Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Строение, биогенез, биологические свойства и функции стероидных соединений в морских звездах 11
2.1. Общие сведения о классе Asteroidea (морские звезды) 11
2.2. Основные типы стероидных соединений морских звезд 14
2.2.1. Стерины морских звезд 16
2.2.1.1. Стерины и сульфаты стеринов 16
2.2.1.2. Биогенез стеринов в морских звездах 19
2.2.1.3. Биологические функции стеринов в морских звездах 23
2.2.2. Полигидроксистероиды и родственные низкомолекулярные гликозиды морских звезд 25
2.2.2.1. Полигидроксистероиды 25
2.2.2.2. Моно- и биозиды полигидроксистероидов 33
2.2.3. Астеросапонины 41
2.2.3.1. Агликоны астеросапонинов и их биосинтез 44
2.2.3.2. Астеросапонины первого структурного типа 49
2.2.4. Физиологическая активность полярных стероидных соединений морских звезд 54
2.2.5. Биологические функции астеросапонинов 57
2.3. Оксигеназы морских звезд 60
3. Обсуждение результатов 65
3.1. Введение 65
3.2. Получение суммарных фракций полярных стероидов из экстрактов морских звезд и выделение индивидуальных соединений 66
3.3. Установление строения окисленных стероидных соединений морских звезд 71
3.3.1. Полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов из Patiria (= Aster ina) pectin ifera 71
3.3.2. Исследование фрагментации в масс-спектрах полигидрокси- стероидных соединений из Patiria (= Asterina) pectinifera 91
3.3.3. Гликозиды полигидроксистероидов из Culcita novaeguineae 96
3.3.4. Полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов из Crossaster papposus 104
3.3.5. Стероидный гексаол и гликозиды полигидроксистероидов из Henricia derjugini 115
3.3.6. Гликозиды полигидроксистероидов из Solaster dawsoni 125
3.3.7. Полигидроксистероиды из Ctenodiscus crispatus 130
3.3.8. Лептастерозид L из Leptasteriaspolaris acervata 136
3.3.9. Полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов из Ceramaster patagonicus 139
3.3.10. Стероидный гексаол из Luidiaster dawsoni 148
3.3.11. Гликозиды полигидроксистероидов из Mediaster murrayi 150
3.3.12. Полярные стероидные соединения из Lethasterias nanimensis chelifera (курильская популяция, о. Шиашкотан) 157
3.3.13. Алкалоидостероиды и другие полярные стероидные соединения из Lethasterias nanimensis chelifera (курильская популяция, о. Онекотан) 162
3.3.14. Полярные стероидные соединения из Aphelasterias japonica (приморская популяция, залив Посьет) 174
3.3.15. Полярные стероидные соединения из Aphelasterias japonica (курильская популяция, о. Онекотан) 181
3.3.16. Гликозиды полигидроксистероидов mAsterias rathbuni. 186
3.3.17. Стероидные дисульфаты из Pteraster pulvillus 193
3.4. Физиологическая активность окисленных стероидных соединений морских звезд 199
3.4.1. Исследование гемолитических, эмбриотоксических и антимикробных свойств 199
3.4.2. Влияние на активность (3-1,3-/)-глюканазы из кристаллического стебелька двустворчатого моллюска Spisula sachalinensis 203
3.4.3 Астеросапонин* Р^ каналообразующее действие на БЛМ, кардиотропный эффект. 205
3.4.4. Стимулирующие эффекты агликонов астеросапонинов на сердце моллюска Spisula sachalinensis 207
3.4.5. Канцерпревентивное действие 208
3.5. Биологические функции полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морских звездах. 211
3.5.1. Распределение свободных стеринов, полигидроксистероидов и стероидных гликозидов в различных частях тела морской звезды Paliria (= Asterina) pectinifera 212
3.5.2. Сезонные изменения содержания полярных стероидов, включая полигидроксистероиды и родственные гликозиды, в органах пищеварения морской звезды Patiria (= Asterina) pectinifera 222
3.5.3. Сходство полигидроксилированных стероидных соединений морских звезд с желчными спиртами и кислотами позвоночных и их возможные биологические функции 229
3.6. Зависимость состава полярных стероидных соединений в морских звездах от места их обитания 235
3.6.1. Сезонные изменения состава суммарных фракций полигидроксистероидов и родственных гликозидов в органах пищеварения морской звезды Patiria (= Asterina) pectinifera 236
3.6.2. Географические вариации состава полярных стероидных соединений в морских звездах. 239
4. Экспериментальная часть 246
Выводы. 289
- Основные типы стероидных соединений морских звезд
- Моно- и биозиды полигидроксистероидов
- Биологические функции астеросапонинов
- Исследование фрагментации в масс-спектрах полигидрокси- стероидных соединений из Patiria (= Asterina) pectinifera
Введение к работе
Актуальность проблемы. Класс морских звезд (Asteroidea), относящийся к типу иглокожих (Echinodermata), состоит из более чем 1500 видов. Свыше 100 видов морских звезд обитают в Японском, Охотском и Беринговом морях, причем здесь они являются ведущими видами в биоценозах. Многие морские звезды -хищники, они наносят существенный вред подводным плантациям моллюсков, а в тропиках и коралловым рифам. Поэтому в некоторых морских районах существует необходимость ограничения численности этих животных и их утилизации.
Морские звезды отличаются от других животных большим разнообразием стероидных соединений. В них присутствуют различные группы этих веществ, но особое внимание привлекают окисленные стероидные соединения, к которым относятся полигидроксистероиды, гликозиды полигидроксистероидов, астеросапонины - стероидные олигогликозиды с пятью — шестью моносахаридными остатками, и другие родственные им вещества.
