Содержание к диссертации
Введение
1. Пожпептидные токсины селективного действия из яда членистоногих 6
1.1. Токсины селективного действия из яда скорпионов 8
1.2. Инсектотоксины из ядов пауков и многоножек 31
1.3. Инсектотоксины из яда перепончатокрылых 42
2. Исследование полипептидных токсинов из ядов скорпиона и тарантула 48
2.1. Выделение и характеристика токсических компонентов из яда кавказского скорпиона Buthus eupeus 50
2.2. Исследование структуры инсектотоксинов И5 и И^А из яда кавказского скорпиона Buthus eupeus 58
2.З. Исследование токсического компонента яда южно-русского тарантула Lycosa singoriensis 77
3. Экспериментальная часть 84
Выводы 96
- Инсектотоксины из ядов пауков и многоножек
- Инсектотоксины из яда перепончатокрылых
- Исследование структуры инсектотоксинов И5 и И^А из яда кавказского скорпиона Buthus eupeus
- Исследование токсического компонента яда южно-русского тарантула Lycosa singoriensis
Введение к работе
Одной из центральных проблем современной физико-химической биологии является выяснение молекулярных механизмов транспорта ионов через клеточные мембраны. Особый интерес вызывают ионные каналы, играющие важнейшую роль в процессах нервного возбуждения, мышечного сокращения и т.д. Для исследования ионных каналов широко применяются различные фармакологические средства и, в первую очередь, уникальные биорегуляторы - природные токсины, способные нарушать нормальную работу этих мембранных транспортных систем. Так, с помощью нейротоксинов яда кобр осуществлен детальный анализ рецепторов ацетилхолина, ответственных за формирование и функционирование ионных каналов постсинаптической мембраны. Нейротоксины из яда скорпионов, а также тетродотоксин и батрахотоксин оказались незаменимыми при изучении молекулярной организации быстрых натриевых каналов электровозбудимых мембран. Следует особо отметить, что в ряде случаев природные токсины являются единственным надежным средством идентификации и исследования ионных каналов как в электрофизиологических, так и в биохимических экспериментах. Поэтому поиск новых токсинов представляется весьма актуальной задачей, поскольку позволяет получить эффективные молекулярные инструменты исследования функционально важных компонентов клеточных мембран.
Настоящая работа является частью исследований проводимых в ИБХ им. М.М.Шемякина АН СССР по изучению природных токсинов и использованию их для исследования компонентов возбудимых мембран. Она посвящена разработке метода выделения индивидуальных нейротоксинов из яда кавказского подвида скорпиона Buthus eupeus , который значительно отличается по своему составу от
ранее охарактеризованного яда среднеазиатского подвида этого скорпиона. Кроме того, в задачу работы входило исследование структуры инсектотоксинов яда в. eupeus , а также выделение токсина из яда тарантула Lycosa aLngcriensis и изучение его механизма действия.
В литературном обзоре рассмотрены вопросы, связанные с выделением, установлением структуры и изучением механизмов действия инсектотоксинов из ядов членистоногих.
Автор выражает глубокую признательность академику Ю.А.Овчинникову за постоянное внимание к данной работе, а также старшему научному сотруднику, кандидату химических наук Е.В.Гришину за ценные советы и помощь в проведении экспериментов.
