитических свойств (кинетических параметров реакции, влияния ионов металлов и рН на скорость реакции) и субстратной специфичности альбумина в реакции гидролиза РНК;
изучение механизма деполимеризации нуклеиновых кислот под действием альбумина посредством определения структуры продуктов реакции методом 31Р-ЯМР спектроскопии;
изучение влияния клинически значимых химических модификаций альбумина -гликирования и JV-гомоцистеинилирования - на связывание белка с олиго- и полирибонуклеотидами, а также на его РНК-гидролизующую активность;
проведение аффинной модификации альбумина фосфорилирующим производным олигорибонуклеотидного субстрата и определение аминокислотных остатков альбумина, участвующих в связывании олигорибонуклеотидов, методом
MALDI-TOF масс-спектрометрии и Р-ЯМР-спектроскопии.
Каталитические свойства сывороточного альбумина
Сывороточный альбумин обычно считают инертным белком, биологические функции которого ограничены транспортом эндо- и экзогенных веществ, а также поддержанием рН и осмотического давления в крови. Однако к настоящему времени накоплено достаточно много фактов, свидетельствующих о том, что данному белку присущи различные каталитические активности. Сывороточный альбумин катализирует несколько типов химических превращений: 1) гидролитическое расщепление различных связей (функциональный аналог гидролазы); 2) образование двойных связей (лиаза); 3) реакции изомеризации (изомераза); 4) окислительно-восстановительные превращения (тиол-пероксидаза). При разделении белков плазмы крови нативным гель-электрофорезом и последующем анализе эстеразной активности в геле с использованием р-нафтилацетата в качестве субстрата наряду с прочими белками, обладающими активностью, выявлялся сывороточный альбумин [41]. Гидролитическая активность альбумина наблюдалась и в условиях, неблагоприятных для действия известных эстераз плазмы крови (в отсутствие необходимых кофакторов [42], в присутствии специфических ингибиторов [43] или после предварительного нагревания белка [44]). Это позволило авторам заключить, что ускорение гидролиза эфиров в присутствии сывороточного альбумина обеспечивается присущей ему активностью, а не является следствием загрязнения препарата белка другими гидролазами. Однако из-за малого количества оборотов HSA по сравнению с известными ферментами, а также поскольку в структуре белка не доказано наличие каталитической триады аминокислот, характерной для гидролаз, альбумин не считают истиной гидролазой. В связи с этим, гидролитическую активность сывороточного альбумина в реакциях гидролиза сложных эфиров принято называть «эстеразоподобной активностью».
Механизм гидролиза эфиров в присутствии сывороточного альбумина изучали на примере реакции с такими субстратами, как «-нитрофениловые эфиры карболовых кислот [23, 45-50, 52]. Используя отдельно экспрессированные фрагменты HSA, содержащие функциональные домены белка, Matsushita и соавторы показали, что полипептид, соответствующий домену II, не активен по отношению к и-нитрофениловому эфиру уксусной кислоты (PNPA), а полипептид, соответствующий домену I, проявляет 24 % каталитической активности интактного белка [45]. При этом эффективность гидролиза субстрата в присутствии полипептида, содержащего домен III альбумина, в котором расположен сайт II, лишь примерно в два раза ниже, чем в присутствии интактного белка [45]. Предположение о локализации эстеразоподобной активности альбумина в сайте II субдомена ША подтверждается данными по ингибированию каталитической активности HSA лигандами, специфически взаимодействующими с основными сайтами связывания белка [46]. Для реализации каталитической активности IISA при гидролизе эфиров карбоновых кислот важны аминокислотные остатки Arg-410 и Туг-411, расположенные в субдомене ША белка (рис. 1Б) [23, 45]. Так, при замене остатка Arg-410 на остаток аланина эффективность гидролиза PNPA в присутствии мутантного HSA составляет только 12 % от активности нативного белка [23]. Кроме того, модификация альбумина метилглиоксалем, мишенью которого, по данным тандемной ESI масс-спектрометрии, является Arg-410 [47], также подавляет каталитическую активность белка [23]. Замена