Введение к работе
Актуальность проблемы. Ключевые аспекты функционирования нейронов регулируются за счет изменений концентрации внутриклеточного кальция, которые в зависимости от своей интенсивности и продолжительности активируют различные сигнальные каскады, приводящие к конкретным физиологическим эффектам. Разнообразие этих эффектов является результатом действия белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров (НКС), способных распознавать сигналы кальция и преобразовывать их в широкий спектр клеточных ответов. За счет этой способности НКС вовлечены в сигнальные механизмы, обеспечивающие нормальную жизнедеятельность нейронов, начиная от роста и выживаемости, и заканчивая сенсорной функцией, нейротрансмиссией и всеми этапами синаптической пластичности. Более того, нарушение экспрессии и(или) функционирования НКС приводит к активации патогенетических сигнальных механизмов, ассоциированных с целым рядом заболеваний центральной нервной системы.
Примером сигнального каскада с участием НКС является передача зрительного сигнала
9+
в фоторецепторной клетке (фототрансдукция). Центральным элементом Са -зависимой регуляции фототрансдукции является НКС рековерин, функция которого заключается в придании процессу десенситизации зрительного рецептора родопсина чувствительности к ионам кальция. При высокой концентрации кальция, характерной для темнового состояния фоторецепторной клетки, рековерин ингибирует фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой. В ответ на световой стимул происходит снижение концентрации кальция в цитоплазме фоторецепторной клетки, рековерин теряет способность ингибировать родопсинкиназу, в результате чего происходит фосфорилирование родопсина, инициирующее быстрое выключение фотовозбужденного рецептора.
Белки семейства НКС, включая рековерин, обладают высокой степенью структурного сходства. Гомология распространяется на структуру их Са -связывающих центров, а также гидрофобного кармана, который, как считается, образует основной и единственный структурный мотив, отвечающий за связывание НКС с их мишенями. Этим наблюдениям противоречит тот факт, что каждый НКС способен реагировать на изменение концентрации внутриклеточного кальция в своем узком диапазоне и в ответ на это с высокой специфичностью распознавать и эффективно модулировать активность разных сигнальных партнеров. Несмотря на интенсивные исследования НКС, проводимые в последнее время, взаимосвязь между структурной организацией этих белков и специфичностью их регуляторной активности до сих пор остается неустановленной. Кроме того, постоянное обнаружение новых мишеней для НКС усложняет решение этой проблемы. В связи с этим актуальной задачей является поиск регуляторных элементов в структуре НКС, которые могли бы обеспечивать уникальность функциональных свойств каждого из этих белков. Мы предположили, что одним из таких элементов может быть С-концевой сегмент - последовательность, которая среди НКС отличается вариабельностью структуры всех уровней. В настоящей работе исследована роль С-
9+
концевого сегмента в обеспечении эффективности и специфичности Са -зависимого функционирования НКС рековерина.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - исследование регуляторной функции С-концевого сегмента рековерина. В процессе выполнения работы решались следующие задачи.
1. Изучение роли С-концевого сегмента в поддержании целостности структуры рековерина.
9+
Изучение роли С-концевого сегмента в регуляции Са -зависимых свойств рековерина.
Изучение роли С-концевого сегмента в способности рековерина узнавать и ингибировать родопсинкиназу.
Установление аминокислотных остатков С-концевого сегмента, принимающих участие в Са -зависимой регуляторной активности рековерина.
Научная новизна. В настоящей работе впервые показана роль С-концевого сегмента как элемента структуры, обеспечивающего регуляцию функционирования рековерина. Впервые обнаружено, что С-концевой сегмент принимает участие в настройке чувствительности рековерина к ионам кальция и, как следствие, вовлечен в регуляцию Са -зависимых свойств белка. Исследована структурная организация С-концевого сегмента рековерина. Впервые сформулирован молекулярный механизм, в соответствии с которым обеспечивается специфичность регуляторной активности рековерина в отношении его внутриклеточной мишени родопсинкиназы. Установлены аминокислотные остатки С-концевого сегмента рековерина, принимающие участие в образовании комплекса с родопсинкиназой. Выявленные контакты стабилизируют взаимодействие родопсинкиназы с гидрофобным карманом рековерина и тем самым обеспечивают эффективность ингибирования фермента. Практическая значимость. Рековерин локализуется в фоторецепторных клетках сетчатки глаза, где выполняет важнейшую функцию, модулируя активность родопсинкиназы и тем самым
9+
обеспечивая Са -зависимую регуляцию процесса фототрансдукции. Нарушение этого процесса приводит к возникновению целого ряда офтальмологических патологий. Помимо рековерина в фоторецепторных клетках присутствуют еще несколько белков НКС, каждый из которых модулирует активность строго определенных сигнальных партнеров. Отсюда выяснение
9+
структурных основ, обеспечивающих специфичность Са -зависимого функционирования различных НКС в фоторецепторных клетках, в частности, селективность узнавания ими своих мишеней, является необходимым условием для понимания молекулярных механизмов зрения в норме и при развитии офтальмологических заболеваний.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на семинаре отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ, на 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2010), на международном молодежном научном форуме "Ломоносов-2010" (Москва, 2010), на XI симпозиуме европейского кальциевого сообщества (Варшава, 2010) и на V российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Петрозаводск, 2011). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Структура и объём работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Библиографический указатель включает 195 цитированных работ.