Инсектотоксины из ядов пауков и многоножек
Большой интерес исследователей привлекает яд пауков рода Latrodectus , который обладает очень сильным пресинаптическим действием на позвоночных и беспозвоночных, в том числе и насекомых /64,65,66/. Еще в 1965 году Еери и сотр. /67/ показали, что цельный яд L. mactans tredecimguttatus действует на тараканов (ш,50 2,7 мг/кг), причем он блокирует передачу нервного импульса в различных препаратах нервной системы таракана p. americana /68/. Гриффите и Смит /69/ обнаружили, что яд L. m. tredecimguttatus блокирует нервно-мышечную передачу возбуждения и ингибирования у этих насекомых, при этом сначала вызывая массированный выброс медиатора, а затем полный блок синап-тической передачи.Препарат яда вызывает остановку сердца P. americana за счет воздействия на сердечные нервные ганглии /70/. Фронтали и Грассо /71/ исследовали нейротоксическое действие яда L. m. tredecimguttatus на домашних мух (Е$5о »6 мг/кг). Важно отметить тот факт, что механизм действия яда пауков рода Latrodectus на различных животных: млекопитаюіцих, ракообразных, насекомых одинаков. Это объясняется тем, что под влиянием яда происходит выброс медиатора из холинэргических, адренэргических и аминэргических синапсов. При действии яда на насекомых истощаются запасы глутамата в пресинаптических везикулах /72/. С помощью гель-хроматографии и ионообменной хроматографии Грассо /73/ выделил из яда ъ.т. tredecimguttatus белковый токсин молекулярного веса 130.000, который вызывал выброс норэпи-нефрина из синаптосом мозга крыс. Орнберг и сотр. /74/ в 1976 году методом препаративного электрофореза в полиакриламидном геле разделили яд ь. mactans на II белковых фракций. Среди них нашли нейротоксин для насекомых с молекулярным весом 125.000, который вызывал паралич у тараканов. Этот токсин, как и цельный яд паука увеличивает частоту спонтанных миниатюрных потенциалов, вследствие высвобождения глутамата из нервного окончания. В работе Фронтали /75/ исследовали фракции, полученные гель-хроматографией на сефадексе G -200 (рис.7а). Оказалось, что фракция В содержит токсин для мышей о(-латротоксин (М 130.000). Во фракции Е идентифицировали токсин для ракообразных (М 65.000). Из фракции С удалось выделить инсектотоксин (рис. 7 6), вероятно, идентичный полученному Орнбергом /74/. Таким образом, в: яде этого паутса, как и в ядах скорпионов обнаружены токсины селективного действия на различных животных. Фритц и сотр. /76/ обнаружили, что фракция В действует на лягушек и не активна на ракообразных, а фракция Е - наоборот. Пресинаптический механизм действия всех токсішов такой же, как и у цельного яда. (-Латротоксин выделен в гомогенном виде, что позволяет детально исследовать его взаимодействие с пресинаптической мембраной
По-видимому, данные, полученные в таких исследованиях, могут быть использованы для понимания действия токсинов для ракообразных и для "насекомых, так как все 3 токсина индуцируют в соответствующих препаратах высвббождение нейромедиатора из пресинаптических нервных окончаний. В результате действия латротоксина через 30 мин полностью исчезают синап-тические пузырьки, вследствие нарушения их рецшслизации, причем синтез медиатора не нарушается /77/. На истощение везикулярного аппарата указывает также и то, что высокие концентрации К+ не вызывают высвобождения ацетилхолина. Действие токсина на мембрану 4-5 2+ 22 + сопровождается массированным входом Са и На . В опытах на бислойных фосфолипидных мембранах выявлена способность токсина образовывать потенциалзависимые каналы проницаемости для одно-и двух-валентных катионов /78,79/. Из всего вышесказанного следует, что токсины яда L. mactans могут быть селективными инструментами исследования компонентов пресинаптических мембран разных видов животных. Паук Lithyphantes paykulliana ОТНОСИТСЯ К ТОМУ ЖЄ СЄМЄЙСТ- ву, что и Latrodectus. До 1962 года он считался не ядовитым. В 1968 году появилась первая работа /80/, где описывалось нейро-токсическое действие яда. Яд L. paykulliana, как И яд L.mactans вызывает массированный выброс нейромедиатора из пресинаптических окончаний, резко увеличивая частоту миниатюрных потенциалов концевой пластинки. Этот яд токсичен для позвоночных: лягушек и мышей (LD 50 5,5 мг/кг), для насекомых: тараканов (Е%О 5»2 мг/кг) и саранчи. Причем установлено, что механизм действия яда на нервно-мышечные препараты лягушки и саранчи одинаков. В модельной мембране он образует однородную популяцию каналов для катионов /81/. Ташмухамедовым и сотр. /80/ было проведено фракционирование яда на сефадексе G-I00 (рис.8). При этом было получено 4 фракции, из них:1(М 100.000) - действует пресинаптически только на позвоночных; Ш (М. 30-40.000) - аналогично действует только на синапсы насекомых; ІУ (М 5.000) - эффективен и для лягушки и для саранчи, но имеет длительный латентный период. Все фракции увеличивают интегральную проводимость бислойшх мембран. При ре-хроматографии этих фракций удается отделить компонент молекулярного веса 5.000, который аналогичен фракции ІУ /81,82/. Этот низкомолекулярный компонент обладает каналообразующими свойствами.