В основном интерес к окисленным стероидным соединениям морских звезд объясняется их разнообразной физиологической активностью. Экстракты морских звезд и индивидуальные вещества, выделенные из них, проявляют антивирусные, антимикробные, анальгетические, противовоспалительные, гипотензивные и другие биологические свойства. Окисленные стероиды играют определенную экологическую роль, являясь алломонами — веществами, отпугивающими многих морских животных: двустворчатых и брюхоногих моллюсков, морских ежей, лилий, актиний.
Кроме того, эти соединения часто имеют своеобразное химическое строение, значительно отличаясь от стероидных метаболитов наземных растений и животных. Изучением строения и свойств окисленных стероидных соединений морских звезд помимо нашей лаборатории (лаборатория химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН) занимаются научно-исследовательские группы из университетов Неаполя (Италия), Сантьяго де Компостелла (Испания), Фукуоки (Япония) и ряда других стран, а статьи, посвященные этой теме, публикуются в ведущих научных журналах мира.
К началу 80-х гг., когда были начаты наши исследования, из окисленных стероидных соединений морских звезд были известны только высокополярные "классические" астеросапонины, для которых характерно наличие сульфатированного стероидного агликона с А9(П^двойной связью и Зр,6а-диольной группировкой.
Целью данной работы является изучение структур и биологической роли низкомолекулярных полярных стероидов, в основном, полигидроксистероидов (число гидроксильных групп в них колеблется от четырех до девяти), монозидов и биозидов полигидроксистероидов, дисульфатированных стероидов и близких к ним по полярности сульфатов и монозидов астерогенинов. Знание химического строения этих соединений может использоваться в дальнейшем для изучения строения и зависимости структура - активность для подобных стероидов, прогнозирования возможной физиологической активности новых соединений, выявления полезных свойств этих веществ и формирования предложений по их практическому использованию. Кроме того, результаты такого рода исследований важны для понимания биологических функций окисленных стероидов, а также изучения их экологической роли в морских биоценозах.
Задачами настоящей работы были: - выделение большой серии новых полярных стероидов из морских звезд, установление их структуры и изучение их свойств, включая биологическую активность; - изучение зависимости состава окисленных стероидных соединений морских звезд от места их обитания; - изучение распределения окисленных стероидных соединений, в том числе полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов, в различных частях тела морских звезд и сезонных изменений в содержании этих соединений с целью выяснения их биологической роли.
Научная новизна работы. Из спиртовых экстрактов 14 видов морских звезд было выделено 76 окисленных стероидных соединений. Установлено строение 50 новых соединений и проведена структурная идентификация 26 веществ с известными ранее веществами.
Впервые были выделены гликозиды полигидроксистероидов с (1-»5) и (1-»6) гликозидными связями в углеводных цепях, а также гликозиды, содержащие редкие моносахариды: галактофуранозу, 2,3-ди-О-метилксилопиранозу, 5-0-сульфат 3-0-метиларабинофуранозу и 2-0-сульфат арабинофуранозу.
Впервые в окисленных стероидах морских звезд обнаружены необычные фрагменты: 23-кето-24-гидроксихолестановая, 29-сульфат 28,29-дигидрокси-24-этилхолестановая и 28,29-дигидрокси-24-пропилхолестановая боковые цепи, а также 24-гликозилированная 24,26-дигидроксихолестановая боковая цепь, сочетающая одновременно структурные признаки гликозидов и свободных полигидроксистероидов.
Найдена новая структурная серия стероидных соединений морских звезд, названных нами алкалоидостероидами. Эти соединения представляют собой ионные гибриды, состоящие из окисленного стероидного аниона и алкалоидного катиона.
Выполнены биологические испытания полигидроксистероидов и родственных гликозидов и показано, что они проявляют гемолитические и цитотоксические свойства. Установлено, что левискулозид L обладает канцерпревентивным действием, а 'астеросапонин' Р| и его десульфатированное производное способны формировать ионные каналы в модельных липидных мембранах. Показано, что некоторые гликозиды полигидроксистероидов могут активировать Р-1,3-D-глюканазу из моллюска Spisula sachalinensis, а некоторые астерогенины - оказывать стимулирующий эффект на сердце этого же моллюска.
Изучено распределение полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в различных частях тела морской звезды. Показано, что свободные стерины и астеросапонины присутствуют во всех изученных тканях животных, а полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов - только в органах пищеварения - желудке и пилорических выростах. Изучены сезонные изменения содержания полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морской звезде. Установлено, что эти соединения присутствуют в органах пищеварения животных постоянно на протяжении всего года, и их максимальная концентрация совпадает с периодами активного питания зимой, во время посленерестовой перестройки, и летом, в период интенсивного гаметогенеза перед нерестом. Исходя из этого, а также на основании сходства их химического строения и свойств с желчными спиртами и кислотами рыб, амфибий, высших животных и человека сделано предположение, что одной из биологических функций полигидроксистероидных соединений является их участие в переваривании пищи подобно желчным спиртам и кислотам у более высокоразвитых животных.
Изучены сезонные изменения в составе суммарной фракции полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морских звездах, принадлежащих к одной популяции. Показано, что в течение года состав этих веществ является довольно постоянным, несмотря на незначительные сезонные колебания в относительном содержании соединений. При сравнении разных популяций одного и того же вида морских звезд установлено, что состав окисленных стероидных соединений у них различен и зависит от места сбора животных.