остатка Туг-411 на аланин или фенилаланин приводит к полному подавлению гидролитической активности альбумина [23]. В то же самое время, белок, в котором в положении 411 находился остаток серина, сохраняет 21% активности, что свидетельствует о важной роли гидроксильной группы для проявления эстеразоподобной активности сывороточного альбумина. Участие гидроксильных групп боковых радикалов аминокислот в ковалснтном катализе показано для природных ферментов. В частности, остаток серина в активном центре сериновых протеаз вовлечен в образование сложно-эфирной связи с молекулой субстрата в составе ковалентного фермент-субстратного интермсдиата. Образование ковалентного интермедиата ацил-белок в ходе катализируемого альбумином гидролиза сложных эфиров впервые наблюдали Means и соавторы [48]. Авторы показали, что при взаимодействии HSA с п-нитрофениловым эфиром [14С]-меченной уксусной кислоты наблюдалось высвобождение окрашенного «-нитрофенола, при этом радиоактивная метка оказывалась связанной с белком и не удалялась даже в результате экстенсивного диализа. Эти данные свидетельствуют об образовании в ходе катализируемого альбумином гидролиза PNPA ковалентного интермедиата ацетил-белок. Позднее Masson с соавторами [49], используя метод MALDIOF масс-спектрометрии, показали, что при реакции HSA с PNPA модифицируется Туг-411. Остаток Туг-411 HSA имеет необычно низкую константу ионизации (по одним источникам pKd = 8,7 [48], по другим рКа = 9,2 [50]). Значение рКа каталитически активного остатка тирозина для бычьего, кроличьего, крысиного и конского сывороточных альбуминов составляет 9,3, 9,4, 9,5 и 9,7, соответственно [50]. Интересно отметить, что эффективность гидролиза PNPA в присутствии сывороточных альбуминов из разных источников обратно пропорциональна основности реакционно-способного аминокислотного остатка в белке [50].
Поскольку с увеличением константы ионизации гидроксильной группы тирозина уменьшается доля депротонированной формы аминокислоты, которая является сильным нуклеофилом, можно заключить, что гидролитическая активность альбумина зависит как от основности, так и от нуклеофильности остатка тирозина в белке. Присоединение ацильной группы субстрата к сывороточному альбумину в ходе катализируемого белком гидролиза сложного эфира карбоновой кислоты аналогично ситуации, имеющей место при нуклеофилыюм катализе сериновыми протеазами, катализирующими гидролиз пептидных и сложноэфирных связей. Наряду с этим, были выявлены и существенные отличия, показавшие несовершенство альбумина как катализатора, по сравнению с ферментами. Так, в действии сериновых протеаз важную роль играет общий кислотно-основной катализ, обеспечивающий активацию обычно инертной в физиологических условиях гидроксильной группы серина для нуклеофильной атаки на субстрат, а также последующую активацию молекулы воды [51] (схема 1). Ключевым элементом каталитического процесса под действием протеазы является перенос протона от гидроксильной группы серина на атом азота имидазольного кольца гистидина. Это обеспечивает возникновение отрицательного заряда на кислороде серина и возможность атаки карбонильного углеродного атома субстрата с образованием промежуточного тетраэдрического соединения (1). В его стабилизации важную роль играет положительный заряд в так называемой «оксианионовой дыре» в активном центре фермента. Следующая стадия - перенос протона от гистидина на кислород уходящей группы с освобождением продукта реакции (спирта RiOII) и образованием ацил-фермента (2). Остаток гистидина вновь приобретает способность выступать в роли общего основания, на этот раз оттягивая протон от молекулы воды, которая занимает в активном центре фермента место ушедшего спиртового продукта. Образовавшийся ион гидроксила осуществляет нуклеофильную атаку карбонильного атома углерода ацильной группы ацил-фермента с образованием нового промежуточного соединения (3), также стабилизируемого взаимодействием с положительно заряженным участком активного центра. Последующий перенос протона с гистидина на кислород серина сопровождается освобождением ацильного продукта реакции и регенерацией остатка серина для последующих актов катализа.
