Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор. структура и механизм действия пороформирующих токсинов белковой природы 11
2.1. Мишени действия мембраноактивных белков и пептидов 11
2.2. Классификация пороформирующих токсинов (ПФТ) 11
2.3. Основные ступени порообразования 13
2.4. а-Пороформирующие токсины 15
2.4.1. Колицины бактерии Escherichia coli 15
2.4.2. Апоптотические белки Вах и Bcl-xL семейства Вс1-2 белков, ключевых регуляторов апоптоза : 19
2.4.3. Дифтерийный токсин (ДТ) из Corynebacterium diphtheriae 22
2.4.3.1. Некоторые биохимические аспекты действия ДТ 22
2.4.3.2. Основа структурно-функциональных взаимосвязей ДТ 23
2.4.4. Актинопорины - высокомолекулярные цитолизины актиний П-й группы 25
2.4.4.1. Классификация цитолизинов актиний 25
2.4.4.2. Первичная структура актинопоринов 26
2.4.4.3. Вторичная и третичная структуры актинопоринов 29
2.4.4.4. Исследование конформационного состояния актинопоринов 32
2.4.4.5. Взаимодействие актинопоринов с липидными компонентами мембран 33
2.4.4.6. Исследование механизма олигомеризации актинопоринов 34
2.4.4.7. Исследование взаимодействия актинопоринов с мембранным интерфейсом, фосфохолиновый сайт связывания 36
2.4.4.8. Молекулярный механизм порообразования 38
2.5. р-Пороформирующие токсины 40
2.5.1. Стафилококковый а-гемолизин из Staphylococcus aureus 40
2.5.2. Холестеринзависимые цитолизины (ХЗЦ) грамположительных бактерий...43
2.5.2.1. Перфринголизин О из Clostridium perfringens и родственные ХЗЦ 44
2.5.2.2. Сайт связывания ХЗЦ с мембранным холестерином 45
2.5.2.3. Механизм мембранолитического действия ХЗЦ 46
2.5.2.4. Влияние холестерина на олигомеризацию и литическую активность ХЗЦ 48
2.5.2.5. Биохимические эффекты ХЗЦ 49
2.5.3. Гидрализины - новая группа 0-ПФТ гидр семейства Cnidaria 49
2.6. Пороформирующие антимикробные пептиды 51
2.6.1. Биологическая роль и классификация 51
2.6.2. Механизм мембранотропного действия 54
2.6.3. Дермасептины 56
2.6.4. Мелиттин 59
2.6.5. Аламетицин 59
2.7. Некоторые аспекты молекулярной организации и функционирования цитоплазматических мембран, определяющие механизм действия мембраноактивных белков и пептидов 60
2.7.1. Структурная организация бислоя и функциональная роль липидных микродоменов 60
2.7.2. Модуляция изменений цитоскелета клеток-мишеней бактериальными патогенами 62
2.7.3. Сравнительная характеристика структурных особенностей водорастворимых мембраноактивных белков и пептидов и мембранных белков цитоплазматических мембран 63
2.7.4. Локализация и роль остатков ароматических аминокислот в связывании с мембранным интерфейсом 66
2.7.5. Движущие силы фолдинга мембраноактивных пептидов и белков, взаимодействующих с мембраной 67
2.8. Перспективы исследования ПФТ и антимикробных пептидов 68
2.9. Заключение 69
3. Обсуждение результатов 71
3.1. Введение 71
3.2. Поиск цитолизинов в актиниях тропических и дальневосточных морей 73
3.3. Выделение и очистка цитолизинов актиний 76
3.3.1. Высокомолекулярные Radianthus цитолизины (II группа) 76
3.3.2. Низкомолекулярные Radianthus цитолизины (I группа) 81
3.3.3. Высокомолекулярные Oulactis цитолизины (II группа) 90
3.3.4. Высокомолекулярный Metridiurri цитолизин (IV группа) 94
3.4. Физико-химические свойства, липидная специфичность и биологическая активность цитолизинов актиний 95
3.4.1. Высокомолекулярные Radianthus цитолизины 95
3.4.2. Низкомолекулярные Radianthus цитолизины Rml и Rmll 103
3.4.3. Высокомолекулярные Oulactis цитолизины 106
3.4.4. Высокомолекулярный Metridium цитолизин 108
3.5. Исследование мембранолитического действия цитолизинов на модельные мембраны 111
3.5.1. Влияние Radianthus цитолизина RTX-A и Metridium цитолизина на проницаемость липосом 111
3.5.2. Порообразующее действие Radianthus, Oulactis, Metridium
цитолизинов на бислойные липидные мембраны (БЛМ) 123
3.5.2.1. Высокомолекулярные Radianthus цитолизины 123
3.5.2.2. Высокомолекулярные Oulactis цитолизины 138
3.5.2.3. Низкомолекулярный Radianthus цитолизин Rmll 140
3.5.2.4. Метридиолизин из Metridium senile 142
3.6. Исследование мембранолитического действия цитолизинов на биологические мембраны 147
3.6.1. Действие цитолизинов П-й, 1-й и IV-й групп на эритроциты млекопитающих 147
3.6.2. Действие Radianthus цитолизина RTX-A на яйцеклетки морского ежа Strongylocentrotus intermedins 152
3.6.3. Изучение проводимости изолированного фрагмента эритроцитарной мембраны, индуцированной цитолизином RTX-A 153
