Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Физико-химические, структурные и функциональные свойства сывороточных альбуминов 10
1.1. Физико-химические свойства сывороточных альбуминов 10
1.2. Современное представление о структуре молекул сывороточных альбуминов 12
Глава 2. Транспортная и депонирующая функция сывороточных альбуминов 18
2.1. Классификация активных центров сывороточных альбуминов 18
2.2. Специфические центры для связывания высших жирных кислот (участок I) 21
2.3. Центры для связывания L -триптофана и некоторых эндогенных и экзогенных веществ (участок 2)... 25
2.4. Центры для связывания билирубина и некоторых эндоненных и экзогенных веществ (участок 3)... 27
2.5. Связывание ионов меди, никеля и других металлов с альбуминами (участок 4) 31
2.6. Специфический центр для связывания гемина (участок 5) 35
2.7. Центры для связывания некоторых лекарственных веществ (участок 6) 35
2.8. Конкурентно-аллостерическое взаимодействие центров 37
Глава 3. Структурные перестройки альбуминов под действием рН, температуры и ионной силы 39
3.1. Структурная лабильность молекул сывороточных альбуминов 39
3.2. Конформационные состояния альбуминов в области низких значений рН 40
3.3. рН-индуцируемые конформационные переходы сывороточных альбуминов в нейтральной и слабо щелочной средах 44
3.4. Влияние ионной силы на конформационное состоя -ние сывороточных альбуминов в нейтральной области рН 47
3.5. Влияние температуры на конформационное состояние сывороточных альбуминов в нейтральной зоне рН. 49
Глава 4. Препараты и методы исследования 57
4.1. Характеристика используемых препаратов 57
4.2. Краткая характеристика флуоресцентных методов исследования белков 61
4.3. Приборы и методы исследования.. 64
Глаьа 5. Влияние ионной силы и ионного состава среды на N -форму сывороточного альбумина человека 75
5.1. Влияние разных концентраций Н^СІи HatSoAна состояние Тгр -214 75
5.2. Влияние ионной силы на состояние центра связывания АНС 75
5.3. Связывание ионов кальция 86
5.4. Конкуренция за связывание меаду дифильными молекулами 90
Глава 6. Влияние температуры и ионной силы на функцио нальные и структурно-физические свойства N -формы сывороточного альбумина человека 94
6.1. Введение 94
6.2. Образование гидрофобных участков в области второго домена молекулы сывороточного альбумина... 95
6.3. Индуцируемые нагреванием изменения состояния в области центра связывания флуоресцирующего зонда 100
ГлаЕа 7. Влияние ионной силы и температуры на индуциру емые закислением среды структурные переходы сывороточного альбумина человека 106
7.1. Введение 106
7.2. Расщепление N-F -перехода при низких значениях ионной силы и влияния на него температуры 108
7.3. Двухступенчатый характер N- -перехода как проявление нарушения мевдоменной упаковки и вторичной структуры белка 111
Глава 8. Состояние сывороточного альбумина человека в зоне рН от 5 до 10 122
8.1. Введение 122
8.2. Флуоресценция остатков триптофана 123
8.3. Флуоресценция связанного АНС 127
Заключение 131
Основные выводы 134
Литература 137
- Современное представление о структуре молекул сывороточных альбуминов
- Специфические центры для связывания высших жирных кислот (участок I)
- рН-индуцируемые конформационные переходы сывороточных альбуминов в нейтральной и слабо щелочной средах
- Краткая характеристика флуоресцентных методов исследования белков
Введение к работе
Актуальность темы. Кровь позвоночных животных содержит в качестве главного белка сыворотки альбумин. Основная физиологическая функция сывороточного альбумина, по-видимому,заключается в связывании и транспорте с кровью и межклеточной (интерстициальной) жидкостью по всему организму низкомолекулярных метаболитов и случайно попадающих в кровь веществ как органической, так и неорганической природы / 35,116 /.