Сывороточный альбумин как изомераза
При взаимодействии с тестостероном и некоторыми простагландинами сывороточный альбумин выступает в роли внутримолекулярной оксидоредуктазы, катализируя кето-енольное превращение тестостерона, превращение эпокси-простагландинов в соответствующие Р-оксикетоновые простагландины, а также реакцию миграции двойной связи в структуре различных простагландинов. В присутствии HSA ускоряется превращение кето-формы дигидротестостерона в соответствующую енольную форму (схема 14) [104]. В литературе при описании подобной активности альбумина принято говорить о «енолазной» активности белка. Этот термин выбран не совсем удачно, учитывая, что тривиальное название «енолаза» закреплено за ферментом, который относится к классу лиаз и катализирует реакцию превращения 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват. Тем не менее, в силу распространенности данного термина в соответствующей литературе, далее в обзоре мы будем использовать название «енолазная» активность применительно к свойству альбумина катализировать кето-енольное превращение дигидротестостерона. Наблюдаемая активность альбумина подавляется в присутствии олеиновой кислоты и холестерина, а также ионов Ni + и Си + [104]. Последнее может указывать на участие в катализе остатков гистидина белка. Максимальная эффективность превращения 3-кето-дигитротестостерона в 3-енольную форму в присутствии HSA наблюдается в карбонатном буфере при рН 9,2. Используя отдельно экспрессированные домены рекомбииантного HSA, Matsushita и соавторы [45] показали, что при оптимальных условиях только полипептид, соответствующий домену II белка, проявляет значительную «енолазную» активность. Таким образом, описываемая каталитическая активность HSA, по-видимому, связана с активным сайтом I, расположенном в домене II альбумина Авторы [104] обнаружили, что «енолазная» активность присуща не только сывороточному, но и внутриклеточному альбумину, причем оба белка проявляют одинаковую специфичность и сродство к дигидротестостерону. Уровень «енолазной» активности альбумина в цитозоле клеток злокачественной опухоли молочной железы существенно ниже, чем при доброкачественном образовании.
Различия в каталитической активности авторы объясняют накоплением в раковой опухоли полимерных форм альбумина, проявляющих пониженную ферментативную активность. Авторы работ [105, 106] показали, что HSA катализирует превращение эндопероксидного PGH2 в PGD2, содержащий гидроксильную группу в р-положении по отношению к оксо-группе (схема 15А). При этом в отсутствие альбумина в водных растворах PGH2 превращается в PGE2 - изомер PGD2 (Схема 15Б) [105]. Авторы полагают, что влияние альбумина на деградацию PGH2 может иметь важное физиологическое значение, поскольку биологические свойства продуктов простагландина, образующихся в присутствии альбумина и в результате спонтанной реакции, различны [105]. Известно [107], что в нейтральной среде при дегидратации простагландинов серии Е образуются соответствующие простаглапдины серии А (схема 16А). В щелочной среде (рН 10) реакция протекает дальше с образованием PGB (схема 16Б). Авторами [108, 109] было обнаружено, что аналогичные превращения простагландинов наблюдаются в физиологических условиях в присутствии альбумина из сыворотки различных позвоночных (схема 16Б). Используя в качестве модельного лиганда 15-KCTO-PGE2, авторы работы [109] обнаружили, что в присутствии HSA исчезновение исходного простагландина сопровождается образованием окрашенного (Х.макс = 505 нм) продукта реакции, являющегося, по всей видимости, енолят-анионом одной из таутамерных форм промежуточного Al2 14-PGA2 (схема 17). А о В отсутствии белка такое окрашенное соединение образуется только в сильнощелочной среде. На основании полученных данных авторы [109] предположили, что катализ изомеризации продукта деградации простагландинов серии Е в присутствии сывороточного альбумина протекает с участием боковых радикалов основных аминокислотных остатков белка, обеспечивающих локальное защелачивание в активном центре альбумина. Hurst и соавторы [ПО] показали, что HSA может действовать как тиол-пероксидаза. катализируя восстановление 1-пальмитоил-2-(13-гидроперокси-с/5-9,г1га?75-11-октадека-диеноил)-Ь-3-фосфати дилхолина (PLPC-OOH) до соответствующего гидрокси-производного (PLPC-OH) (схема 18).