3.6.4. Влияние цитолизина RTX-S II на развитие ооцитов морского ежа Strongylocentrotus intermedins 157
3.7. Исследование жпидной специфичности и липид-белкового взаимодействия Radianthus цитолизинов методом дифференциальной сканирующей калориметрии 158
3.8. Установление первичной структуры Radianthus и Oulactis цитолизинов 171
3.8.1. Определение частичной аминокислотной последовательности Oulactis цитолизинов Ог-А и Or-G и Radianthus цитолизинов RTX-A, RTX-SII и Rmll методами структурной химии белка 171
3.8.2. Установление полной аминокислотной последовательности Ог-А и Or-G... 174
3.8.3. Установление полной аминокислотной последовательности RTX-A 181
3.8.4. Установление полной аминокислотной последовательности RTX-S II 185
3.9. Исследование вторичной структуры и конформационной стабильности актинопорина RTX-S II 189
3.9.1. Пространственная организация нативного актинопорина RTX-S II ..189
3.9.2. Влияние различных факторов на конформацию актинопорина RTX-S П...191
3.9.3. Влияние температуры, величины рН и ионной силы раствора на гемолитическую активность RTX-S II 200
3.10. Анализ структурно-функциональных взаимосвязей Radianthus и Oulactis актинопоринов 203
3.11. Radianthus актинопорины как инструмент количественного
определения сфингомиелина в биологических жидкостях и тканях 213
3.12. Заключение 214
4. Экспериментальная часть 215
5. Выводы 233
6. Список цитируемой литературы
- Классификация пороформирующих токсинов (ПФТ)
- Взаимодействие актинопоринов с липидными компонентами мембран
- Некоторые аспекты молекулярной организации и функционирования цитоплазматических мембран, определяющие механизм действия мембраноактивных белков и пептидов
- Физико-химические свойства, липидная специфичность и биологическая активность цитолизинов актиний
Введение к работе
Актуальность темы. Одним из важнейших направлений биоорганической химии и ряда смежных наук является установление молекулярной организации и механизмов функционирования биологических мембран. Изучение защитной и коммуникативной функций биомембран, осуществляемых на уровне клетки и внутриклеточных компартментов, а также ряда процессов, происходящих при их участии - биосинтеза и секреции белков, функционирования систем гормонального ответа и сигнальной трансдукции, биоэнергетических процессов, требует применения широкого набора биохимических инструментов. Общепризнанными и универсальными инструментами исследования цитоплазматических мембран являются высокоспецифичные соединения белковой природы, продуцируемые как прокариотами, так и эукариотами, которые относят к группам а- и р-пороформирующих токсинов (ПФТ), а также антимикробных пептидов. Созданные природой для разрушения мембран клеток-мишеней эти цитолитические токсины представляют собой удивительные структуры, способные существовать как в водорастворимом, так и в мембраносвязанном состоянии, в котором они осуществляют свое мембранолитическое действие. Благодаря установлению первичной структуры и пространственной организации многих ПФТ и мембраыоактивных пептидов определена ключевая роль конформационных изменений, претерпеваемых их молекулами при переходе из водорастворимого в мембраносвязанное состояние. Предполагают, что состояние так называемой «расплавленной глобулы», характеризующееся переходом гидрофобных трансмембранных областей молекул из белкового кора в мембрану, ответственно за функциональную активность ПФТ. Очевидно, выяснение природы рецепторного взаимодействия мембраноактивных белков и полипептидов с мембранными белками, впрямую связанное с установлением структуры обеих групп белков, а также молекулярной организации мембран клеток-мишеней, должно способствовать пониманию механизма действия ПФТ. Одной из широко исследуемых в последние годы моделей ПФТ являются актинопорины - цитолитические токсины, продуцируемые актиниями, морскими ядовитыми кишечнополостными (тип Coelenterata). Совместно с фосфолипазами, нейротоксинами, протеолитическими ферментами и ингибиторами протеиназ они входят в состав ядовитого секрета актиний. Известно, что цито- и неиротоксины выполняют в организме-продуценте алломональную роль, тогда как роль протеаз и их ингибиторов изучена еще недостаточно. Ее выяснение, очевидно, поможет понять механизмы экспрессии полипептидов актиний, в частности пре- и пропептидов цитолизинов, имеющих гомологичные фрагменты аминокислотной последовательности с рядом полипептидов актиний (класс Anthozoa) и других организмов типа Cnidaria, таких как гидры и кораллы (класс Hydrozoa).