Авторы делают вывод, что преситаптические токсины L. paykulliana состоят из крупномолекулярного промотора, обеспечивающего селективное взаимодействие с пресинаптической мембраной синапсов позвоночных или насекомых и низкомолекулярного пептида (М 5.000), являющегося каналоформером. Такую же структуру, вероятно, имеют токсины L. raactans /81,82/. Яд пауков рода Loxosceies очень опасен для животных и человека, он вызывает сильный дермонекроз /83/. В 1976 году Ге ен и сотр. /84/ с помощью гель-хроматографии и препаративного электрофореза выделили из яда L. reolusa 2 белковых токсина (М 34.000). Один из токсинов вызывал некроз у кроликов. В 1981 году некро-токсин выделяли ионообменной хроматографией (М 31-37.000) /85/. Этот токсин будучи летальным для мышей, приводил у кроликов к некрозу, вызывал Са зависимый гемолиз эритроцитов, коагуляцию тромбоцитов. Возможно, что описанный белок не является гомогенным, так как другие авторы /86/ выделили гемолизин молекулярного веса 19.000, обладающий активностью сфингомиелиназы D. фактор, вызывающий агрегацию тромбо-цитов - один и тот же белок. Нормент и Вине он /88/ обнаружили, что яд L. reciusa вызывает лизис жировых и мышечных тканей личинки совки, а позднее /89/ были исследованы морфологические изменения у личинок насекомых под воздействием этого яда. EDgQ яда для домашней мухи в 18 раз меньше, чем для мыши и составляет 0,26 мкг/г /90/, для домашнего сверчка 0,42 мкг/г, для большой восковой моли 0,33 мкг/г /91/. На личинках насекомых показано также наличие в яде протеолитических ферментов /91/. Под действием сублетальных доз яда L. reoluaa глухи через час теряют координацию, через 4 часа их поражает паралич. Фойл и сотр. /90/ разделили яд L. reciusa на сефадексе G-50 на 3 фракции. Высокомолекулярная фракция термолабильна и теряет активность под действием трипсина, глухи под ее действием гибнут через 20-24 часа. Это, видимо, некротоксин для позвоночных, выделенный ранее /84,85/. Во второй фракции содержатся термостабильные белковые компоненты (М 10.000), которые инактивируются трипсином. Под действием этой фракции мухи падают через 30 глин и гибнут через 3-4 часа. Эффект токсических компонентов связан с повышением амплитуды и частоты эндогенной активности брюшного нервного тяжа таракана p.americana /90/. Действует этот токсин в несколько раз сильнее, чем соответствующий компонент из яда L. mactans. Высокомолекулярный и низкомолекулярный токсины обладают синергизмом, причем второй является нейротоксином для насекомых /92/, В настоящее время токсины яда L.reciusa не выделены в чистом виде. В 1979 году /93/ электрофорезом в полиакриламидном геле удалось получить 10 фракций из яда ъ. reciusa , но при этом гомогенных полипептидных токсинов выделено не было. Яд пауков Phoneutria обладает нейротоксическим действием на различных животных. LD5Q яда P. nigr і venter для собак составляет 0,2 мг/кг, для мышей 0,76 мг/кг /94/, активен он и на насекомых.