Публикация результатов исследования. Основные результаты настоящего исследования опубликованы в научных журналах: Химия природных соединений; Биоорганическая химия; Известия Академии наук, серия химическая; Tetrahedron Letters; Journal of Natural Products (Lloydia); Comparative Biochemistry and Physiology, В. Кроме того, отдельные части работы были опубликованы в материалах отечественных и международных конференций и симпозиумов. По теме диссертации опубликованы 53 работы, в том числе 33 научных статьи.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного строению, биогенезу, биологическим свойствам и функциям стероидных соединений морских звезд, Обсуждения результатов, где приведены и обсуждены полученные результаты, и Экспериментальной части, в которой описаны приборы, биологический материал, использованный в работе, а также основные методики и эксперименты. В конце диссертации приведены Выводы и Список цитированной литературы. Работа изложена на 320 страницах, содержит 72 таблицы, 18 рисунков и 8 схем. Список литературы включает 295 цитируемых работ.
Автор выражает признательность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН к.х.н. Иванчиной Н.В., к.х.н. Левиной Э.В., Андриященко П.В., к.х.н. Пономаренко Л.П. - за помощь в работе и проведении ряда химических экспериментов, к.х.н. Калиновскому А.И., Дмитренку П.С, к.х.н. Елькину Ю.Н., к.х.н. Ильину С.Г. - за получение и помощь в обработке спектральных данных.
Автор благодарит сотрудников ТИБОХ ДВО РАН к.б.н. Горшкову И.А., к.б.н. Горшкова Б.А., к.х.н. Федорова С.Н., к.х.н. Сова В.В., к.х.н. Бурцеву Ю.В., к.б.н. Прокофьеву Н.Г., Чайкину Е.Л., к.б.н. Аминина Д.Л., к.б.н. Агафонову И.Г., Лихацкую Г.Н., Шенцову Е.Б. за проведение изучения физиологической активности соединений, а также к.б.н. Смирнова А.В., к.б.н. Грузова Е.Н. (ЗИН РАН, г. Санкт-Петербург), к.б.н. Даутова С.Ш., к.б.н. Яковлева Ю.М. (ИБМ ДВО РАН, г. Владивосток), определивших видовую принадлежность изученных морских звезд.
Постоянно используемые сокращения:
Хроматография: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ТСХ - тонкослойная хроматография на пластинках с закрепленным слоем; ГЖХ - газо-жидкостная хроматография;
Масс-спектрометрия: FABMS - Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry - масс-спектрометрия с ионизацией быстрыми атомами; LSIMS - Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry - масс-спектрометрия с ионизацией ускоренными ионами цезия; ESIMS -Electrospray Ionization Mass Spectrometry - электроспрей-ионизационная масс-спектрометрия; EIMS - Electron Ionization Mass Spectrometry - масс-спектрометрия с ионизацией электронами; MALDI/TOFMS - Matrix-Assisted Lazer Desorbtion/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry - масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией, усиленной матрицей.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса:
ЯМР - ядерный магнитный резонанс;
ХС - химический сдвиг;
КССВ - константа спин-спинового взаимодействия;
ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера; с - синглет; д - дублет; т - триплет; к - квартет; дд - дублет дублетов; м — мультиплет; ш — широкий. COSY - Correlated Spectroscopy - корреляционная спектроскопия; DEPT - Distortionless Enchancement by Polarization Transfer - неискаженное усиление переносом поляризации; НМВС - Heteronuclear Multiple Bond Connectivity - гетероядерная многополосная корреляция; HMQC - Heteronuclear Multiple Quantum Connectivity - гетероядерная многоквантовая корреляция.
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Основные типы стероидных соединений морских звезд
Морские звезды отличаются от любых других животных большим разнообразием стероидных соединений. В них присутствуют различные группы этих соединений: гормоны, стерины, сульфаты, диолы, полигидроксистероиды, стероидные моно- и биозиды, а также олигогликозиды. В структурном плане половые гормоны морских звезд (эстрадиол, прогестерон и другие) идентичны гормонам высших животных и человека. Гормоны и стерины из морских звезд известны с 60-х годов прошлого века и относительно хорошо изучены [4]. Стерины морских звезд, в отличие от зоо- и фитостеринов наземного происхождения, являются в основном не 5(6)-, а 7(8)-ненасыщенными производными (А7 стеринами), в то же время структуры боковых цепей у стеринов морских звезд и стеринов наземных животных и растений часто, но не всегда совпадают. Стерины морских звезд являются биогенетическими предшественниками других, в том числе полярных стероидных соединений этих животных. Изучение полярных (часто водорастворимых) стероидных соединений морских звезд началось значительно позже, чем соответствующих стеринов. К полярным стероидам мы относим окисленные соединения, имеющие три или более атома кислорода, а также стероидные сульфаты, фосфаты и гликозиды стероидных агликонов. Оригинальность и структурное разнообразие этих соединений в морских звездах кажутся неисчерпаемыми и привлекают постоянное внимание химиков к этой области научных исследований. Среди полярных стероидов морских звезд выделяются две большие группы соединений: полигидроксистероиды и стероидные гликозиды. Стероидные гликозиды, в свою очередь, принято разделять на три основных структурных типа: 1) астеросапонины первого структурного типа (олигозиды, в состав которых входят пять - шесть моносахаридных остатков), 2) астеросапонины второго структурного типа (циклические гликозиды) и 3) гликозиды полигидроксистероидов (моно- и биозиды) [5]. За последние десять лет в научной литературе появилось несколько хороших обзоров, в которых в той или иной степени обобщались сведения о стероидных соединениях из морских звезд [6-10]. В настоящем литературном обзоре мы рассматриваем не только структуры стероидов морских звезд и их физиологическую активность, но также биогенез и биологические функции этих соединений. Стерины (стероидные моноспирты) иглокожих впервые были изучены американским ученым Бергманом в начале 60-х годов прошлого века [11]. Он установил, что в состав фракций свободных стеринов морских звезд и голотурий входят, в основном, А7 стерины, тогда как три других класса иглокожих (морские ежи, морские лилии и офиуры) содержат, преимущественно, А5 стерины.