Огромный интерес к цитолизинам актиний обусловлен не только возможностью их применения в качестве инструментов исследования биомембран, но и проявляемой ими биологической активностью (например, кардиостимулирующей, антиопухолевой, антипаразитарной), что позволяет использовать цитолизины как модели для дизайна современных высокоспецифичных фармакологических и биотехнологических препаратов направленного действия.
ПФТ актиний являются незаменимыми инструментами и уникальными модельными системами для исследования липид-белковых, белок-белковых и белок-мембранных взаимодействий: их включение в мембрану не требует участия других соединений (например, шаперонов) или транслокона, поскольку вся необходимая для этого информация заключена в их собственной структуре. Кроме того, структурное и функциональное подобие ПФТ некоторым мембранным белкам, таким как порины грамотрицательных бактерий, позволяет использовать их в качестве моделей для изучения механизма действия поринов, поскольку получение последних в кристаллическом виде представляет значительную трудность. В то же время топология исследованных к настоящему времени мембранных белков вносит вклад в понимание механизмов взаимодействия с мембраной мембраноактивных водорастворимых белков. Этот факт, а также наличие ряда противоречий между литературными данными по исследованию структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов и результатами наших исследований диктуют необходимость расширения поиска и установления структуры новых ПФТ актиний.
Заманчивой целью в изучении цитолизинов актиний является установление их экологической и алломональной роли в морском биоценозе, установление структуры анцестрального гена для гомологов и ортологов этих полипептидов, а также выяснение правомерности гипотезы, представляющей актинопорины видовыми или родовыми хемотаксономическими маркерами.
Целью данного исследования являлся поиск новых источников цитолитических токсинов среди актиний низкобореальных и тропических вод, выделение цитолизинов, изучение их свойств, липидной специфичности и механизма действия, а также установление структуры и выяснение структурно-функциональных взаимосвязей цитолизинов (актинопоринов), ингибируемых сфингомиелином.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые в гомогенном состоянии выделено четыре высокомолекулярных сфингомиелинингибируемых цитолизина, отнесенных к группе актинопоринов: два из дальневосточной актинии Oulactis orientalis и два из тропической актинии Radianthus macrodactylus. Из R. macrodactylus выделено также два низкомолекулярных гистаминолитических Radianthus цитолизина, подобных цитолизину из актинии Tealiafelina.
Впервые исследовано мембранолитическое действие высокомолекулярных Radianthus актинопоринов на изолированном фрагменте эритроцита кролика и доказан общий для модельных и биологических мембран механизм литического действия этих полипептидов. Также впервые исследовано действие метридиолизина на модельные мембраны и установлено отсутствие высокой липидной специфичности к мембранному холестерину. Установлено, что в отличие от Radianthus актинопоринов, типичных каналоформеров, метридиолизии в низких концентрациях проявляет канальные свойства, а в высоких - действует подобно поверхностноактивным соединениям.
Установлена первичная структура новых Oulactis и Radianthus актинопоринов, причем впервые - для двух представителей, продуцируемых актинией холодных низкобореальных вод. Установлена аминокислотная последовательность ІУ-концевого фрагмента одного из низкомолекулярных Radianthus цитолизинов, отличающаяся от аналогичного фрагмента актинопоринов и имеющая 83% подобия с /V-концевым фрагментом ингибитора протеиназ из R. macrodactylus.
Методами сравнительного моделирования предсказана пространственная структура Radianthus и Oulactis актинопоринов. Проведен анализ структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов. Показано, что //-концевые фрагменты аминокислотных последовательностей актинопоринов дальневосточной актинии короче на несколько аминокислотных остатков, что объясняет различия в величине их гемолитической активности.
Полученные результаты позволяют заключить, что Oulactis актинопорины являются уникальными природными моделями для изучения структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов.
Настоящая работа представляет собой первое исследование взаимодействия Radianthus актинопоринов с белковыми компонентами цитоплазматических мембран, в частности с основным структурным белком цитоскелета актином. Согласно результатам, полученным при изучении действия Radianthus актинопорина на яйцеклетки морского ежа, полипептид влияет на процессы полимеризации и/или деполимеризации актина, лежащие в основе клеточной пролиферации. Результаты изучения мембранотропного действия актинопоринов на биологические мембраны и анализ их структурно-функциональных взаимосвязей позволяют предположить, что фармакологические эффекты, проявляемые актинопоринами, обусловлены как их пороформирующим действием, так и рецепторным взаимодействием с белковыми компонентами биологических мембран.