Различным структурным классам связываемых веществ (называемых обычно лигандами) на молекуле альбумина соответствуют отдельные специфичные центры связывания. Для многих лигандов альбумина известна направленность их транспорта в организме от одних органов и тканей к другим. Так, например, токсические продукты жизнедеятельности и ионы тяжелых металлов должны быть доставлены в соответствующие органы выделения. Такой же метаболит как триптофан доставляется главным образом в центральную нервную систему, где превращается в нейромедиа-тор серотонин. Можно полагать, что в ряде случаев лиганд может не только избирательно освобождаться в капиллярах определенных тканей, но эта "разгрузка" должна производиться достаточно быстро и полно. Простейшая избирательность "адреса доставки" может быть достигнута снижением равновесной кон -центрации свободного лиганда в кровеносных капиллярах или межклеточной жидкости тканей-адресатов, вследствие быстрого всасывания и связывания лигандов структурами самой ткани. Не исключено однако, что в органах и тканях существуют специальные специфические механизмы регуляции связывания и освобождения лигандов, взаимодействующих с альбумином.
Одним из механизмов регуляции скорости, прочности и емкости связывания отдельных классов транспортируемых альбуми ном лигандов может быть изменение в капиллярах и интерстиции отдельных тканей некоторых физико-химических характеристик, таких как рН, ионная сила, ионный состав, температура, то есть направленное отклонение от среднего отдельных компонентов гомеостаза крови и межклеточной жидкости. Предпосылки для такого механизма имеются как в свойствах самого белка-транспортера, так и в известных потенциальных возможностях гомеостатических сдвигов в различных органах и тканях организма. Для сывороточных альбуминов характерны изменения структурных и физико-химических свойств в области средних физиологических значений рН (например, структурный /Y-B-ne-реход при рН 7-9), температуры (структурная перестройка при 30°- 40°С). Известно и влияние этих переходов на связывание некоторых классов лигандов. Уже это может служить предпосылкой для рассматриваемого механизма регуляции транспорта.
С другой стороны, средние значения основных физико-химических параметров крови крупных кровеносных сосудов (рН 7,4, температура 36-38°С, ионная сила около 0,15) подвержены вариациям от ткани к ткани и при изменении физиологического состояния организма. В зависимости от физиологического состояния, от локализации того или иного органа или ткани в теле теплокровного животного, от температуры и влажности окружающей среды и от специфики и интенсивности биоэнергетических и других метаболических процессов в данной ткани, температура в кровеносных капиллярах и в интерстициальном пространстве может варьировать от 10-15° до 42° / 33,234 /. При физических нагрузках, воспалительных процессах и некоторых нарушениях обмена веществ (например, при кетозе) значение рН в периферических органах и тканях также может сущестЕеннно отличаться от указанной средней величины / 23,231 /. Кон центрация ионов А/л4,К+, Са2 , Mg2+, V\ ц2\ Ро"и НСО3 в плазме крови человека составляет в среднем соответственно 142-150; 4,5-5,0; 5,0; 1,1; 103; 1,0; 2,0 и 27мМ. Концентрация осмотически активных веществ (осмолярная концентрация) в сьшоротке крови составляет в среднем 0,3 осмоля/л /232/. Ионный состав плазмы крови обычно постоянен. Однако, при некоторых патологических состояниях, а также при бессолевой диете, усиленном потоотделении и др. могут происходить значительные изменения ионного состава плазмы крови, сопровождающиеся уменьшением содержания в ней Ма+$ К+, Са + и других ионов / 230,232,235 /.
Такие изменения температуры, рН, ионной силы и ионного состава внутренней среды организма могут оказывать существенное влияние на взаимодействие лигандов с сывороточным альбумином, а значит и на его транспортные функции. Однако даже в нормальном физиологическом состоянии эти параметры могут подвергаться значительным отклонениям от средних значений в капиллярах и межклеточном пространстве отдельных тканей. Причиной таких отклонений могут служить, например, ионообменные процессы в выстилке капилляров и на поверхности клеток. Высокой эффективности таких процессов способствует значительное отношение поверхности к объему в капиллярах и межклеточных щелях, по сравнению с крупными сосудами.