Позже этот вывод подтвердили Гупта и Шоер [12] и ряд других ученых. Наряду с А7 стеринами в этих фракциях в морских звездах присутствуют также и другие группы стеринов. Типы стероидных ядер и боковых цепей стеринов морских звезд приведены на рис. 2. Довольно часто в морских звездах встречаются стерины с насыщенным стероидным ядром (станолы), такие как 5а-холестанол (За), 24-метил-5а-холестанол (3d), 24-этил-5а-холестанол (3h). Предполагается, что присутствие такого рода веществ обусловлено, во-первых, их участием в биотрансформациях А5 стеринов в А7 производные в качестве промежуточных веществ. Во-вторых, эти соединения, очевидно, поступают в организм морских звезд с пищей, причем С27 соединения - в основном из моллюсков, а Сг8 и С29 стерины — из детрита, представляющего собой главным образом остатки отмерших пелагических организмов, в первую очередь микроводорослей, трансформированных бактериями. Известно, что на больших глубинах существуют восстановительные условия, способствующие превращению А5 стеринов в станолы [13]. Поэтому в стериновых фракциях глубоководных видов морских звезд можно ожидать большого содержания станолов. Сложность стериновых фракций морских звезд увеличивается из-за присутствия в них в небольших количествах А5 соединений. Например, Echinaster sepositus содержит 4% холестерина (1а) [14], a Euretaster ins ignis - 6% А5 стеринов [15]. Ряд стеринов морских звезд имеют необычные боковые цепи, не характерные для стеринов наземного происхождения. Они или имеют более длинные, чем в наземных фитостеринах, алкильные ответвления, присоединенные к С-24, как в боковых цепях т-р, или наоборот - деалкилированнные боковые цепи 24-нор- и 27-нор-типов (q и г). Находят в морских звездах и стерины с циклопропановоми фрагментами в боковых цепях (s и t типы боковых цепей). Эти соединения имеют, как считается, эндогенное происхождение и являются либо пищевыми стеринами, либо продуктами биотрансформации последних в самих морских звездах. Кроме того, в морских звездах обнаружены также незначительные количества 4,4-диметил- и 4-монометилстеринов, являющихся предшественниками остальных стеринов в биосинтезе de novo. Так, в Asterias rubens идентифицированы: циклоартанол (4) и циклоартенол (5), а также 4,4-диметил-5а-холест-7-ен-Зр-ол (6), ланостерин (7), 4,4-диметил-5а-холеста-8,24-диен-ЗР-ол (8), 4,4-диметил-5а-холеста-7,24-диен-3(3-ол (9), 31-норциклоартанол (10), 4а-метил-5а-холест-7-ен-ЗР-ол (11), 4а-метил-5а-холеста-7,24-диен-ЗР-ол (12) (см. стр. 20, 21) [16]. Кроме свободных стеринов морские звезды содержат их сульфатные эфиры (сульфаты). Причем сульфаты стеринов присутствуют в морских звездах в концентрациях, сравнимых с концентрациями свободных стеринов.
Процентное содержание тех или иных стеринов во фракциях свободных стеринов и их сульфатов не одинаково. Фракция свободных стеринов обычно обогащена Д соединениями, особенно 5а-холест-7-ен-Зр-олом (2а) и его гомологами (2d и 2h). А среди сульфатов преобладают А5 стерйны, в частности, сульфат холестерина (13), и сульфат 5а-холестанола (14) [17]. Одной из особенностей биохимии морских звезд является то, что большая часть Сц стеринов в них находится в сульфатированном виде (табл. 1) [17]. В настоящее время изучен стериновый состав более чем тридцати видов морских звезд. Однако полученные данные следует считать надежными не для всех изученных видов, так как часто исследователи ограничивались идентификацией стеринов только с помощью ГЖХ, что чревато ошибками, особенно применительно к таким сложным смесям, как суммы стеринов из морских звезд. Применение современных методов анализа стериновых смесей, включая ГЖХ с использованием эффективных капиллярных колонок и ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией открывают новые перспективы в области исследования стеринов морских звезд. Биологическая активность стеринов морских звезд мало изучена. Недавно корейские исследователи показали, что основной компонент фракции свободных стеринов, соединение 2а, обладает антигенотоксичными и антимутагенными свойствами [18]. Стериновые суммы из морских звезд включают компоненты, биосинтезируемые de novo, пищевые стерины и стерины пищевого происхождения, биотрансформированные в организме этих животных. Таким образом, стериновый состав каждого конкретного вида зависит: от интенсивности биосинтеза стеринов de novo из ацетил-коэнзима А и мевалоновой кислоты; от состава стеринов пищи и избирательности, с которой животные накапливают отдельные соединения из пищевых смесей; от способности модифицировать пищевые стерины. Биосинтез стеринов de novo был изучен в морских звездах довольно подробно. Впервые его исследовали Смит и Гоад, вводя меченый [14С]мевалонат в цел омическую полость Asterias rubens и Henricia sanguinolenta [19]. Позже тщательные повторные исследования с морской звездой Asterias rubens позволили предложить основные пути биосинтеза de novo обычно преобладающего в морских звездах стерина 5а-холест-7-ен-Зр-ола (2а) (схема 1, стр. 21) [20]. После введения [ С]мевалоната высокое включение радиоактивной метки наблюдалось в сквалене (15) и 4,4-диметилстеринах (6-9), значительно более низкое - в 2а и 5а-холеста-7,24-диен-Зр-оле (2Ь). Дигидроланостерин (16) и 4,4-диметил-5а-холест-8-ен-ЗР-ол (17) не были идентифицированы в этой морской звезде. Предполагается, что восстановление А24 связи может протекать на стадии образования 4-монометил-стерина или на последней стадии биосинтеза. Включение метки не было зарегистрировано в 9р,19-циклопропанстерины: циклоартанол (4), циклоартенол (5) и 31-нор-циклоартанол (10). Скорее всего, они поступают в морские звезды через пищевую цепь из водорослей, где являются предшественниками фитостеринов, и в биосинтезе А7 соединений не участвуют.