Установление структуры и функции ПФТ важно для решения многих задач и проблем в таких областях научных знаний, как мембранология, клеточная биология и биохимия и др., оно необходимо и для прикладных исследований, так как создает предпосылки к дизайну новых высокоспецифичных фармакологических средств, избирательно действующих на клетки-мишени.
Классификация пороформирующих токсинов (ПФТ)
Основные ступени образования пор пороформирующими токсинами в мембранах клеток-мишеней обобщены в обзорах [1, 8, 9, 17, 19, 20] и представлены схематично на рисунке 2.3. Первоначально происходит секреция токсина клеткой-хозяином, которая реализуется часто благодаря чрезвычайно тонким механизмам, включающим участие комплексной белковой секретирующей системы, как, например, в случае проаэролизина [21]. Обнаружены и менее сложные механизмы с участием лизирующих белков, «продырявливающих» внешнюю мембрану бактерии-продуцента, как, например, в случае колицинов [22]. Затем молекулы токсина диффундируют к соответствующим клеткам-мишеням и взаимодействуют со специфическими рецепторами, находящимися на наружной стороне цитоплазматической мембраны (интегральными белками, липидами или сахарами). Согласно существующим представлениям, в результате связывания с рецептором токсин концентрируется на поверхности мембраны клетки-мишени перед своей финальной атакой. Не исключается и другая роль рецептора, например, генерация сигнальных путей в мембране клетки. В любом случае результатом концентрирования токсинов на мембране является их олигомеризация. На заключительном этапе процесса происходит включение олигомеров в мембрану и образование пор. Детали данного механизма интенсивно исследуются в последние годы [9].
Необходимо отметить, что ПФТ устойчивы к протеолизу ферментами, находящимися в ядах организмов-продуцентов, а также в тканях клеток-мишеней. Их стабильность достигается с помощью дисульфидных связей, стабилизирующих фолд белка, и/или в результате посттрансляционной модификации токсина, которая включает сульфатирование тирозина, бромирование триптофана, гликозилирование треонина, у-карбоксилирование глутамина, гидроксилирование пролина, амидирование С-концевого аминокислотного остатка, С- и /V-концевую циклизацию, а также изомеризацию аминокислотных остатков до D-аминокислот [23].
Колицины - особая группа белковых токсинов-антибиотиков, кодируемых специализированными плазмидами в Е. coli, функция которых заключается в поражении конкурирующих бактерий. Секреция колицина во внеклеточную среду осуществляется с помощью плазмидокодируемого белка, который лизирует внешнюю мембрану клетки-продуцента. Кодируемый той же плазмидой так называемый «иммунный» белок защищает продуцирующие клетки от поражающего действия колицина [22]. После секреции рецептор-связывающий R домен колицина (рис. 2.4.1, б) связывается с белковым рецептором внешней мембраны клетки-мишени (порином OmpF), и с помощью транслоцирующего Т домена токсин транспортируется через внешнюю мембрану в периплазму клетки-мишени, используя транспортную систему белков семейства Тої или Топ [24]. Финальная ступень поражающего действия колицина, а именно, образование пор, осуществляется после связывания порообразующего домена С с внутренней мембраной клетки-мишени. Колицины являются мощными а-ПФТ, величина проводимости образуемых ими потенциалозависимых ионных каналов составляет 10-60 пСм [25]. Пороформирующий домен молекулы колицина А, полученный протеолизом, оказывает на БЛМ действие, подобное действию нативного токсина [26].
Находясь в периплазме, колицины вызывают гибель клетки, происходящую либо благодаря деэнергизации цитоплазматической мембраны в результате образования в ней пор, поступления в клетку цитоплазмы и ингибирования синтеза белков, либо благодаря проявляемой токсинами ДНК-азной или РНК-азной активности [9]. Обнаружено, что некоторые белки объединяются с колицинами для транслокации через мембраны клеток-мишеней [27].
