Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Литературный обзор 6
2.1. Классификация нейротоксинов пауков 6
2.2. Особенности пространственной организации токсинов пауков, структура цистеинового узла 7
2.3. Нейротоксины пауков, действующие на калиевые каналы 9
2.3.1 Нейротоксины из яда паука Grammostola spatulata 9
2.3.2. Нейротоксины из яда паука Heteropoda venatoria 11
2.3.3. Нейротоксины из яда паука Phrixotrichus auratus 11
2.3.4. Нейротоксины из яда паука Heteroscodra maculata 12
2.3.5. Нейротоксины из яда паука Stromatopelma calceata 13
2.3.6. Нейротоксины из яда паука Scodra griseipes 14
2.3.7. Нейротоксины из яда паука Phoneutria negriventer 15
2.4. Нейротоксины пауков, действующие на натриевые каналы 15
2.4.1. Нейротоксины из яда паука Atrax robustus 16
2.4.2. Нейротоксины из ядов пауков рода Hadronyche 17
2.4.3. Нейротоксины из яда паука Missulena bradleyi 19
2.4.4. Нейротоксины из яда паука Agelcnopsis aperta 20
2.4.5. Нейротоксины из яда паука Hololena curia 21
2.4.6. Нейротоксины из яда паука Paracoelotes luctuosus 22
2.4.7. Нейротоксины из яда паука Phoneutria nigriventer. 22
2.4.8. Нейротоксины из яда паука Selenocosmia huwena 24
2.4.9. Нейротоксины из яда Selenocosmia hainana 25
2.4.10. Нейротоксины из яда паука Thrixopelma pruriens 26
2.5. Нейротоксины пауков, действующие на кальциевые каналы 28
2.5.1. Нейротоксины из яда паука Agelcnopsis aperta 28
2.5.1.1. со-Агатоксииы первой группы (ы-Aga I) 28
2.5.1.2. со-Агатоксины второй группы (ы-Aga-Il) 30
2.5.1.3. о-Агатоксины третьей группы (co-Aga-III) 31
2.5.1.4. (о-Агатоксины четвертой группы (o-Aga-IV) 32
2.5.2. Нейротоксины из ядов пауков родов Hadronyche и Atrax 33
2.5.3. Нейротоксины из яда паука Phoneutria nigriventer. 35
2.5.4. Нейротоксины из яда паука Grammostola spatulata 37
2.5.5. Нейротоксины из яда паука Hysterocrates gigas 38
2.5.6. Нейротоксины из яда паука Segestria florentina 39
2.5.7. Нейротоксины из яда паука Fil'tstata Mbernalis 40
3. Результаты и обсуждения 44
3.1. Выделение нейротоксина lsp-і из яда паука lycosa sp 44
3.2. Биологические свойства нейротоксина lsp-і из яда паука lycosa sp. 46
3.3. Установление полной аминокислотной последовательности токсина lsp-1 50
3.4. Поиск гомологии с известными токсинами елокаторами ионных каналов 51
3.5. Получение рекомбинантного белка LSP-1 52
3.5.1. Конструирование вектора pET32b-Lsp-l и оптимизация условий экспрессии гибридного рекомбинантного белка Тгх-Lsp-l в кістках Е. colt 52
3.5.2. Получение рекомбинантного токсина Lsp-і из состава химерного белка Тгх-Lsp-1 55
3.6. Токсиномика яда паука agelena orientaus 57
3.6.1. Создание библиотеки пуклеотидных последовательностей кДНК. 57
3.6.2. Анапа библиотек нукчеотидных последовательностей кДНК паука Agelena orientalis 58
3.6.3. Исследование базы данных EST последовательностей A. orientalis с помощью структурных мотивов 60
3.6.4. Сравнение двух подходов анализа банка EST A. orientalis 70
4 Экспериментальная часть 73
4.1. Оборудование и материалы 73
4.1.1. Оборудование 73
4.1.2. Реактивы и ферменты 74
4.1.3. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы 74
4.1.4. Микробиологические среды и буферные растворы 75
4.2. Методы 77
4.2.1. Проведение гель-фильтрационной хроматографии 77
4.2.2. Выделение активной фракции LS 78
4.2.3. Выделение токсинаLsp-І 79
4.2.4. Восстановление дисульфидных связей и модификация SH-групп остатков цистеина 79
4.2.5. Определение частичной N-концевой аминокислотной последовательности 80