Моно- и биозиды полигидроксистероидов
Наряду со свободными полигидроксистероидами в морских звездах присутствуют гликозиды полигидроксистероидов, которые чаще всего являются моно- и биозидами. Эти соединения весьма разнообразны по строению и могут быть сульфатированы по агликону или углеводной цепи. Все выделенные гликозиды этого типа можно разделить на три структурных группы: 1) наиболее распространенные - гликозилированные по боковой цепи агликона (например, нодосозид (59) из Protoreaster nodosus [39]); 2) имеющие углеводный фрагмент, присоединенный к С-3 агликона (например, монилозид С (60) из Fromia monilis [59]) и 3) имеющие углеводные фрагменты, присоединенные одновременно к боковой цепи и стероидному ядру агликона (например, гранулатозид А (61) из Choriaster granulatus [60]). В соединениях, гликозилированных по боковой цепи, углеводный фрагмент присоединен к атомам С-24 или С-26 - в холестановых, С-28 или С-26 - в эргостановых, С-29 или С-26 - в стигмастановых производных. Моносахаридными компонентами чаще всего являются ксилопираноза, ее различные метилированные производные, и арабинофураноза. Реже в качестве углеводных остатков встречаются также ксилофураноза, галактофураноза, фукофураноза, глюкопираноза и арабинопираноза. Углеводные фрагменты гликозидов полигидроксистероидов могут быть не только метилированы, но и сульфатированы по самым разным положениям [6,7]. В биозидах моносахариды чаще всего связаны между собой 1,2-связью. Очень редко в гликозидах полигидроксистероидов встречается фосфатная группа. Так, в глубоководной морской звезде Tremaster novaecaledoniae наряду с фосфатированным триодом 23 найдены тремастеролы А, В и С (62-64), в которых к фосфатной группе при С-3 агликона присоединена глюкопираноза [61]. Довольно необычным для гликозидов стероидных полиолов является присутствие в молекулах 62-64 ацетатных групп. Необычным химическим строением отличаются хеффернанозиды А, В и С (87-89) из Celerina hejfетапі [9]. В отличие от большинства биозидов стероидных полиолов моносахаридные остатки в 87-89 соединены (1—»4), а не (1-»2) гликозидной связью.
В качестве концевого моносахаридного остатка эти соединения содержат редко встречающуюся арабинопиранозу. Недавно из двух видов морских звезд было выделено шесть новых двухцепочечных гликозидов стероидных полиолов, гликозилированных одновременно по боковой цепи и по С-3 стероидного агликона. Например, в имеющих ксилозный остаток в положении 3 астериидозидах F и G (90, 91) из антарктической морской звезды семейства Asteriidae вторая ксилоза присоединена к С-26, а в близких по структуре астериидозидах Н и I (92, 93) З-О-сульфоксилопиранозный фрагмент присоединен к С-24 боковой цепи агликона [64]. Большинство низкомолекулярных гликозидов из морских звезд -холестановые производные. Однако линкозиды А и В (94, 95) из Linckia laevigata относятся к производным стигмастанового ряда [65]. В антарктической морской звезде из семейства Asteriidae был обнаружен также астериидозид L (96), принадлежащй к другой группе гликозидов полигидроксистероидов - гликозилированных только по С-3 стероидного ядра [64]. Близкие по строению сангуинозиды А и В (97, 98) были недавно найдены в двух дальневосточных видах Henricia sanguinolenta и Henricia leviuscula leviuscula [66]. Соединение 97 является первым стероидным гликозидом из морских звезд с 24-пропилхолестановой боковой цепью. Несмотря на то, что полигидроксистероиды и родственные им гликозиды известны уже более двадцати лет, биологические функции и биосинтез этих соединений до сих пор не изучался. Известно, что большинство Д стеринов морских звезд, а именно С28 и Сзо соединения, не биосинтезируются в организме этих животных de novo, а являются продуктами биотрансформации соответствующих пищевых А5 стеринов (см. раздел 2.2.1.). На этом основании можно полагать, что полиокисленные стероидные соединения, среди которых встречаются С26, С27, С28, С29 и даже С3о производные, образуются в морских звездах из пищевых Д5 стеринов, возможно, с включением в этот процесс и какой-то части собственных Д стеринов. Разнообразие полиокисленных стероидных соединений, найденных в морских звездах, очевидно, связано с присутствием в этих животных большого набора окисляющих и гликозилирующих ферментов, сравнимого только с разнообразием стероидокисляющих ферментов в микроорганизмах и гликозилтрансфераз в высших наземных растениях. Характерной чертой биогенеза полигидроксистероидов и родственных гликозидов в морских звездах является сульфатирование образующихся продуктов в самые разные положения.