Типичным представителем группы а-ПФТ является колицин А. На основе установленной кристаллической структуры его пороформирующего домена (рис. 2.4.1, а) сделан ряд заключений о механизме действия колицинов [28]. Полипептидная цепь пороформирующего домена колицина А (203 а.о.) образует трехслойную структуру из десяти а-спиралей (рис. 2.4.1, а). Интересной особенностью этого фолда является полностью погруженная в глобулу домена гидрофобная спирализованная «шпилька», образованная спиралями а8 и а9 (рис. 2.4.2, а). Данная структурная особенность пороформирующего домена молекулы колицина А послужила основой для создания так называемой «зонтичной» модели взаимодействия белка с мембраной, согласно которой петля, соединяющая спирали а8 и а9, включается в липидный бислой и инициирует последующее спонтанное включение в него всей гидрофобной шпильки (рис. 2.4.2, б). Так как проникновение заряженных а.о. в мембрану энергетически невыгодно, внедряющийся домен претерпевает конформационную перестройку (ее можно сравнить с раскрытием зонтика), при которой два внешних слоя домена, обрамляющие спирали а8 и а.9, выворачиваются гидрофобными сторонами к поверхности мембраны (рис. 2.4.2, б) и затем погружаются в гидрофобный кор бислоя (рис. 2.4.2, в). Экспериментальная проверка «зонтичной» модели показала, что введение дисульфидных мостиков между первой и девятой, пятой и шестой, девятой и десятой спиралям приводит к инактивации молекулы, поскольку теряется ее способность раскрываться в виде зонтика. Пороформирующая активность восстанавливается после обработки молекулы восстанавливающими агентами [30]. Исследование действия колицина на фосфолипидные мембраны, модифицированные бромом, показало, что гидрофобная шпилька, образуемая спиралями а8 и а9, глубоко погружается в липидный бислой, тогда как амфифильные спирали ccl-a7 и а10 располагаются на поверхности мембраны так, что а.о. триптофана погружаются в липидный интерфейс. Об этом свидетельствуют результаты тушения флуоресценции триптофана внутренними тушителями (бромированными липидами) [31]. Происходящие вслед за этим конформационные изменения гидрофобных шпилек, расположенных между спиралями аЗ-аб и частично а7, приводят к дальнейшему включению их в липидный бислой (рис. 2.4.2, в) [32].
Взаимодействие актинопоринов с липидными компонентами мембран
Ранее было установлено, что гемолитическая активность стихолизина III из S. helianthus ингибируется дисперсией экзогенного сфингомиелина (СМ), а обработка эритроцитарных мембран сфингомиелиназой переводит их в состояние, резистентное к действию этого токсина [126]. Хотя дальнейшие исследования продемонстрировали, что цитолизины обладают аффинностью к целому ряду липидов, образующих моно- и бислойные липидные мембраны [76, 80], предположение о том, что СМ является специфическим мембранным акцептором актинопоринов до сих пор не опровергнуто. При исследовании влияния актинопоринов на проницаемость биологических мембран, а также липосом и БЛМ различного липидного состава было установлено, что присутствие СМ снижает действующие концентрациии цитолизинов и делает процесс включения в мембрану необратимым [127, 128]. При изучении действия EqtII на липосомы, состоящие из ФХ и СМ, методами 31Р ЯМР-спектроскопии и электронной микроскопии было обнаружено наличие в модифицированной токсином мембране изотропной гексагональной Нц-фазы, которая по предположению авторов способствует поробразованию [129-134].
Отмечено влияние молекулярной организации биологических и модельных мембран, а также физико-химических свойств входящих в их состав липидов на пороформирующую активность актинопоринов [77-81]. Такие факторы, как наличие липидных микродоменов и структурные дефекты на границе раздела липидных фаз [130-134], полиморфизм фосфолипидов [129, 130], мембранный дипольный и трансмембранный потенциал [82], размер и кривизна поверхности липосом [132], способны модулировать процессы порообразования.
Исследование кинетики связывания Stnl и EqtII с однослойными и многослойными липосомами методами оптической и ЯМР-спектроскопии показало, что с мембраной связывается мономерный токсин [76, 85, 135], который, накопившись на поверхности мембраны до критической концентрации, олигомеризуется в тримерные и тетрамерные структуры [127, 129]. Это подтверждают результаты изучения мембранолитического действия Stnll на БЛМ [76-78,131].
Изучение сокристаллизации Stnll с ФХ показало, что она сопровождается тетрамеризацией мономерной формы полипептида (рис. 2.4.14) [95]. Единичная ячейка двумерного кристалла Stnll в ФХ монослое, полученная с разрешением 15 А, образована двумя тетрамерными порообразными структурами, форма которых аналогична Y-образным мономерным структурам, обнаруженным электронной микроскопией [107]. Анализ двумерных кристаллов свидетельствует об отсутствии больших олигомерных ансамблей и наличии в пределах тетрамерных протомеров лишь идентичных мономерных структур (рис. 2.4.14 и 2.4.15). Stnll существует в растворе преимущественно в виде тетрамеров [82], тогда как EqtII, в основном, в
Реконструкция трехмерного изображения тетрамерного ансамбля молекулы Stnll [95]. Вид на олигомер, находящийся на липидном монослое, сверху -(А), снизу - (Б), сбоку - (В) (показаны широкий и узкий регионы тетрамера, максимальный внешний диаметр узкой части 95 А, широкой части - 110 А, внутренний диаметр - 50 А, высота - 43 А). Модель построена на основании расчета, проведенного с помощью 204-х микроснимков Stnll с 53 картинками электронной плотности атомов актинопорина; размер клеточной ячейки двумерного кристалла 163x163 А, каждая ячейка содержит восемь молекул Stnll, сгруппированных в два тетрамерных ансамбля. Рассчитанная согласно 3D изображению электронной плотности молекулярная масса тетрамера составляет 76 кДа (молекулярная масса мономера составляет, таким образом, 19,25 кДа, что указывает на незначительное включение тетрамера Stnll в липидный монослой). виде димеров [106], поэтому до сих пор остается открытым вопрос, включается ли в связывание с мембраной тетрамерная форма молекулы Stnll [107].