Несмотря на то, что пероксидазная активность белка по отношению к гидропероксиду фосфатидилхолина наблюдается в отсутствие дополнительных восстановителей, добавление тиол-содержащего кофактора существенно увеличивает скорость альбумин-катализируемой реакции. Удельная активность HSA (на 1 мг белка) при восстановлении субстрата составляет 0,01 нмоль/мин в отсутствии кофакторов и 0,07 нмоль/мин, 0,05 нмоль/мин и 0,02 нмоль/мин в присутствии цистеина, глутатиона и гомоцистеина, соответственно [110]. Используя в качестве кофактора цистеин, авторы показали, что стехиометрическое восстановление PLPC-OOH сопровождается окислением двух молекул цистеина с образованием молекулы цистина [110]. Эффективность восстановления гидропероксида фосфатидилхолина в присутствии HSA прямо пропорциональна количеству свободных сульфгидрильных групп в белке. Так, модификация SH-группы остатка Cys-34 iV-этилмалеимидом приводит к снижению пероксидазной активности альбумина. Восстановление S-S мостиков в структуре белка под действием DTT, напротив, повышает скорость восстановления субстрата [ПО]. Аналогичный эффект вызывает и взаимодействие альбумина с каптоприлом, приводящее, согласно [111], к деблокированию SH-группы Cys-34, вовлеченной в образование дисульфидной связи с тиол-со держащим и эндогенными веществами. В присутствии восстановленного глутатиона HSA проявляет пероксидазную активность в отношении Н2О2 [112]. Деградация перекиси водорода сопровождается образованием окисленного глутатиона. Скорость удаления Н2О2 в присутствии альбумина возрастает с повышением концентрации белка, достигая насыщения [112]. При модификации альбумина реагентами, специфично действующими на сульфгидрильные группы (TV-этилмалеимид, йодуксусная кислота), подавление пероксидазной активности белка наблюдается только в присутствии тиол-содержащих восстановителей, например, DTT [112]. Эти данные свидетельствуют об участии остатков цистеина, вовлеченных в образование дисульфидных связей в молекуле HSA, в механизме тиол-пероксидазной активности белка (рис. 7).