Инсектотоксины из яда перепончатокрылых
Ярко выраженным паралитическим действием на насекомых обладают яды одиночных ос, которые парализуют свою жертву /2,109/. Наиболее интенсивно в последние годы изучались яды ос Microbracon hebetor И Microbracon gelechiae,а также яд Philantus trian-gulum P., пчелиного волка. В 1976 году Виссером и сотр. /НО/ было описано выделение из гомогената Microbracon hebetor токсического компонента, который достаточно лабилен и постепенно теряет активность в процессе выделения. Исходный гомогенат разделяли на ионообменном ДЕАЕ-сефадексе А-50 в слабощелочном буфере (рН 9,2), затем активную фракцию подвергали гель-фильтрации на сефадексе G-I00. Окончательную очистку токсина осуществляли препаративным электрофорезом в 7% полиакрилшлидном геле при рН 8,9. Активность по мере выделения проверяли на нервно-мышечных препаратах мухи и моли. Выделенный токсин представляет собой белок молекулярного веса 61-63.000 (р% 6,8). Он инактивируется протеожтическими фермен- тами, восстанавливающими агентами, мочевиной, додецилсульфатом натрия. Позднее тем же авторам /III/ удалось усовершенствовать метод выделения и получить из гомогената ж hebeor два токсина А-МТХ и В-МТХ, обладающих значительной гомологией по аминокислотному составу и не обладающих синергизмом действия. Молекулярный вес этих токсинов составил соответственно 43.700 (рН 6.85) и 56.700 (pHj 6,62). Пик и сотр. в 1974 году /112/ выделили на се-фадексе G -100 фракцию, содержащую активный компонент из гомогената M.geiechiae . Молекулярный вес этой фракции был равен 60.000. Как яды M.hebetor и M.geiechiae , так И выделенные ИЗ них белковые токсины, блокируют нервно-мышечную передачу возбуждения у насекомых и их личинок, причем действуют медленно и вызывают у жертвы вялый паралич. Разные виды насекомых имеют различную чувствительность к этим ядам /64,ИЗ/.Показано, что эти яды обладают пресинаптическим действием,понижают амплитуду потенциала действия и частоту миниатюрных потенциалов концевой пластинки, не влияют на чувствительность постсинаптических рецепторов к глутаїлату /112,114/. Вероятно, действие яда связано с пополнением запаса нейромедиато-ра, а количество синаптических везикул при этом не меняется /115/. Яды Microbracon высоко специфичны, они не блокируют холинэргичеокую передачу у позвоночных /64/, а также глутаминэргическую передачу у пауков, скорпионов, крабов /115/, поэтому с их помощью можно исследовать особенности нервно-мышечной передачи у насекомых.
Яд пчелиного волка Pnyia-Ышз trianguium F. обладает сложным действием на нервную систему насекомых,включающим пресинадтический и поотсинаптический эффект на периферическую нервную систему, а также поражение центральной нервной системы /64/. Многие авторы указывают, что механизм пресинаптического действия этого яда очень близок механизму яда Microbracon /И4,И6/.Яд P. trianguium блокирует нервно-мышечную передачу возбуждения и ингибирования у пчел, при этом уменьшает амплитуду постсинаптического потенциала и частоту миниатюрных потенциалов /117/. Вероятно, при действии на пресинаптическую мембрану яд подобно бо.тулиническому токсину мешает выбросу нейромедиатора, не изменяя ультраструктуру клетки. Подобные результаты были получены на нервно-мышечных препаратах саранчи /118/. Интересно отметить, что яд P.trianguium избирательно блокирует глутаминэргическую передачу у разнообразных видов насекомых /119,120,121/. При исследовании воздействия на нервно-мышечную передачу появились данные, указывающие на постсинаптическое действие яда /122/. Различными методами было обнаружено, что яд уменьшает чувствительность постсинапса к глута-мату /119,123/, этот эффект достигается за счет блокирования ионных каналов постсинаптической мембраны, активируемых глутама-том /124/. Еще в 1969 году Виссер /121/ показал, что токсины P.trianguium это вещества с довільно низким молекулярным весом. Однако лишь в 1982 году Спаньер и сотр. /125/ разработали метод выделения токсических компонентов этого яда. С помощью гель-фильтрации сначала на сефадексе G-I00, затем на сефадексе G -25 с последующей очисткой на ионообменном SP -сефадексе С-25 были выделены 4 токсина: ol-, р -у #"-, о- филантотоксины (-РТХ).