Визуализированная модель тетрамера Stnll, полученная методом реконструкции трехмерного изображения растворимой формы молекулы Stnll (рис. 2.4.15, А и Б) [95], наглядно показывает, что олигомеризация не сопровождается значительными конформационными изменениями кора Р-сэндвича, но затрагивает ІУ-концевой фрагмент от Alal до Val27, высокоосновную петлю между стрендом 07 и спиралью аВ (121Ser-Gly-Lys-Arg-Arg-Ala-Asp-Glnl28), а также часть этой спирали от Glyl29 до Aspl33. С данной моделью согласуется предполагаемое передвижение псевдожесткого Л -концевого фрагмента вокруг петли, соединяющей спираль аА и стренд Р2, и вращение пептидной связи между а.о. Ser28 и Arg29 в этой петле, которое достаточно убедительно объясняет наличие высокой электронной плотности между мономерами Stnll (рис. 2.4.14 и 2.4.15, В). Экспериментальные кристаллографические и электронно-микроскопические данные свидетельствуют о том, что олигомеризация происходит благодаря взаимодействию Л -концевого фрагмента молекулы с С-концевым фрагментом соседнего мономера. Поэтому петля между спиралью аА и стрендом Р2 может выполнять функцию шарнира и играть важную роль в конформационной перестройке молекулы при ее олигомеризации.
Некоторые аспекты молекулярной организации и функционирования цитоплазматических мембран, определяющие механизм действия мембраноактивных белков и пептидов
Показано, что инфицирующее действие ряда бактериальных патогенов белковой природы связано не только с их поформирующим действием, но и с модуляцией изменений в цитоскелете клетки-мишени, происходящих после прохождения патогенов через внешнюю мембрану клетки и транслокации к цитоплазматической мембране [227]. Модуляция включает взаимодействие патогенов с мембранными рецепторами, нарушение путей внутриклеточной сигнальной трансдукции и реорганизацию цитоскелета в точках контакта патогена с мембраной, что приводит к интернализации патогена клетками хозяина [228].
Установлено, что действие большинства бактериальных белков направлено в основном на актин, но некоторые токсины связываются и с другими белками цитоскелета, такими как тубулин, виментин, профилин, филамин, и в ряде случаев изменяют их олигомерное состояние [229].
Исследование модулирующего действия инвазивных белков SipA и SipC из Salmonella в экспериментах in vitro показало, что SipA помимо непосредственного связывания с F-актином существенно стимулирует SipC-опосредованную нуклеацию полимеризации актина, происходящую после включения SipC в клеточную мембрану, объединение F-актина в пучки и образование стабильной сети F-актиновых пучков [230]. С помощью клеточных культур млекопитающих обнаружено, что SipA увеличивает SipC-индуцируемую реорганизацию актина in vivo [231].
Выяснение механизма этих биохимических процессов осуществлялось с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллической структуры молекулы SipA (рис. 2.7.2, а) и электронной микроскопии комплекса SipA с актином. В результате исследований установлено наличие одной глобулярной электронной плотности, отнесенной к 8ірА(497-669)-актиновому филаменту, а также двух похожих на «рукава» неглобулярных выступающих плотностей, принадлежащих С- и N-концевым фрагментам молекулы SipA, которые связывают актиновые протомеры (а.о. 446-684 актина) (рис. 2.7.2, б) [232]. На основании этих данных была предложена модель, согласно которой SipA действует подобно «степлеру»: глобулярный домен связывается с молекулой актина, а вытянутые неглобулярные «Степлерная» модель актинополиме-ризующего действия SipA из Salmonella [232]. (а) Структура С-концевого актинополимеризующего домена SipA согласно кристаллографическим данным. Точки на С- и ./V-концах молекулы - а.о., невидимые на карте электронной плотности, (б) Докинг кристаллической структуры SipA с электронной плотностью SipA-актиновых филаментов. (в) Связывание протомеров актина на различных нитях филамента молекулой SipA (согласно «степлерной» модели). участки, «рукава», охватывают и связывают периферические участки молекулы актина в филаментах, оказывая полимеризующее действие и обеспечивая механическую стабильность актина (рис. 2.7.2, в). Установлено, что так называемая актинополимеризующая активность мутантной формы молекулы SipA, имеющей «усеченные рукава», значительно меньше, чем нативной молекулы, что подтверждает достоверность «степлерной» модели действия токсина SipA, модулирующего изменения в цитоскелете [233].