Астеросапонины Стероидные гликозиды являются типичными метаболитами высших растений. Они мало распространены в животном царстве. На протяжении последних 30 лет стероидные гликозиды были найдены в большинстве изученных видов морских звезд и совсем недавно в губках, кишечнополостных и рыбах рода Pardachirus. Стероидные гликозиды морского происхождения выделяются оригинальностью строения. Они самым существенным образом отличаются своими структурами от сапонинов наземных растений. Наряду с гликозидами полигидроксистероидов в морских звездах существуют еще две группы стероидных гликозидов: астеросапонины первого структурного типа и астеросапонины второго структурного типа (циклические гликозиды). Наиболее широко в морских звездах распространены астеросапонины первого структурного типа, так называемые "классические" астеросапонины. Для них характерно наличие Зр\6а-диольной группировки и Д9(П)-связи в стероидном ядре, причем к С-3 агликона присоединена сульфатная группа, а к С-6 агликона -олигосахаридная цепь из пяти - шести моносахаридных остатков. Впервые полная структура такого гликозида была определена в 1978 году для торнастерозида А (99) из морской звезды Acanthaster planci, известной также под названием «терновый венец» [67]. Позже соединение 99 было выделено из более чем 20 различных видов морских звезд. Астеросапонины второго структурного типа имеют агликон с 7(8)-ненасыщенным Зр,бр-дигидроксистероидным ядром и циклическую углеводную цепь из трех моносахаридных остатков, которая присоединена гликозидной связью к С-3, а простой эфирной связью - к С-6 агликона. Макроциклическое кольцо этих соединений по строению напоминает краун-эфир, его размер позволяет удерживать ион Na+ (в качестве примера приведена формула сепозитозида А (100)). Циклические астеросапонины были обнаружены только в двух видах морских звезд, принадлежащих к одному роду, Echinaster sepositus и Echinaster luzonicus [68, 69]. Когда были изучены еще два родственных вида - Echinaster brasiliensis и неидентифицированный антарктический вид из семейства Echinasteridae, оказалось, что циклические гликозиды в них полностью отсутствуют [70, 71]. Таким образом, гипотеза о присутствии циклических гликозидов во всех видах данного семейства не подтвердилась.
Биологические функции астеросапонинов
Как следует из предыдущей главы, астеросапонины проявляют токсические свойства по отношению ко многим морским организмам, включая рыб, а также препятствуют обрастанию водорослями, личинкам ракообразных и мшанок. Маки нашел довольно высокое содержание их в эпидермисе и амбулакральных ножках морских звезд, что дало основание предполагать их участие в химической защите этих животных от хищников, паразитов и микроорганизмов [33]. Исследование распределения астеросапонинов в различных органах и тканях Asterias rubens и Leptasterias polaris дополнительно подтвердило это предположение [122, 142]. Интересно, что защитную биологическую функцию осуществляют в морских звездах не только "классические" астеросапонины, но и более низкомолекулярные полярные стероиды. Так, этанольный экстракт Henricia downeyae, содержащий гликозиды глюкуроновой кислоты - даунеозиды, проявил ингибирующее действие в отношении морских бактерий и грибов, антиобрастательные и отпугивающие свойства [109]. Гликозиды полигидроксистероидов из Acodontaster conspicuus ингибировали рост колоний морских бактерий [47]. Позже было установлено, что астеросапонины являются защитными веществами не только для взрослых особей морских звезд, но и на ранних стадиях развития животных. Эти вещества отпугивают планктоноядных рыб и крабов от эмбрионов морских звезд [143, 144]. Было показано, что добавление в содержащие пищу агаровые и каррагинановые шарики этанольных экстрактов морских звезд делало их несъедобными для рыб [44, 115, 144]. Морские животные, являющиеся добычей морских звезд, например двустворчатые и брюхоногие моллюски, реагируют на присутствие морских звезд, проявляя так называемую "реакцию убегания". Эта реакция помогает жертве, имеющей соответствующие хеморецепторы, избежать приближения хищника. Во многих случаях причиной необычного поведения этих морских беспозвоночных являются секретируемые в воду астеросапонины [113, 114]. Например, мартастерозид В (180) из Marthasterias glacialis вызывает "реакцию убегания" у о брюхоногого моллюска Buccinum undatum в концентрации ниже 10" М [114]. Подобное поведение может быть вызвано также и более низкомолекулярными соединениями.
Причиной "реакции убегания" морского ежа Strongylocentrotus nudus, вызванной морской звездой Plazaster borealis, была натриевая соль 3,6-0-дисульфо-(235)-5а-холест-9(11)-ен-Зр\6а,23-триола (129) [145]. Таким образом, кроме защитной роли, некоторые полярные стероиды выполняют роль алломонов, соединений, регулирующих отношения этих животных с другими представителями морских биоценозов. Одним из подходов по установлению возможной функциональной роли природных соединений являются исследования сезонных изменений содержания этих соединений в животных-продуцентах. В результате таких исследований была установлена еще одна биологическая функция астеросапонинов: регуляция икрометания у морских звезд. Изучая функции астеросапонинов, содержащихся в гонадах Asterias amurensis, Икегами с сотрудниками обнаружили высокий уровень этих соединений летом и понижение их концентрации перед нерестом зимой [146, 147]. Было показано, что астеросапонины А и В ингибируют созревание ооцитов, понижая при этом выделение фолликул стимулирующего гормона - 1-метиладенина фолликулярными клетками [146]. Этот вывод согласовывался с наблюдениями Ясумото [148], показавшего понижение концентрации астеросапонинов в гонадах Asterias amurensis во время нереста. Икрометание инициируется освобождением из радиального нерва гонад-стимулирующего соединения (ГСС) - полипептида из двадцати двух аминокислотных остатков [149]. ГСС способствует выделению 1-метиладенина в фолликулярных клетках [150-152]. В свою очередь это соединение вызывает созревание ооцитов, а также растворение фолликулярной оболочки и связывающего вещества, окружающего ооциты. После этого следует процесс икрометания, когда стенки гонад сокращаются и выдавливают ооциты в окружающую среду. Предполагается, что астеросапонины А и В действуют на фолликулярные клетки, задерживая выделение 1-метиладенина. Созревание изолированных ооцитов в растворах 1-метиладенина ими не ингибируется [146, 147]. Необходимо отметить, что ингибирующее действие не связано с поверхностно-активными свойствами астеросапонинов, поскольку экспериментально доказано, что другие поверхностно-активные вещества (ПАВ), например, голотурии, не в состоянии ингибировать икрометание [147]. Уно и Хоши обнаружили, что гликозид, подобный астеросапонину А, из яичного геля Asterias amurensis вызывает агглютинацию спермы во время оплодотворения [153].