Цели и задачи работы. Сформулированная выше гипотеза о регуляции транспортной функции сывороточного альбумина физико-химическими факторами среды требует разносторонней проверки и обоснования на молекулярном, морфологическом и физиологическом уровнях. Целью этой работы является выявление молекулярных предпосылок возможности регуляции связывания лигандов физико-химическими факторами среды, которые заложе ны в свойствах самого сывороточного альбумина.
Для достижения этой цели было проведено исследование комбинированного воздействия изменений температуры, рН, ионной силы и ионного состава на определенные участки в сывороточном альбумине человека in vitro . Метод флуоресценции позволил диагносцировать изменения состояния в окружении единственного триптофанового остатка в белке и в области главного центра связывания красителей. Диагностику проводили по параметрам флуоресценции белкового триптофана {Тгр -214) или связанного красителя АНС (І-анилиннафталин-8-сульфоната), а также по параметрам ассоциации АНС с главными центрами связывания альбумина.
Реально эта задача решалась в следующих конкретных исследованиях:
1. Изучение влияния ионов на состояние сывороточного альбумина человека в N -форме (рН 6-7).
2. Изучение влияния температуры в физиологическом ее диапазоне на N -форму сывороточного альбумина.
3. Изучение комплексного влияния температуры и ионной силы на кислотные перестройки N-F и F-E сывороточного альбумина.
4. Изучение влияния температуры и ионной силы на рН-инду-цируемые перестройки сывороточного альбумина в зоне рН от 5 до 10 (главным образом, /V - В -переход).
Научная новизна. На единообразном препарате мономерного сывороточного альбумина человека проведено систематическое исследование влияния рН (от 2 до 10), температуры (от 10 до 45°), ионной силы (от 0,001 до 0,2) и природы анионов (хлорид или сульфат) на структурно-физическое состояние двух локальных участков молекулы и способность связывать краситель в одном из специфических центров связывания лигандов. Получены прямые экспериментальные доказательства того, что даже сравнительно небольшие изменения рН и температуры способны существенно изменять сродство альбумина к лигандам. Это означает, что эти физико-химические факторы среды могут в принципе регулировать "загрузку" и "разгрузку" специфических центров связывания альбумина, то есть регулировать его транспортную функцию.
Охарактеризовано влияние температуры и ионной силы раствора на рН-индуцируемые перестройки альбумина. Обнаружено расщепление N-F -перехода на две перестройки при повышении температуры и понижении ионной силы. Обнаружена конкуренция вторичных центров связывания красителя с длинноцепочечными ненасыщенными жирными кислотами.
Практическая ценность. Полученные результаты можно рассматривать как вклад в общую молекулярную теорию транспортной функции сывороточного альбумина. Их необходимо учитывать как в развитии молекулярно-биофизических представлений о транспортной функции крови, так и в физиологических и фармакологических исследованиях распределения веществ, в частности лекарств (фармакокинетика) в организме. Полученные данные и развиваемые подходы могут быть также полезны при изучении нарушений гомеостаза в организме в особых физиологических и патологических состояниях.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на ІУ Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков,1981г.) и на СОЕЄТЄ уполномоченных стран СЭВ и СФРЮ по проблеме "Биофизика" (Улан-Батор,1984г.).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи и тезисы двух докладов.
Современное представление о структуре молекул сывороточных альбуминов
Хотя давно было известно, что молекула сывороточных аль- буминов состоит из одной полипептидной цепи, только в 1975 году была опубликована полная аминокислотная последовательность альбумины быка / 60 / и человека / 52,143 / и локализация внутримолекулярных дисульфидных связей / 52,60,143 / (рис.1). Эти данные стимулировали дальнейшие исследования, направленные на изучение пространственной организации молекулы альбумина и выяснение локализации и характера центров связывания различных лигандов. Возникла необходимость заново провести анализ результатов более ранних работ / 55,85,215, 216 / уже с более реальной точки зрения. Одновременно с таким анализом были предприняты попытки создать модели структурной организации молекулы альбуминов.