Все эти токсины имеют молекулярный вес меньше 700. Было установлено, что $- и &-РТХ вызывают паралич у пчел; -РТХ не действует на пчел, но блокирует передачу в центральной нервной системе таракана /120, 126/; р-РТХ не является токсином, однако усиливает действие )f- и &- РТХ. Наиболее активным по отношению к нервно-мышечной передаче является S-PTX, который блокирует ионные каналы в мембране мышечного волокна. Этот токсин предотвращает деполяризацию постсинапса, вызванную глутаматом /126/. & -РТХ взаимодействует с открытыми ионными каналами. Связывание его не является потенциал-зависимым /127/. Приведенные данные показывают, что &-РТХ является прекрасным инструментом изучения ионных каналов постсинаптических мембран. Большое число работ посвящено изучению ядов пчел и ос. Среди токсических компонентов яда пчелы Apis mellif era только фосфолипаза (Ш) блокирует нервно-мышечную передачу у насекомых. Эта фосфо липаза . представляет собой полипептид, состоящий из 115 аминокислотных остатков с четырьмя дисуль-фидными связями /65/. На нервно-мышечных препаратах личинок —7 Drosophila melanogaster ФЇЇ В концентрации 1,25 X 10 Н вызывает уменьшение частоты миниатюрных спонтанных потенциалов и увеличение амплитуды вызванных постсинаптических потенциалов. В результате через 30 минут она полностью блокирует высвобождение медиатора /128,129/. Однако, пчелиная фосфо-липаза не обладает видовой специфичностью. Необратимо блокирует выброс медиатора на препаратах личинки дрозофилы яд индийской тропической ОСЫ Vespa tropica [Г /130/. Действующая концентрация яда 1,2 х 10 г/мл. Яд шершня Doiichovespula maculate также действует на нервную передачу у насекомых /131/. Из яда шершня Vespa mandarinia с помощью гель-хроматографии на сефадексе G -50 и ионообменной хроматографии на СМ-сефадексе выделен мандаратоксин (М 20.000; pHj 9,1) /132/. Определен аминокислотный состав ЭТОГО TOKCHHa .sx-17,Glx-19,Cys-5,Lys-17,Tlir-9,Ser-9,Pro-9,Gly-16,Ala-12,Val-10,Met-3,Ile-10,Leu-9,Tyr-8,Phe-4,His-5,Trp-4,Arg-5. Токсин блокирует потенциалы действия, уменьшая if а- ток у кальмара и у личинок насеко- мых /132/. Каваи и сотр. /133/ высказали предположение, что мандаратоксин увеличивает проницаемость для ионов СЗҐ. Яды пчел и шершней, хотя и действуют на насекомых, не содержат токсинов селективного действия, тогда как яды одиночных ос действуют только на насекомых. Причем в их ядах есть токсины пресинаптического действия, механизм которых отличается от механизма токсина яда Latrodectus . Постсинаптический сГ-филанто-токсин по механизму действия также не похож ни на один из токсинов описанных выше, он блокирует ионные каналы, активируемые глутаматом.