Флуоресцентное титрование гликированного альбумина растворами полирибонуклеотидов
Раствор gHSA (3,5х10"5М, 80 мкл) в буфере PBS, содержащем 15 мМ КН2Р04 (рН 7,4), 145 мМ NaCl, выдерживали при 37 С в течение 10 мин. Затем к смеси в кювете последовательно добавляли раствор полирибонуклеотидного лиганда (20 40 мМ в расчете на одно нуклеотидное звено) порциями по 0,5 мкл. После каждого добавления лиганда смесь выдерживали при 37 С не менее 1 мин. Интенсивность испускания флуоресценции измеряли на длине волны 440 нм при возбуждении светом Еозб - 365 им. Для определения константы диссоциации комплексов альбумина с олиго- и полинуклеотидами строили зависимость изменения интенсивности флуоресценции от концентрации лиганда. Величины Кй реакции комплексообразования альбумин«полинуклеотид определяли, используя уравнение Штерна-Фольмера [132]. Для приготовления поли(А) поли(Ч1) дуплекса одноцепочечные гомополирибонуклеотиды поли(А) и поли(и) смеишвали в молярном соотношении 1:1 в присутствии 0,15 М NaCl, инкубировали в течение 2 мин при 90 С, затем медленно охлаждали до 25 С. РНК-гидролизуюшую активность HSА определяли с помощью электрофореза в 10 % ПААГ, содержащем SDS и сополимеризованную в гель суммарную РНК дрожжей (40мкг/мл) по аналогии с работой [133]. После электрофоретического разделения препарата HSA (10 мкг белка на дорожку) гель отмывали от SDS в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 7,0), 0,2 М КС1 и 0,5 мМ EDTA, при 37 С в течение 2 ч (10 смен буфера по 10-13 мин каждая). Для ренатурации белка и восстановления каталитической активности HSA гель инкубировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 7,0), 0,2 М КС1 и 0,5 мМ EDTA, при 37 С в течение 5 суток с ежедневной сменой буфера, после чего окрашивали бромистым этидием. Участок геля, где происходило расщепление РНК, выявлялся в виде темного пятна на равномерно флуоресцирующем фоне.
Положение белковых полос определяли по окраске геля СВВ G-250. 2.10. Введение Р-метки по 5 -концевой фосфатной группе олигонуклеотидов и транскрипта РНК HIV-1 РНК HIV-1 и синтетические олигонуклеотиды, содержащие 5 -концевую фосфатную группу, предварительно дефосфорилировали с помощью бактериальной щелочной фосфатазы (ВАР). Для этого смесь объемом 50 мкл, содержащую. 10 мкг РНК, 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 2 % формамид, 0,2 % SDS, 2,5 мМ DTT последовательно инкубировали 2 мин при 60 С и 1 мин при 0 С, после чего добавляли 1 ед. акт. ВАР. Реакционную смесь инкубировали при 37 С в течение 30 мин, затем добавляли еще 1 ед. акт. ВАР и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. Дефосфорилированную РНК дважды экстрагировали равным объемом водонасыщенного фенола. Водную фазу после фенольной экстракции дважды промывали равным объемом диэтилового эфира. РНК осаждали добавлением 3 М ацетата натрия до концентрации 0,3 М и 4-кратным объемом этилового спирта. Осаждение проводили при -20 С в течение 18 ч. Олигонуклеотиды осаждали 10-кратным объемом 3 % ЫСЮ4 в ацетоне, промывали ацетоном и высушивали в вакууме. Введение 32Р-метки по 5 -концу дефосфорилированной РНК или олигорибонуклеотидов проводили с помощью Т4 полинуклеотидкиназы. Реакционную смесь, содержащую 20 пмоль олигонуклеотида в 30 мкл буфера (рН 7,5) 50 мМ Трис-НО, 10 мМ MgCl2, 5 мМ DTT, 0,1 мМ спермидин, 0,1 мМ EDTA, 30 пмоль [у-32Р] АТР (уд. акт. 5000 Ки/ммоль), выдерживали 2,5 ч с 10-20 ед. акт. полинуклеотидкиназы фага Т4 при 37 С, согласно [134]. Меченый олигонуклеотид выделяли электрофорезом в денатурирующем 20 % ПААГ, радиоактивную полосу выявляли радиоавтографией и вырезали из геля. 5 -[32Р]-Меченый олигонуклеотид выделяли из геля пассивной элюцией в течение ночи при 25 С, осаждали 10-кратным объемом 3 % LiC104 в ацетоне, промывали ацетоном и высушивали в вакууме. Осадок растворяли в 100 мкл бидистиллированной воды. Концентрация полученного раствора меченого олигонуклеотида не превышала 1 х 10" М. РНК-гидролизующую активность нативного и модифицированного HSA анализировали, используя в качестве субстратов поли(С), поли(и), поли(А), транскрипт РНК HIV-1 длиной 96 нуклеотидных звеньев, либо олигонуклеотиды pAGGAUCUAUAAAUGAC (ONI6), pd(AGGATC)rUd(ATAAATGAC) (iON16), p(U)6 или р(А)б. ДНК-гидролизующую активность HSA анализировали, используя в качестве субстрата олигодезоксирибонуклеотид pd(AGGATCTATAAATGAC) (dON16). Реакционную смесь, содержащую 5 -[32Р]-меченый олигонуклеотид (1x10"6 М), нативный или модифицированный HSA (1 х 10"5 М или 2 х 10"5 М), в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 7,0), 0,2 М КС1 и 0,5 мМ EDTA, инкубировали при 37 С. Реакцию останавливали удалением белка из реакционной смеси фенольной экстракцией, продукты расщепления РНК или олигонуклеотидов осаждали 3 % ЫСЮ4 в ацетоне. Осадок собирали центрифугированием, промывали ацетоном и растворяли в буфере, содержащем 8 М мочевину, 0,025 % бромфеноловый синий, 0,025 % ксиленоцианол.