Исследуя физико-химические свойства и изомеризацию молекул альбуминов в кислой области рН (рН 5), более 20 лет тому назад Форстер / 85 / выдвинул гипотезу, согласно которой молекула альбумина состоит из четырех аналогичных глобулярных "субъединиц" (доменов), составленных единой полипептидной цепью. Несколько позже Вебер и Янг / 215,216 / на основании результатов исследования ферментативного расщепления предположили, что молекула альбумина состоит из одной большой субглобулы (тяжелой фракции) и двух или трех меньших глобул (легких фракций), отделяющихся в результате протеоли-за и располагающихся вокруг большой глобулы. Существуют и другие модели структуры альбумина, основанные на результатах исследований гидродинамических свойств и малоуглового рассеяния рентгеновских лучей раствором белка, такие как модель Блумфилда / 55 / и другие. Эти исследования послужили серьезными факторами, способствовавшими формированию современных представлений о пространственной организации молекул сывороточных альбуминов как ансамбля из нескольких (3 4) глобулярных внутримакромолекулярных доменов. Однако, конкретное рассмотрение состава доменов и их структурных особенностей стало возможным только после установления полной аминокислотной последовательности альбуминов (1975г.). Это было сопряжено с процессом разработки эмпирических и теоретических методов предсказания вторичной и пространственной структуры молекул белка, опирающихся на известную аминокислотную последовательность белков / 22,29,71,135 /. Применение таких методов для анализа вторичной структуры сывороточных альбуминов позволило ряду исследователей / 71,136 / ориентировочно установить распределение элементов вторичной структуры ( ot-спиральных и _/?-складчатых структур и jS-шпилек). Однако это предсказание в связи с очень большой длиной цепи молекулы альбумина еще требует дополнительного уточнения. В то же время следует отметить, что результаты теоретического предсказания содержания элементов вторичной структуры достаточно хорошо согласуется с экспериментальными результатами оптических методов исследования (таблица I). Обращает на себя внимание высокое содержание структурированных элементов цепи в молекулах альбуминов: суммарное содержание оС- и fi-структурных участков достигает 65-75%, причем распределение этих элементов вдоль цепи, судя по данным, полученным для разных протеолитических фрагментов является довольно равномерным.
В результате тщательного анализа распределения элементов вторичной структуры и дисульфйдных мостиков в молекуле бычьего альбумина Браун / 59,61 / обнаружил три главных участка цепи, аналогичные по вторичной структуре, к которым относятся отрезки, ограниченные остатками Ш 1 190; 191 381, а также 382-5-582, соответственно (рис.1). Предполагается, что отрезки организуют соответствующие глобулярные домены в пространстве. Каждый домен был в дальнейшем подразделен на два субдомена: к первому относятся первая большая и центральная малая петли, ко второму - последняя длинная петля. Это хорошо видно на рис.1. Таким образом, по представлению Брауна, молекула сывороточных альбуминов состоит из трех доменов, каждый из которых содержит по три петли, организующих два субдомена. Иначе говоря, пространственная структура молекулы альбумина определяется взаимной упаковкой трех крупных доменов, шести субдоменов или девяти петель. При этом 17 дисульфидных связей располагаются лишь внутри доменов следующим образом: (53-62, 75-90, 91-101, 123-166, 167-175), (221-266, 267-274, 286-299, 303-310, 337-381), (382-390, 413-432, 433-443, 456-471, 472-482, 509-553, 554-562) / 62 /. Такое расположение дисульфидных связей, по мнению Брауна / 62 /, обеспечивает практически параллельную упаковку трех отдельных участков ( X » tf » 2 на рисі) в длинной петле каждого домена, действенная свободная сульфгидрильная группа находится в аминокислотной последовательности первого домена в положении 34.
Специфические центры для связывания высших жирных кислот (участок I)
В крови присутствуют высшив жирные кислоты Cjg - Cjg (кислоты с длинной С-цепью), а также незначительные количества некоторых жирных кислот Cg - CJQ (кислоты с С-цепью средней длины). Высшие жирные кислоты практически нерастворимы в водных средах при физиологических значениях рН. Поэтому транспорт альбумином и другими бежами является неотъемлемым условием для их метаболизма в организме.