Исследование структуры инсектотоксинов И5 и И^А из яда кавказского скорпиона Buthus eupeus
Во всех известных нейротоксинах из яда скорпионов остатки пистеина соединены четырьмя внутримолекулярными дисульфидными связями /32,41,50/. В молекуле инсектотоксина И5 идентифицировано 8 остатков цистеинов, что наряду с отсутствием свободных сульфгидрильных групп свидетельствует о наличии четырех дисуль-фидных связей. Поэтому перед структурным анализом инсектотоксина И5 проводилось восстановление дисульфидных связей и карбоксиме-тилирование образовавшихся сульфгидрильных групп. Аминокислотный анализ карбоксиметилированного токсина (СІЛ) И5 свидетельствовал о том, что модификация прошла количественно (таблица 9, ср. с - 59 - таблицей 8). Для фрагментации молекулы токсина было предпринято расщепление трипсином. В триптическом гидролизате СМ-токсина И5 удалось идентифицировать следующие N-концевые аминокислотные остатки: метионин, СМ-цистеин, аспарагиновую кислоту и лизин. Разделение триптических фрагментов осуществлялось методом пептидных карт (рис.16). При этом было обнаружено, что в зонах 1,2,4,6 содер- содержащих в общей сложности 34 аминокислотных остатка (таблица 9). Полная аминокислотная последовательность пептидов Т-І и Т-2 и частичная пептидов Т-2 + Т-3 и Т-5 была определена деградацией по методу Эдмана с идентификацией аминокислотных остатков в виде І-дішетшіаішношфталин-б-сульфоншіьнБіх ( DNS ) производных и фенилтиогидантоинов ( РТН) (таблица 10), При определении С-концевой последовательности пептида T-I ислользова- лись карбоксшептидазы А и В. В результате гидролиза за 3 часа отщепились лизин (27,3.$.), аспарагин (26,5$), аланин (21,2$) и метионин (19,2$) (таблица 10), Поскольку фрагмент T-I имеет общую с СМ-токсином Hg 2Т-концевую аминокислотную последовательность Met-Cys- , он, по-видимому, является п -концевым пептидом.
Для реконструкции молекулы токсина И наиболее целесообразным оказалось изучение продуктов термолитического гидролиза СМ-токсина. В этом гидролизате были обнаружены следующие и -концевые аминокислотные остатки: метионин, фенилаланин, аланин, лейцин. Выделение индивидуальных пептидов проводилось с помощью методов электрофореза при рН 6,5. В двух полученных пептидных зонах содержались индивидуальные пептиды Th-1 и Th-5 . В третьей зоне была обнаружена смесь фрагментов Th-2 и Th-4 » которая в дальнейшем анализировалась без разделения. Пептид Th-З и свободный метионин были выделены из четвертой зоны с помощью хроматографии на целлюлозе. Наличие в гидролизате свободного метионина свидетельствует о том, что при расщеплении термолизином произошел частичный разрыв N -концевой связи метиони-на-12. В целом, в термолитическом гидролизате СМ-токсина было идентифицировано 5 пептидов, содержащих 35 аминокислотных остатков (таблица-II). Для установления аминокислотной последовательности термолитических пептидов были использованы те же методы, что и в случае триптических пептидов. Полностью определена структура пептидов шь-1 и Th-5 (таблица 12). Интересно отметить, что при анализе СМ-токсина Ис и фрагмента Th-5 с помощью карбоксипептидаз А, В и Y не удалось добиться отщепления С-концевого аминокислотного остатка. На основании этих данных было предположено, что как исходный токсин, так и пептид тіі-5 содедат амидированный С-концевой аминокислотный остаток. В настоящее время известна целая группа токсинов скорпионов с амидированной аминокислотой на С-конце /41,140,142/. Для проверки этого предположения проводилось три цикла деградации по Эдману пептида Th-5 с последующим дансилированием С-концевого остатка без стадии кислотного гидролиза. Полученный продукт обладал идентичной хроматографической подвижностью с предварительно синтезированным дансильным производным амида аргинина /143/. Эти результаты наряду с данными по аминокислотной последовательности пептида Th-5 позволили однозначно установить наличие у токсина Hg в качестве С-концевого остатка амида аргинина.