Удивительное подобие основных структурных мотивов мембранных белков и мембраноактивных белков и пептидов, находящихся в мембраносвязанном состоянии (рис. 2.7.3), представляет огромный интерес с точки зрения сравнительного исследования структурно-функциональных взаимосвязей представителей обеих групп. Характерной особенностью и тех и других белков является наличие а-спирализованных пучков, образующих трансмембранные шпильки, и Р-структуры, представляющей собой либо Р-сэндвич, либо Р-баррель [234].
Для изменения водорастворимого состояния мембраноактивных белков на мембраносвязанное требуется рефолдинг молекул при их спонтанном включении в мембрану, завершаемом ассоциацией и порообразованием белков [1, 8, 9, 19, 20, 206]. В отличие от водорастворимых ассоциация мембранных белков является одним из составных элементов сложного комплексного транслокационного механизма. Схематично этот механизм описывается следующими этапами (рис.
Ленточные диаграммы мембранных белков с двумя структурными мотивами, а-спирализованными пучками (А) и Р-баррелем (Б) [234]. Структурный мотив (А) иллюстрируется пятью субъединицами легкого комплекса II Rhodospirillum molischianum [235] (PDB код 1LGH), (Б) - (3-баррелем малтопорина Salmonella typhimurium [236] (PDB код 2MPR). Мембрана содержит пограничные регионы толщиной около 15 A (interface), углеводородный кор толщиной около 30 А (НС Core). Различные фрагменты молекул белков взаимодействуют с мембранными компонентами обоих регионов. Средняя длина а-спиралей в пучках 38±7 А (25±5 а.о.). Особенностью спирализованного пучка является пограничное расположение спиралей, лежащих параллельно плану мембраны, что показано на примере покровного белка fd бактериофага (В), структура которого установлена методом ЯМР-спектроскопии [237] (PDB код 1FDM). Локализация боковых цепей а.о. Тгр и Туг показана черными и серыми шариками.
2.7.4): секреция рибосомой белковых цепей в транслокон, находящийся на мембране; образование белковых ансамблей (комплексов) в транслоконе; высвобождение комплексов мембранных белков в мембрану посредством пока не выясненного полностью механизма; диссоциация комплекса рибосома-транслокон, в результате которой белковый комплекс покидает транслокон, остающийся в мембране в стабильном конформационном состоянии [234].
Физико-химические свойства, липидная специфичность и биологическая активность цитолизинов актиний
Актинии, продуцирующие пороформирующие токсины, относятся к простейшему уровню организации и вместе с медузами и кораллами образуют тип кишечнополостные (Coelenterata), который насчитывает около 9000 видов. Биологические и биохимические исследования этих животных указывают на важное экологическое значение в морском биоценозе продуцируемых ими токсинов - высокомолекулярных белковых соединений, выполняющих роль агрессивных и оборонительных алломонов [246]. Предполагают, что в коммуникативных взаимодействиях с представителями различных видов подводного животного мира агрессивные алломоны являются субстанцией, используемой актиниями для парализации и умерщвления своих жертв, в то время как оборонительные алломоны служат для отпугивания врагов (хищников или «территориальных» конкурентов) [247]. Система алломонов актиний включает токсичные белковые соединения - нейро- и цитотоксины, а также протеолитические ферменты и высоко- и низкомолекулярные ингибиторы протеиназ, биологическая роль которых в актиниях во многих случаях до сих пор не ясна [248, 249]. Нейротоксины представлены полипептидами, модифицирующими натриевые и калиевые каналы электровозбудимых мембран; а цитотоксины - низкомолекулярными цитолизинами, высокомолекулярными ПФТ (актинопоринами), вызывающими лизис цитоплазматических мембран клеток эукариот, и фосфолипазами [250, 251]. Исследованию этих групп биологически активных полипептидов актиний уделяется значительный интерес исследователей в связи с уникальной биологической ролью и выполняемой этими полипептидами и белками физиологической функцией [8,9,247,252].