В обычных условиях молярное отношение концентраций высших жирных кислот и альбумина в плазме человека колеблется в пределах 0,5-1,5 / 116,191 /. При таком состоянии они связываются главным образом с первичными центрами альбумина. При значительном повышении относительной концентрации жирных кислот в циркулирующей крови (например, после еды и во время интенсивной мышечной работы, когда энергетическое обеспечение организма осуществляется в основном за счет катаболизма жирных кислот, названное отношение может увеличиваться до 4,0)/ 191 /, существенную роль в транспорте и регуляции концентрации свободных жирных кислот в плазме могут играть и вторичные центры связывания. В альбумине существует несколько типов центров связывания жирных кислот с последовательно убывающей константой сродства (см.табл.3).
Взаимодействие жирных кислот с соответствующими центрами альбумина определяется множеством факторов, среди которых важное значение имеет, в частности, соотношение концентрации той или иной жирной кислоты и концентрации альбумина в плазме крови, а также концентрационное соотношение разных находящихся в плазме жирных кислот между собой / 91,190 /. Как отмечает Спектор / 191 /, еще до заполнения первичного центра начинается связывание в последующих центрах. Например, при молярном соотношении олеата и альбумина 2:1 оказываются заняты 20$ третичных и 1% четвертичных центров связывания.
Есть указания на то, что в формировании единого наиболее сильного центра связывания пальмитата и других жирных кислот с длинной С-цепью принимают участие остатки IU-386 и Ы-387 / 165,171 /. Б альбуминах быка и человека этот центр связывания занимает, по-видимому, одно и то же место. Вероятно он находится в гидрофобной щели, внутри которой размещается алифатическая цепь лиганда. Отрицательный заряд лиганда сбалансирован может быть поверхностными катионными аминокислотными группировками / 165 /. Несмотря на то, что вопрос о локализации вторичного и последующих центров связывания жирных кислот с длинной С-цепью на молекуле альбумина остается нерешенным, анализ связывания пальмитата некоторыми фрагментами альбумина говорит о возможности их локализации в среднем домене / 164 /.
Для классификации центров наиболее полезными оказываются результаты исследований конкуренции за связывание между высшими жирными кислотами и лигандами иной природы. Изучая влияние концентрации жирных кислот на связывание метилового оранжевого бычьим альбумином І удман / 91 / заключил, что основной центр связывания высших жирных кислот располагается, по всей вероятности, на каком-то расстоянии от центров связывания красителя. Не исключено, что вторичные центры связывания высших жирных кислот могут осуществлять связывание и этого красителя / 91 /. Интересные результаты были получены при изучении связывания жирных кислот с альбуминами по флуоресценции связанного с белком І-анилин-8-нафталинсульфоната (АНС)/ 178,179,210 /. Методом равновесного диализа установили / 178 /, что добавка 1-2 молей пальмитата или олеата на каждый моль комплекса белок-краситель (1:1) не оказывает влияния на связывание АНС с альбумином. В то же время при до -бавлений 3 или более молей высшей жирной кислоты происходило вытеснение молекул АНС из белка / 178,179 /. Приведенные данные показывают, что исследование спектроскопических свойств связанного альбумином красителя позволяет получить информацию о состоянии вторичных центров жирных кислот.
Сравнительно слабо изучено связывание альбумина и жирных кислот с С-цепью средней длины. Известно, что они конкурируют с ацетил- L-триптофаном, но не конкурируют с высшими жирными кислотами / 75 /. Значения констант ассоциации жирных кислот с С-цепью средней длины с альбуминами значительно ниже соответствующей константы для высших жирных кислот. Это видно, в частности, из сопоставления параметров связывания жирных кислот со средней (гексанат, октанат, деканат) и боль шой (пальмитат, линоленовая, олеиновая) длиной С-цепи, приведенных в таблице 3.