Структуру пептида Th-4 удалось выяснить при анализе методом Эдмана смеси пептидов Th-2 и тіі-4 (таблица 12), так как аминокислотная последовательность пептида Th-2 , входящего в состав триптического фрагмента T-I, уже была известна. Наибольшие трудности представляло определение структуры пептида Tii-з , необходимого для объединения триптических пептидов T-I, Т-2 + Т-3 и Т-4. Методом Эдмана идентифицировались только два w -концевых остатка пептида: Ala и Asn , поскольку далее, по-видимому, происходила циклизация остатка аспараги-на. Карбоксипептидаза А за 3 часа отщепляла от пептида ть-3 остаток СМ-цистеина (37$), а карбоксипептидаза х - остатки лизина (34,5$) и СМ-цистеина (25,5$). Для установления последовательности фрагмента ть-з был проведен его исчерпывающий триптический гидролиз и осуществлен анализ смеси полученных пептидов (таблицаІЗ). Для интерпретации данных использовались результаты определения С-концевых остатков, а также известные аминокислотные последовательности, входящих в состав тза-з В при рН 6. При этом в изотоксине Й5А в положениях 14, 23, 24 были идентифицированы соответственно остатки лизина, аспарагина и глицина, тогда как в токсине И в этих позициях находятся остатки аспарагина, глицина и лизина. Изотоксины И и ИсА обладают идентичными химическими и биологическими свойствами. Эти токсины являются основными полипептидами, состоящими из 35 аминокислотных остатков с четырьмя внутримолекулярными дисульфидными связями. В их составе отсутствуют остатки серина, тирозина, гис-тидина, триптофана, валина, изолейцина. Они относятся к особой группе "коротких" инсектотоксинов скорпионов. В таблице 14 показано сравнение структур инсектотоксинов И и ИА со структурами токсина йт из яда среднеазиатского подвида скорпиона Buthus eupeus /ЗІ/ и токсина Amm Р2 из яда африканского скорпиона Androctonus тайгеtanious mauretanicus /51/. Для ВСЄХ ЭТИХ токсинов характерно наличие около 50$ инвариантных остатков, а при сравнении токсинов попарно структурная гомология достигает более 70%, Обращает на себя внимание то обстоятельство, что все эти токсины имеют одинаковое число аминокислотных остатков между дисульфидными мостиками. и -Концевая аминокислотная последовательность инсектотоксина И4 /32/ также обладает гомологичной структурой .
Исследование токсического компонента яда южно-русского тарантула Lycosa singoriensis
В ядах многих видов пауков содержатся токсические компоненты белковой природы, обладающие разнообразным физиологическим действием. Однако, лишь небольшое число работ посвящено исследованию индивидуальных токсинов, выделенных из цельного яда. Несмотря на то, что известно большое число видов тарантулов, яды их очень мало изучены. Белковый токсин, обладающий активностью по отношению к млекопитающим и насекомым выделен из яда арканзасского тарантула Dugesieiia hentzi /159,160/. Этот токсин обладает некротоксическим действием и представляет собой полипептид молекулярного веса 7300. По сравнению с токсинами скорпионов некротоксин D. hentzi имеет достаточно низкую активность, но его действие усиливает обнаруженный в яде аденозинтрифосфат /161/. В отличие от ядов других членистоногих яд тарантула содержит высокоактивную гиалуронидазу/162/. В данной работе проведено выделение и характеристика токсического компонента яда тарантула Lycosa singoriensis . Этот яд обладает токсической активностью только для млекопитающих, его LD5Q при внутривенном введении белым мышам составляет 15 мг/кг. Яд L. singoriensis по-видимому, не обладает нейротоксическим действием, поскольку На нервНО-МЫШеЧНЫХ Препаратах musculus cutaneus pectoris лягушки и диафрагме мыши не влияет на частоту и амплитуду миниатюрных потенциалов концевой пластинки. Кроме того в отличие от яда D. hentzi исследуемый яд при подкожном введении кроликам не вызывает некрозов, но резко повышает проницаемость капиллярных кровеносных сосудов. Выяснение механизма действия цельного яда L. singoriensis проводилось в совместной работе с А.А.Галкиным и Л.Ф.Пегановой (Институт хирургии им. А.В.Вишневского АМН СССР) на изолированной полоске гладкой мышцы taenia сої і морской свинки. Усиление спонтанной импульсной активности и соответствующее сокращение мышцы яд вызывает в концентрации 5x10 г/л. Несмотря на продолжающуюся подачу яда через 10-20 сек происходит самопроизвольное расслабление препарата гладкой мышцы. Яд не вызывает изменения мембранного потенциала, так как он вызывает сокращение полностью деполяризованной мышцы (рис.21). На рисунке хорошо видно, что размыкательные сократительные ответы деполяризованной мышцы при действии яда заметно уширены по сравнению с нормой, за счет замедления фазы расслабления.