Продукты расщепления 5 -[ "Р]-меченого олигонуклеотида анализировали электрофорезом в 16% ПААГ, содержащем 8 М мочевину, и визуализировали радиоавтографией геля на рентгеновскую пленку «Agfa CP-BU New» («Agfa-Geveart», Бельгия) в течение 10-20 ч при температуре -20 С, либо, после высушивания геля, — экспонированием на экран «Imaging Screen К» и сканированием на «Molecular Imager FX». Сайты расщепления определяли путем сравнения по подвижности продуктов расщеплении олигонуклеотидов в присутствии альбумина с продуктами, образующимися под действием 2 М имидазола (рН 7,0) [135], а также РНКазы ТІ [136]. Изучение зависимости эффективности индуцируемого HSA расщепления фосфодиэфирных связей в РНК от рН проводили при значениях рН 4,1-8,9 в трех буферных растворах, содержащих 0,2 М КС1 и 0,5 мМ EDTA: 50 мМ ацетат натрия (рН 4,1-5,5), 50 мМ какодилат натрия (рН 5,5-7,0) и 50 мМ Трис-HCl (рН 7,0-8,9). Какодилатный буфер имел по одному перекрывающемуся значению рН с двумя другими буферными растворами. Для построения зависимости константы скорости реакции от рН константы скорости реакции в разных буферных растворах при одном значении рН усреднялись. В этих экспериментах концентрация 5 -[ Р]-меченого ON 16 и HSA составляла 1 х Ю"6 М и 1 х 10"5 М соответственно. Кинетические параметры расщепления UpA сайта в РНК в присутствии HSA определяли, используя в качестве субстрата 5 -[32Р]-меченый олигодезоксирибонуклеотид iON16, содержащий один рибонуклеотид в положении 7 олигодезоксирибонуклеотида. Реакционную смесь, содержащую HSA (5 х 10"6 М), iON16 (5-100 мкМ), в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 7,0), 0,2 М КС1 и 0,5 мМ EDTA, инкубировали при 37 С. Через 5, 10, 15, 20, 30 и 60 мин после начала инкубации из реакционной смеси отбирали равные аликвоты, реакцию останавливали осаждением исходного олигонуклеотида и продуктов его расщепления 3 % ЫСЮ4 в ацетоне. Осадок собирали центрифугированием, промывали ацетоном и растворяли в буфере, содержащем 8 М мочевину, 0,025 % бромфеноловый синий, 0,025 % ксиленцианол. Продукты расщепления iON16 анализировали электрофорезом в 20 % ПААГ, содержащем 8 М мочевину, и визуализировали радиоавтографией. Константу диссоциации комплекса альбумина с олигонуклеотидом и константу скорости образования продуктов расщепления определяли из зависимости начальной скорости гидролиза iON 16 от его концентрации. Количественную оценку эффективности расщепления проводили с помощью программы «GelPro Analyzer 4.0» («Media Cybernetics», США) или «Quantity One 4.6.6.» («Bio-Rad», США). Степень расщепления рассчитывали как отношение радиоактивности продуктов расщепления к суммарной радиоактивности, нанесенной на гель.