Исследование цитолизинов актиний было начато в 70-х годах прошлого столетия. К восьмидесятым годам были выделены и в большей или меньшей степени охарактеризованы цитолизины из S. helianthus, A. equina, Aiptasia pallida [84, 85, 87, 69, 251] и М. senile [70, 71]. Но в отличие от гемолитически активных стихолизинов и эквинатоксинов, проявляющих пороформирующую активность, цитолизины из A. pallida являются белками с фосфолипазной А2 активностью [69], а свойства высокомолекулярного метридиолизина из М. senile fimbriatum оказались очень близки свойствам тиолактивируемых ХЗЦ бактерий [1,9,17-19,].
К настоящему времени описано более 30 видов актиний, принадлежащих к семействам Aiptasiidae, Metridiidae, Actiniidae и Stichodactylidae, причем из каждого вида выделено и охарактеризовано от одного до нескольких цитолитических v .полипептидов. Наиболее изучены цитолизины, продуцируемые тропическими видами актиний S. helianthus, A. equina, Actinia tenebrosa, Heteractis magnifica. Ha основании липидной специфичности и некоторых физико-химических свойств цитолизины актиний принято делить на четыре группы: I - низкомолекулярные цитолизины (М 5-7 кДа), проявляющие гистаминолитическую активность, II -высокомолекулярные цитолизины, ингибируемые сфингомиелином (М15-20 кДа), III - цитолизины с фосфолипазной А2 активностью (М 12-45 кДа) и IV -цитолизины, ингибируемые холестерином (метридиолизин, имеющий М 80 кДа) [11, 95, 107, 113-120, 139-145, 149, 152, 153]. Наше внимание было направлено на исследование структуры и механизма действия цитолизинов из тропической актинии Radianthus (Heteractis) macrodactylus и дальневосточных актиний Oulactis orientalis и М. senile fimbriatum, отобранных в результате поиска новых источников цитолизинов среди актиний Японского и Охотского морей. Согласно принятой классификации [254] цитолизины родов Radianthus, Oulactis и Metridium получили название Radianthus, Oulactis цитолизины или актинопорины и Metridium цитолизин.
Расширение арсенала цитолитических полипептидов как биохимических инструментов и установление их первичной структуры является самостоятельной научной задачей. Феномен 100%-ной гомологии аминокислотных последовательностей двух цитолизинов И-й группы из A. equina и A. tenebrosa, эквинатоксина II (EqtII) и тенеброзина С (ТпС) соответственно (исключение составляют два а.о.), позволил предположить, что актинопорины можно рассматривать в качестве хемотаксономических маркеров на уровне рода и вида [252].
Проверка этой гипотезы требует проведения поиска новых источников цитолизинов, установления их структуры и выяснения зависимости структуры и функции от географического места обитания животных и экологической роли в морских биоценозах.
Нами проведен скрининг актиний, собранных в 27 экспедиционном рейсе НИС «Академик Опарин» в Охотском море в районе южного Сахалина и в заливе Посьета Хасанского района (табл. 3.2). Тропическая актиния R. macrodactylus была собрана в прибрежных водах Сейшельских островов в ходе 11 экспедиции НИС «Академик Опарин» в 1990 г. Сырье хранилось при -20С. Видовая принадлежность актиний была определена сотрудницей Института биологии моря ДВО РАН (г. Владивосток) к.б.н. Е.Е. Костиной и сотрудником Зоологического института РАН (г. Санкт-Петербург) к.б.н. С.Д. Гребельным
Как следует из результатов, представленных в таблице 3.2 в водных и этанольных экстрактах актиний Охотского и Японского морей наряду с цитолизинами присутствуют нейротоксины и ингибиторы протеиназ. Самую высокую токсичность проявляют этанольные экстракты Cribrinopsis similis и Stomphia sp. (ЛД5о = 36,55 и 53,36 мг/кг соответственно). Этанольные экстракты остальных видов имеют слабовыраженную токсичность (ЛД5о 200-400 мг/кг). Обычно токсичность этанольных экстрактов актиний связывают с действием нейротоксинов [250], вызывающих нарушение сердечной деятельности и остановку сердца экспериментальных животных (так ЛД50 нейротоксина Rmlll из тропической актинии R. macrodactylus составляет 20 мкг/кг [253]) и, в меньшей степени, с действием цитолизинов [255, 256]. Поскольку в этанольных экстрактах исследуемых видов актиний Охотского и Японского морей гемолитическая активность не была обнаружена, можно предположить, что токсическое действие на экспериментальных животных оказывают нейротоксины. Водные экстракты актиний Actinostola callosa, Stomphia sp., Stomphia coccinea, 0. orientalis (залив Анива) были нетоксичны. Токсичность водных экстрактов Actinostola sp., М. senile fimbriatum, О. orientalis (залив Посьета) оказалась в два раза выше, чем соответствующих этанольных. Невысокую, в целом, токсичность водных экстрактов актиний можно объяснить, по-видимому, действием цитолизинов.