Это означает, что после того, как 1-метиладенин выделен фолликулярными клетками, астеросапонины скорее стимулируют репродуктивный процесс, чем подавляют его. Свойство ингибировать икрометание было показано только для гликозидов Asterias amurensis. В то же время в Asterina pectinifera подобное действие на процесс икрометания оказывала L-глутаминовая кислота [154, 155]. В гонадах Marthasterias glacialis был обнаружен высокий уровень астеросапонинов в течение всего периода размножения [33]. Из чего был сделан вывод о том, что астеросапонины являются ингибиторами икрометания не во всех видах морских звезд. В гонадах Asterias rubens содержание астеросапонинов было низким летом и высоким зимой в течение всего периода размножения вплоть до икрометания [156]. Несмотря на эти наблюдения, было сделано предположение, что регулирующая роль астеросапонинов в созревании ооцитов не может быть исключена для данного вида морских звезд. Исследование Asterias vulgaris показало, что максимальный уровень астеросапонинов наблюдался непосредственно перед нерестом животных [89, 157]. Полученные данные свидетельствовали о том, что астеросапонины не могут быть ингибиторами икрометания в этом виде морских звезд, но их регулирующая роль в процессах гаметогенеза вполне возможна. Таким образом, для отдельных видов морских звезд было установлено, что астеросапонины принимают участие в регуляции гаметогенеза и могут ингибировать созревание ооцитов. В настоящее время структурные исследования полиокисленных стероидных соединений морских звезд развиваются очень быстро, значительно опережая соответствующие биологические исследования. Следует подчеркнуть, что изучение биологической роли проводилось ранее, в основном, для "классических" астеросапонинов из некоторых видов морских звезд. Биологические функции полигидроксистероидов и так называемых низкомолекулярных гликозидов оставались невыясненными. 2.3. Оксигеназы морских звезд Разнообразие окисленных стероидных соединений в морских звездах предполагает наличие широкого набора окисляющих ферментов у этих животных. Известно, что одной из основных природных функций цитохрома Р450 является участие в метаболизме эндогенных субстратов, таких как стероиды. Долгое время в литературе не было никаких сведений о присутствии подобных ферментов в морских звездах, за исключением отдельных сообщений, связанных с цитохром Р450-зависимым метаболизмом стероидных соединений. Например, в морской звезде Asterias rubens наблюдали превращение радиоактивно меченого холестерина в прегненолон, которое у млекопитающих является Р450-цитохром зависимым [158]. В этой же морской звезде было обнаружено образование 17а-гидрокси-метаболитов из прегненолона и прогестерона, предположительно катализируемое цитохромом Р450 [159, 160].
Исследование фрагментации в масс-спектрах полигидрокси- стероидных соединений из Patiria (= Asterina) pectinifera
С целью установления закономерностей распада полигидроксистероидных соединений было проведено углубленное исследование EI масс-спектров высокого разрешения, полученных из Patiria pectinifera веществ: гексаола 196, гептаола 183, октаола 184, астеросапонина Pi (182), десульфатированных гликозидов 182а и 185а [200]. Основные пути распада этих соединений даны на схеме 7, а массовые числа ионов и относительные интенсивности пиков приведены в Экспериментальной части. Спектры гексаола 196 и гептаола 183 содержали мало интенсивные пики молекулярных ионов, а в спектрах октаола 184 и гликозида 185а таких пиков не было, но наблюдались пики ионов [М-Н20]+. Наибольший по массовому числу пик в спектре десульфатированного гликозида 182а соответствовал иону [М-2НгО]+. В условиях снятия масс-спектров соединение 182 подвергалось, вероятно, термической деструкции и давало пик иона [M-NaHS04-4H20]+. Во всех спектрах прослеживались сигналы, соответствующие продуктам последовательной дегидратации М+, вплоть до образования углеводородных фрагментов. Присутствие диольных и триольных группировок в стероидном ядре обусловливало ряд направлений распада стероидного скелета, менее выраженных у стероидов с меньшим числом гидроксигрупп. Некоторые пути распада полигидроксипроизводных являются общими для различных стероидов с боковой цепью из восьми - десяти атомов углерода. Наиболее универсальным свойством спектров этих соединений является разрыв связи С-17 - С-20 (ионы Б), который наблюдался у стероидных углеводородов, спиртов ряда холестена и фитоэкдистероидов [201]. Особенности протекания этого процесса у полигидроксистероидов морских звезд заключались в том, что наряду с простым разрывом связи С-17 - С-20 имела место перегруппировка с переносом атомов водорода, причем у свободных полигидроксистероидов 196, 183, 184 и гликозида 185а миграция протона была направлена в сторону заряженного фрагмента, и вклад соответствующих ионов рос с увеличением числа гидроксигрупп в исходной молекуле. У десульфатированного производного 182а перемещение водорода происходило, напротив, в сторону нейтрального осколка. Поскольку перенос водородов протекал, как правило, к более ненасыщенной части иона, то из этого следовало, что у соединений 196, 183, 184 и 185а вначале происходила преимущественно дегидратация стероидного ядра, а у гликозида 182а - углеводного звена.