Влияние модификации альбумина на его вторичную структуру
Влияние гликирования и iV-гомоцистеинилирования на пространственную структуру альбумина исследовали с помощью метода КД-спектроскопии. Из данных, приведенных на рис. 17, видно, что спектры HSA, gHSA и Hcy-HSA практически идентичны по форме, что говорит о сохранении а-спиральной структуры альбумина при модификации. Тем не менее, значение эллиптичности при А. = 222 нм как при гликировании, так и при Л -гомоцистеинилировании альбумина становится менее отрицательным (рис. 16). Это свидетельствует об уменьшении количества а-спиралей в белке при модификации. Данные по содержанию а-спиралей в молекуле HSA, gHSA и Hcy-HSA, рассчитанному с помощью программы CDSSTR, приведены в таблице 1. По данным рентгеноструктурного анализа [1], HSA содержит 67% а-спиралей. Содержание а-спиралей в HSA, рассчитанное из данных КД-спектроскопии, составило 60 % (табл. 1), что хорошо согласуется с данными, полученными этим же методом другими авторами [181-184]. Как видно из табл. 1, гликирование альбумина не приводит к серьезным нарушениям вторичной структуры белка. Незначительное понижение содержания а-спиралей в молекуле gHSA по сравнению со структурой нативного HSA показано и другими авторами [185, 186], причем увеличение степени модификации практически не влияло на изменение конформации белка. Интересно отметить, что количество а-спиралей в Hcy-HSA и gHSA практически одинаково (56 и 57 % для gHSA и Hcy-HSA соответственно), несмотря на то, что степень модификации альбумина при гликировании и iV-гомоцистеинилировании отличается значительно. Возможно, это связано с тем, что большинство остатков лизина, подвергающихся модификации в результате гликирования, расположено на поверхности белковой глобулы, и их гликирование не препятствует формированию а-спиралей в молекуле HSA. Равновесные константы диссоциации комплексов нативного и модифицированных форм человеческого сывороточного альбумина с поли(А) определяли с помощью аффинного капиллярного электрофореза, согласно процедуре, описанной ранее [7, 38]. При увеличении концентрации белка время удерживания полинуклеотида в капилляре постепенно возрастало и достигало платового значения при концентрации белка выше 45 мкМ.
Фактор насыщения белка полиадениловой кислотой (/?/) был рассчитан из изменения времени миграции полинуклеотида в присутствии альбумина, исходя из уравнения (1): где т — время выхода поли(А) при добавлении нативного или модифицированного HSA, то и ms соответствуют временам удерживания свободного и полностью связанного с белком лиганда соответственно. Полученные значения констант хорошо согласуются с полученными ранее для комплексов альбумина с олигодезоксирибонуклеотидами [3] и их фосфотиоатными аналогами [37], а также с полноразмерными ДНК [38] и РНК [7]. Так, в работе [38] с помощью капиллярного электрофореза были определены константы связывания HSA с суммарной ДНК, выделенной из тимуса теленка. При анализе зависимости насыщения альбумина нуклеиновой кислотой от концентрации белка авторы выявили, что существует два сайта связывания, один из которых обладает высоким сродством (К\ — 2,2 х 10"6 М), а другой - низким сродством {Кг = 1,6 х 10" М). В случае взаимодействия альбумина с тРНК константа связывания составляет / = 7 х 10"5 М [7]. 