рН-индуцируемые конформационные переходы сывороточных альбуминов в нейтральной и слабо щелочной средах
Впервые Клотц с соавторами / 115 /, обнаружив рост числа центров связывания некоторых анионных и нейтральных красителей в молекуле бычьего альбумина при изменении рН от 7,0 до 9,0, высказали предположение о существовании конформационного перехода белка в этой области рН. Это предположение подтвердилось в результате дальнейших исследований конформационных состояний альбуминов человека и быка методами дисперсии оптического вращения / 98,127,214 /, ЯМР, ковалентно связанного с сульфгидрильными группами зонда / 229 / и других спектроскопических свойств некоторых лекарственных веществ (варфарин, диазепин) и метаболитов (билирубин и кальций) в комплексах с человечий альбумином / 106,160,223,224 / методами собственной флуоресценции белка / 96 / и флуоресценции красителя AHG, связанного с альбумином быка / 31 /, равновесного диализа / 223 /. Получаемая при титровании до рН 8,5 форма была названа формой В, а переход, соответственно,N -В-переходом. Здесь следует отметить, что А/-В-переход альбумина происходит не только в чистых растворах, но и в нативной сыворотке человека / 212/ . Кроме изменений на уровне третичной структуры в альбумине человека наблюдается очень слабое уменьшение содержания об-спиральных участков (на 2,5/ / 214 /). Более детальный механизм этого структурного перехода остается пока невыясненным. Основной причиной, приводящей к структурному переходу, по-видимому, является депротонирование функциональных групп, имеющих рК в области 6-8. В результате детального исследования молекулы альбумина быка методом потенциометрического титрования в области титрования гистидиновых остатков, Харм-сен с сотрудниками / 98 / пришли к выводу, что при Л/-В-переходе главную роль играет депротонирование имидазольных групп гистидина. Хотя окружение сульфгидрильной группы претерпевает изменения, она не принимает прямого участия в кон-формационном переходе / 156,229 /.
Форма А. Струпу и Фостеру "/ 195 / удалось выделить еще одну стабильную изомерную форму молекулы меркаптальбумина (альбумин, содержащий одну активную тиолгруппу / 40 /), названную формой А, процентное содержание которой возрастает при увеличении рН от 7 до 9 при низкой ионной силе (порядка 0,01). В результате детального сравнительного анализа кон-формационных свойств изомеров А/ и А эти исследователи предположили, что форма В является промежуточной формой в кон -формационной изомеризации молекул сывороточного альбумина от N до А. В этом плане представляет большой интерес исследование ft/ - В перехода при низкой ионной силе с помощью различных физических и физико-химических методов.
Поскольку ftl-B -переход альбуминов индуцируется изменениями рН, частично находящихся в физиологической области,интересно выяснить влияние на данный переход таких факторов, как температура, ионная сила и связывание низкомолекулярных веществ. Средняя точка АІ- В-перехода { рН 7,4 при ЮС и низкой ионной силе) сдвигается в сторону меньших значений рН на 0,5-0,6 единиц рН с ростом температуры до 45С / 106, 214 / и увеличением ионной силы до 0,2 / 98,127 /. Замена нейтральных солей (хлоридов) сильно связываемыми анионами перхлората или тиоцианита приводит к заметному сдвигу середины перехода в щелочную сторону / 127 /. Эти данные могли бы свидетельствовать о специфическом влиянии связывания анионов на конформацию белка. Другой интересный, с точки зрения возможных механизмов функциональной регуляции сывороточных альбуминов, факт был обнаружен Хармсеном с сотрудниками / 98 / при помощи метода оптического вращения и позже подтвержден рядом других авторов / 224,229 / с использованием разных методов. Он заключается в том, что середина yV-B-пе-рвхода альбуминов сдвигается в сторону меньших рН почти на целую единицу в присутствии ионов кальция в концентрации, сравнимой с его содержанием в крови (2,5 10 М). Есть литературные данные о том, что в присутствии ионов кальция середина N-В -перехода, регистрируемого по спектроскопиче -ским характеристикам, связанного с альбумином варфарина, сдвигается в кислую / 224 / и диазепина в щелочную сторону / 223 /. Это, по-видимому, показывает, что окружение лиганда в двух классах центров связывания лекарственных веществ изменяется, и изменяется по-разному при связывании белком кальция. К сожалению, в настоящее время отсутствуют систематические исследования для выяснения этого вопроса. Это весьма интересный факт, так как он может означать, что концентрация ионов кальция может выступать в роли регуляторного фактора, который может по-разному влиять на рН-зависимость связывания разных классов лигандов, способствуя связыванию альбумином одних и освобождению других. Возможно этот процесс представляет собой пример еще одного типа регуляторных процессов в организме, осуществляемых ионами кальция.