Вследствие термолабильности сульфата 182 рассматриваемый процесс происходил вслед за дегидратацией стероидного ядра, а наибольший по интенсивности пик иона типа Б имел углеводородный состав СідН2з. Другим важным направлением фрагментации соединений с холестановым или стигмастановым скелетами является разрыв связи С-20 - С-22 (ионы А). В спектрах гексаола 196, гептаола 183 и гликозида 185а пики ионов А мало уступали по интенсивности ионам Б. В остальных спектрах вклад этого процесса был менее заметен, хотя у сульфата 182 пик иона А с m/z 277 (С21Н25), образованного с дополнительной потерей молекулы водорода, являлся вторым по интенсивности в средней части спектра. Наиболее характерным для масс-спектров многих стероидов является разрыв связей С-13 - С-17 и С-14 - С-15 кольца D [201]. Во всех рассматриваемых спектрах, кроме спектра октаола 183, данный процесс был представлен пиками средней интенсивности (ионы Г). У полигидроксистероидов 196, 183 и десульфатированных гликозидов 182а, 185а он сопровождался переносом водородов в заряженный фрагмент с m/z 249 (196, 182а, 185а), 247 (183), а у сульфата 182 стабилизация осколка этого ряда наступала лишь с удалением трех молекул воды и сверх того ароматизацией колец А - С (m/z 209). Соединения, не содержащие гидроксигруппы при С-4 и С-7, показывали заметные пики ионов ряда С5 (Д) m/z 251 (196, 182а, 185а) и 197 (182), образующихся путем разрыва связей колец С и D. Эти же соединения давали ионы ряда Сп (В), образованные путем разрыва связей С-15 - С-16 и С-13 - С-17. Очень важен с аналитической точки зрения разрыв связей в кольце С, а именно: С-8 - С-14 и С-12 - С-13, дававший пики ионов Ж и Е средней и высокой интенсивности. Главной причиной их устойчивости, очевидно, служило присутствие гидроксильной группы при С-8, водород которой участвовал в перегруппировке: Роль этого процесса сохранялась при фрагментации гликозидов 182а и 185а, но по разным причинам уменьшалась для гликозида 182 и октаола 183. Что касается последнего соединения, то это можно объяснить увеличением доли разрывов колец А и В из-за присутствия дополнительных гидроксигрупп. Эта особенность спектров гептаола 183 и октаола 184 видна из данных схемы 7. Общим свойством изученных соединений являлся распад кольца В по связям С-5 - С-6 и С-9 - С-10 со стабилизацией заряда на кольце А (ионы Т). Октаол 184 образовывал при этом ион с m/z 129, а все остальные соединения, не содержащие гидроксигруппу при С-4, давали фрагменты с m/z 95 очень высокой интенсивности. Другие пути распада колец А и В были мало характерны для гликозидов 182, 182а, 185а, но прослеживались в спектрах полиолов 196, 183, 184. Они состояли в отрыве цепей из 5-9 углеродных атомов. Спектры стероидов 196, 182а, 185а содержали пик иона с m/z 352 невысокой интенсивности состава С2іН3б04. Очевидно, он образовывался в результате разрыва типа П. Гидроксигруппа при С-7 способствовала тому, что в спектрах гептаола 183 и октаола 184 появлялась пара ионов И и К, образующихся при разрыве связей С-7 -С-8 и С-9 - С-10.
Опознанию ионов К, помимо высокой интенсивности пиков, способствовали их четные массовые числа. С увеличением числа гидроксигрупп в ряду соединений 196, 183, 184 увеличивался вклад ионов [М-Н20]+. Наибольшие трудности представляла интерпретация процессов отрыва цепи из пяти углеродных атомов. К ионам С22 могут вести, по крайней мере, два процесса. Один из них представлен фрагментами с m/z 366 (183) и 364 (184). В структуре этих ионов должен быть сохранен различающий элемент - атом С-4. Если исключить менее вероятный отрыв части кольца С, то остается единственный вариант образования данных фрагментов - по типу Р, хотя для этого должна произойти миграция трех протонов в заряженный осколок. Наряду с указанными ионами в обоих спектрах наблюдались ионы С22 с совпадающими массами - 365 и 363. Образование таких ионов было возможно в результате трех вариантов удаления пятиуглеродной цепи: Ряд особенностей масс-спектров гликозидов 182, 182а, 185а был обусловлен присутствием арабинофуранозного цикла. При отсутствии сульфата он распадался в 182а и 185а по двум направлениям (ионы Ш и Щ). Ионы типа Ш были ранее обнаружены в спектрах неэтерифицированных пиранозидов с агликонами различной природы [202]. У 3-0-метиларабинозида 182а были достаточно стабильны ионы этой серии, образующиеся с миграцией водорода как к заряженному, так и нейтральному фрагменту (m/z 463 и 479). В спектре гликозида 185а ионы [Ш-Н]+ были малозаметны. Разрыв типа Щ мало характерен для пиранозидов. У гликозида 182а совпадали массовые числа ионов серий Ц и Щ, однако они имели разный элементный состав, благодаря чему их было можно различить. Во всех трех спектрах гликозидов были мало стабильны ионы состава (Agl-OH) и (Agl - остаток агликона). Устойчивость этих фрагментов возрастала после потери ими молекул воды, причем у гликозида 182 относительно стабильным являлся ион [Agl-OH-3H20]+. В результате отрыва фуранозного цикла возникали также фрагменты [Agl]+ либо [AglO]+. Первые, вероятно, служат предшественниками ионов У (разрыв С-22 - С-23) и X (разрыв С-24 - С-25), а вторые могут порождать ионы типа Ч (182а). Что касается разрыва С-23 - С-24, то он был менее характеристичен. У гликозида 182а присутствовал ион Ф, а у сульфата 182 - ион Э. В спектрах гликозидов холестанового ряда 182 и 182а имелся интенсивный пик фрагмента m/z 129 состава С7Н13О2. Предполагается, что он возникает из ионов типа Ш при последующем разрыве связи С-20 - С-22 и замыкании образовавшегося осколка: в 1,3-диоксановый цикл (схема 7). В спектре стигмастанового производного 185а подобный фрагмент отсутствовал. В области пиков ионов с m/z 129-95 в спектрах гликозидов 182, 182а и 185а присутствовал целый ряд и других пиков большой интенсивности, которые вероятнее всего были образованы элементами боковой цепи после удаления от нее моносахаридного остатка.