3.2.3. Взаимодействие гликированного альбумина с гомополинуклсотидами Для исследования эффективности белок-нуклеиновых взаимодействий часто используется метод флуоресцентного титрования. При этом обычно регистрируют изменение интенсивности флуоресценции остатков триптофана в белках (длина волны возбуждения 280-300 нм) при добавлении лиганда в возрастающей концентрации. Однако, как было описано в литературном обзоре (см. стр. 12, 13), значение констант ассоциации альбумина с нуклеиновыми кислотами не превышает величины порядка 10 М"1. Поэтому для их определения необходимо использовать высокие концентрации лиганда, что приводит к эффекту внутреннего фильтра, обусловленному поглощением света гетероциклическими основаниями полинуклеотидов. Этот эффект сопровождается значительным понижением интенсивности флуоресценции альбумина за счет снижения интенсивности света, способного возбуждать флуоресценцию остатка триптофана в белке. Таким образом, в данном случае метод флуоресцентного титрования, основанный на определении флуоресценции остатка триптофана, неприменим для определения консгант связывания комплексов HSA с полинуклеотидами. В то же время, в результате гликирования альбумина образуется ряд продуктов, способных флуоресцировать при возбуждении в более длинноволновой области спектра (XB03G = 365 нм, Х„сп = 440 нм), где поглощение полинуклеотидов даже в используемом диапазоне концентраций ((1—5) х 10" М) незначительно. Поэтому сравнительный анализ взаимодействия альбумина с различными гомополинуклеотидами проводили на примере гликированного альбумина. Для определения констант образования комплексов gHSA с лигандами использовали метод флуоресцентного титрования в условиях флуоресценции продуктов гликирования. На рис. 19 представлены зависимости интенсивности флуоресценции гликированного белка от концентрации лиганда.
Видно, что добавление поли(А), поли(а А), поли(С), поли(и) и поли(А) поли(Ц)-дуплекса к раствору белка приводит к тушению флуоресценции, что свидетельствует об изменении окружения флуорофоров при связывании лигандов. Расчет констант ассоциации комплексов белка с лигандами проводили по уравнению Штерна-Фольмера [132] (3): где Fo и F - интенсивности флуоресценции свободного и связанного с лигандом gHSA соответственно;/- доля молекул флуорофоров, доступных для тушения; К х - константа диссоциации комплекса гликированного альбумина с полинуклеотидом; [Q] — концентрация лиганда (тушителя). Рассчитанные значения для/и Кй приведены в табл. 3. Как видно из табл. 3, поли(А) связывается гликированным альбумином примерно в три раза эффективнее, чем поли(сІА). При этом значения фактора/для обоих комплексов примерно одинаковы, что может свидетельствовать в пользу того, что при связывании этих лигандов конформация белка одинакова. Напротив, при равных значениях констанг ассоциации комплексов гликоальбумина с одноцепочечной поли(А) и поли(А) поли(и)-дуплексом доля доступных для тушения флуорофоров отличается примерно в два раза, что может быть объяснено различиями в пространственной структуре белка при связывании этих лигандов. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что на эффективность связывания гликированным HSA полирибонуклеотидов влияют как структура гетероциклического основания, так и природа остатка сахара. 3.3. РНК-гидролизующая активность сывороточного альбумина В течение долгого времени белки крови человека привлекают к себе внимание большого числа исследователей. Исследования последних лет привели к открытию новой функции белков плазмы крови. Было показано, что белки как иммунной системы человека (IgG, slgA), так и неиммуноглобулиновой природы, например, лактоферрин, наряду с НК-связывающей активностью, обладают нуклеазной активностью [187—191]. Недавно было обнаружено, что в присутствии бычьего сывороточного альбумина наблюдается расщепление фосфодиэфирных связей в РНК [9, 192]. Несмотря на то, что гомология по аминокислотной последовательности HSA и BSA составляет 76% [1], каталитические свойства белков могут отличаться. Например, альбумин из бычьей сыворотки более эффективен в реакции гидролиза PNPA, чем HSA [50]. Так как в литературе отсутствуют данные о РНК-гидролизующей активности человеческого сывороточного альбумина, задачей следующего этапа настоящей работы было исследовать реакцию гидролиза РНК в присутствии HSA.