Было высказано предположение, что под действием яда тарантула возрастает поступление ионов Са в миоплазму клеток гладких мышц, вероятно, за счет увеличения проводимости хемовозбудимых кальциевых каналов. По этой причине представляло значительный интерес провести выделение и исследование токсического компонента яда тарантула Lyco-sa singoriensis, ответственного за подобный эффект, так как индивидуальный токсин может служить ценным инструментом изучения кальциевых каналов. По аналогии с другими видами пауков яд тарантула представляет собой смесь из большого числа компонентов белковой и небелковой природы. В его составе с помощью диск-электрофореза обнаружено не менее 12 различных белков достаточно высокого молекулярного веса. Первичное фракционирование цельного яда тарантула осуществлялось на биогеле Р-10. В результате гель-хроматографии было получено шесть различных фракций, из которых только две (тА + тВ) были токсичны для мышей (рис.22). Во фракции тВ содержалась практически вся гиалуронидазная активность яда (60 мкг N-ацетилглюкозаминаУ мг белка ч). Наиболее токсичная фракция ТА согласно данным диск-электрофореза содержала около пяти компонентов белковой природы. Для их разделения использовалась ионообменная хроматография на СМ-целлюлозе GM-S2 в градиенте аммоний -ацетатного буфера. При этом в индивидуальном виде был получен токсин тА-6 ( LD50 7 мг/кг веса мыши). (Рис.23. Гомогенность токсина доказана методом диск-электрофореза при pH 4,3, а методом Лоури показано, что во фракции ТА-6 не содержится примесей небелкового материала, так как количество белка соответствует весу сухой фракции. Выход токсического компонента составил 0(4 от веса сухого яда, однако его токсичность по сравнению с цельным ядом возросла только в 2 раза. Вероятно, токсин достаточно сильно инактивируется в процессе выделения, несмотря на то, что вся работа с ним проводилась при 4С. Кроме того, весьма вероятно, что в цельном яде содержатся компоненты, обладающие синергическим действием по отношению к токсину. С помощью диск-электрофореза в 10$ полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, а также в 12,5% геле с 8М мочевиной и додецилсульфатом натрия было установлено, что молекулярный вес токсина тА-б составляет 10.000-11.000. Эти данные были подтверждены гель-хроматографией на сефадексе G-200 (рис.24) При определении и-концевого аминокислотного остатка было показано, что N-концевая аминокислота токсина тарантула блокирована. После гидролиза токсина карбокеипептидазой А по стандартной методике в качестве С-концевого остатка был идентифицирован аланин. Аминокислотный состав токсина был определен из серии аминокислотных анализов после 24-часового гидролиза 5,7 н.НСІ:Азр -10, Thr -5, Ser- 3, Glu -14, Pro -2, Gly -6, Ala -8, Cys -10, Val -5, He -5, Leu -6, Tyr -2, Phe -4, His -5, Lys -14, Arg -5. Таким образом, токсин состоит из 104 аминокислотных остатков, его молекулярный вес составляет около 11.780. Спектрофотометри-чески, а также после гидролиза 4н. метансульфоновои кислотой было найдено, что в токсине отсутствуют остатки триптофана. В молекуле тА-б содержится 10 остатков цистеинов. Титрованием токсина 5,5 -дитиобис-(2-нитробензойной кислотой) показано отсутствие свободных сульфгидрильных групп. Эти данные свидетельствуют о наличии в токсине пяти внутримолекулярных дисульфидных связей. При исследовании биологической активности выделенного токсина оказалось, что именно он ответственен за действие цельного яда тарантула на гладкие мышцы. тА-6 вызывает сокращение мышцы taenia соїі морской свинки в концентрации I х 10 5 г/мл и рога матки крысы в концентрации І х І0" 7 г/мл. По-видимому, этот токсин является высшим аналогом брадикинина, а также других кининов, содержащихся в яде перепончатокрылых и способных активировать кальциевые каналы гладких мышц. Последнее свойство токсина тарантула позволяет использовать его для исследования системы кальциевого транспорта мембраны гладких мышц.