4.2.6. Гидролиз природного токсина Lsp-І специфической эндперотеиназой Asp-N 80
4.2.7. Электрофорез ДНК в агарозном геле 80
4.2.8. Расщепление ДНК' эпдонуклеазами рестрикции и очистка фрагментов ДНК из агарозного геля 81
4.2.9. Лигирование фрагментов кДНК в линеаризованный вектор 81
4.2.10. Получение и трансформация компетентных клеток Ecoli 81
4.2.10.1. Трансформация методом теплового шока 81
4.2.10.2. Трансформация методом электропорации 82
4.2.11. Скрининг колоний E.coli, содерлсащих рекомбинантные молекулы тазмидной ДНК, с помощью ПЦР 83
4.2.12. Выделение тазмидной ДНК 83
4.2.13. Компьютерный анализ пуклеотидных и белковых последовательностей 83
4.2.14. Функциональная экспрессия генов в кістках E.coli 84
4.2.14.1. Сборка гена зрелого токсина Lsp-І методом ПЦР 84
4.2.14.2. Получение конструкци для экспрессии гена токсина Lsp-І 84
4.2.14.3. Выделение гибридных рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии 85
4.2.14.4. Выделение рекомбинантных токсинов 86
4.2.15. SDS-электрофорез белков. 86
4.2.16. Определение концентрации белка 86
4.2.17. Определение количества белка в хроматографических фракциях по площади их пиков 87
4.2.18. Масс-спектрометриярекомбинантных токсинов 87
4.2.19. Компьютерный анализ электронных баз данных 87
Выводы 88
- Особенности пространственной организации токсинов пауков, структура цистеинового узла
- Нейротоксины из яда паука Hololena curia
- Нейротоксины из яда паука Segestria florentina
- Методы
Особенности пространственной организации токсинов пауков, структура цистеинового узла
Полипептидные токсины, выделенные из ядов пауков, - это в большинстве своем небольшие молекулы, состоящие из 26-48 аминокислотных остатков, характеризующиеся молекулярными массами в пределах 10 кДа. Количество остатков цистсина, входящих в состав этих молекул, варьирует от 6 до 14, и, что немаловажно, расположение остатков цистеина весьма консервативно (рис. 1) [5]. Большинство полипептидов этой группы содержит цистиновый узел, или «Ингибиторный цистиновый узловой мотив» (ICK). Цистиновый узел представляет собой структурный элемент, состоящий из кольца, образованного двумя дисульфидными связями (между первым - четвертым и вторым - пятым остатками цистеина) и соединяющим их полипептидным тяжем. И проходящей сквозь это кольцо третьей связью (между третьим - шестым остатками цистеина) (рис. 2) [5]. Возникновению такой конформации благоприятствует консенсусная последовательность СХ3.7-С[[Хз.8-СшХо-7-СіуХм-СуХ4.із-Суі (где X любая аминокислота), с попарным соединением, как уже говорилось, Q-Qv, QrCv, Сш-Суі, которая, однако, не считается достаточным признаком мотива [3 ,5]. Вторым признаком структуры цистинового узла является наличие р-слоя во вторичной структуре молекулы токсина, состоящего из двух или трех антипараллельных р-тяжей. Таким образом, вторичная структура нейротоксинов из ядов пауков, независимо от числа дисульфидных связей, характеризуется существенной долей антипараллельных Р-тяжей, образующих сложную контактную поверхность, и неупорядоченных цепей, расположенных терминально (N- и С-концевые области полипептидной цепи) [6]. Такая компактная Р-складчатая структура токсинов пауков, стабилизированная тремя - семью дисульфидными связями, которые обеспечивают плотную упаковку молекулы, обусловливающую высокую химическую стабильность, устойчивость к денатурации и протеолизу, а также участвует в формировании контактной поверхности вокруг гидрофобного ядра.