Краткая характеристика флуоресцентных методов исследования белков
В настоящее время существует много физических и физико-химических методов, позволяющих изучить пространственную организацию белковой молекулы, чувствительных к локальным структурным изменениям и подвижности боковых цепей аминокислотных остатков. К таким методам относятся, в частности, рентгеноструктурный анализ, электронный и ядерный магнитный резонанс, круговой дихроизм, дисперсия оптического вращения, люминесценция и так далее. В данной области исследований достаточно широкое применение получил метод белковой флуоресценции. Это объясняется относительной простотой метода и возможностью проведения экспериментов практически без вмешательства в процессы,протекающие в исследуемом образце. Исследование различных флуоресцирующих меток и зондов, связывающихся с белком, является одним из широко используемых методов в биологических исследованиях, хотя в настоящее время имеются трудности в идентификации тех молекулярных компонентов, с которыми связываются эти красители. Одним из таких красителей является АНС, использованный в данной работе в качестве флуоресцирующего зонда. Многие нативные белки имеют участки, связывающие этот зонд. Поскольку такими участками часто оказываются активные центры белков, зонды являются чувствительными индикаторами изменений, происходящих в этих центрах. Ароматические аминокислоты белков,такие как триптофан, тирозин, фенилаланин, ответственные за собственную флуоресценцию, в свою очередь являются естественными метками молекулы / 3 /. Наиболее богатую информацию о белковой молекуле из этих трех флуоресцирующих аминокислот несут остатки триптофана. Триптофановые остатки в белке находятся, по крайней мере, в трех дискретных состояниях / 4,10 / с определенными значениями длин волн максимумов, величин полуширины спектров и квантового выхода флуоресценции (см.табл.8). Физический смысл трех дискретных состояний триптофанилов в глобулярных белках определяется, главным образом, указанными изменениями параметров триптофаниловой флуоресценции белка. Относительно коротковолновое положение максимума, малая полуширина спектров и сравнительно низкий квантовый выход первого класса триптофанилов {см.табл.8) характерны таким состояниям, при которых триптофановые остатки локализованы внутри белковой глобулы и находятся в гидрофобном окружении. Триптофановые остатки, локализованные на поверхности белковой глобулы и находящиеся в полярном водном окружении (трипто-фанил Ш класса,см.табл.8) характеризуются большим стоксовым сдвигом, большой полушириной спектра и относительно низким квантовым выходом.
Второму классу соответствуют триптофани-лы, находящиеся в промежуточных состояниях (между первым и третьим классами) и характеризуются промежуточными значениями положения максимума флуоресценции, полуширины спектров и относительно высоким выходом флуоресценции. Это означает,что в частности любые изменения микроокружения триптофановых остатков в глобулярных белках при изменениях структурной организации белков могут отражаться на перечисленных характеристиках триптофаниловой флуоресценции. Данное обстоятельство послужило основой интерпретации данных, полученных в настоящей работе методом собственной флуоресценции при исследованиях изменений структурно-функциональных свойств сывороточного альбумина человека под действием внешних физико-химических факторов. Высокая чувствительность как собственной флуоресценции, так и флуоресценции зонда, связанного с белком, позволяет работать с относительно малыми концентрациями белка. С помощью различных параметров флуоресценции (собственной флуоресценции белка и (или) флуоресценции зонда АНС) можно получить информацию о локализации хромофоров, о некоторых конкретных физических свойствах их окружения, а также о кинетических и динамических изменениях при взаимодействии с другими веществами. Более подробно ознакомиться с теорией собственной флуоресценции белков и флуоресценции зондов, связанных с белком, можно по монографиям и обозорам / 4-3,11,12,20,37 /.