Известно, что К+ каналы представлены огромным количеством различных подтипов, играющих важную роль в регуляции мембранного потенциала клетки, передаче нервного импульса, работе сердечной мышцы, секреции инсулина, возбудимости нейронов, сокращении гладкой мускулатуры и регуляции объема клетки. Нейротоксины пауков в основном являются ингибиторами потенциал зависимых калиевых каналов Kv. 2.3.1 Нейротоксины из яда паука Grammostola spatulata Первыми нейротоксинами, выделенными из ядов пауков, являющимеся блокаторами потенциал зависимых К+ каналов, были ханатоксины (НаТх-1 и НаТХ-2) из яда чилийского тарантула G. spatulata [7]. Ханатоксины - это высоко гомологичные полипептидные нейротоксины, состоящие из 35 а.о. [21]. Различия в составе первичной полипептидной цепи наблюдаются у них только по 13 положению, где НаТх-1 содержит серии, а НаТх-2, соответственно, аланин (рис. 3). Значение молекулярной массы НаТх-1 составляет 4117 Да, а НаТх-2 - 4102 Да. Наряду с высокой степенью гомологии между собой данные нейротоксины не обладают значимой структурной гомологией с известными блокаторами Kv каналов из ядов скорпионов [7J. Эти токсины блокировали KV2.i потенциал активируемый канал из мозга крысы, относящийся к shab подтипу К+ каналов ( 42 нМ), а также действовали на Kv 4.2 ( ЮО нМ) К+ канал, относящийся к shal подтипу каналов [7, 21]. В свою очередь, такие подтипы потенциал зависимых К+ каналов как: зИакег-полобпые Kv ь з/юи -подобные Куз и eag К+ каналы не были чувствительны к действию ханатоксинов. Механизм действия ханатоксинов на потенциал зависимые К+ каналы заключается в связывании токсина с рецептором на субъединице канала, что вызывает сдвиг энергии открывания канала в область более деполяризующего мембранного потенциала [22]. Исследования концентрационной зависимости действия ханатоксинов на открывание канала показали, что на поверхности канала существует несколько сайтов для одновременного связывания токсина. Экспериментальные данные доказывают, что каждая субъединица канала содержит сайт связывания. Таким образом, на поверхности канала существуют по крайней мере четыре эквивалентных независимых области связывания ханатоксинов, и эти сайты удалены от центральной оси канала, что говорит о том, что ханатоксины блокируют К+ канал путем изменения потенциала открывания канала, а не физическим занятием ион проводящей поры канала [21,22]. 2.3.2. Нейротоксины из яда паука Heteropoda venatoria Гетероподатоксины - семейство полипептидных нейротоксинов, сходных с токсинами семейства ханатоксинов, гомология первичных структур токсинов между семействами достигает 39%. Из яда паука Н. venatoria, были выделены три полипептидных нейротоксина (НрТх-1, НрТх-2, НрТх-3), состоящих из 29-32 а.о. и обладающих молекулярными массами 3910 Да, 3412 Да и 3599 Да, соответственно. Процент гомологии первичных амин окисл оных последовательностей внутри семейства составил 39-41% (рис. 3) [8]. Гетероподатоксины ингибировали быстрые калиевые токи в изолированных кардиомиоцитах крыс.
Изучение механизма блокады гетераподатоксинами калиевых токов проводилось на двух различных потенциал зависимых 1,0 и Il0j калиевых каналах, клонированных из кДНК библиотеки сердечной мышцы. Было обнаружено действие гетероподатоксинов на 1ю1 канал, являющийся каналом из $/ш/-подтипа К+ каналов, 1С5о для НрТх-1 и НрТх-3 составило 100 нМ, для НрТх-2 - 67 нМ. Все три токсина не действовали на второй клонированный тип 1,0, являющийся Kv 1.4 каналом из 5/шА:ег-подтипа в концентрации до 2 мкМ [8]. Механизм блокирования канала Kv 1.4 гетероподатоксинами неизвестен, но наблюдается зависимость степени ингибирования от напряжения. Уменьшение степени ингибирования канала гетероподатоксинами при более положительных потенциалах предполагает, что деполяризация вызывает диссоциацию токсина от рецептора, таким образом, вызывая направленный внутрь ток ионов калия, либо происходит изменение энергетических характеристик открывания канала. 2.3.3. Нейротоксины из яда паука Phrixotrichus auratus Из яда паука P. auratus было выделено семейство полипептидных нейротоксинов блокаторов Kv 4 каналов, названных приксотоксинами. Приксотоксины, - РаТх-1 и РаТх-2 - новое семейство полипептидных нейротоксинов, с высокой степенью структурного родства внутри семейства (83.4%). Эти нейротоксины состоят из 29 и 31 а.о. и обладают молекулярными массами РаТх-1 - 3548 Да, РаТх-2 - 3921.7 Да. Также приксотоксины 1 и 2 характеризуются наличием структурного сходства с ханатоксинами (до 24%) и гетероподатоксинами (до 51%) (рис. 3). Механизм действия приксотоксинов схож с ингибированием ханатоксинами К+ каналов Kv 2 относящихся к s/шб-подтипу, то есть предполагается не физическое закрывание проводящей поры канала, а специфическое связывание токсина с рецептором на субъединице канала, что вызывает сдвиг энергии открывания канаїа в область более деполяризующего мембранного потенциала [9,22]. РаТх-1 и РаТх-2 блокировали А-тип калиевых токов, специфически ингибировали Kv 4.3 и Kv 4.2 токи, путем изменения воротных свойств соответствующих каналов, последний из которых Kv 4.2ток лежит в основе работы II0i канала сердечной мышцы [8]. Числовые значения IC50 для данных нейротоксинов находилось в пределах от 5 нМ для РаТх-1, до 34 нМ для РаТх-2 при ипгибировании KV4-2 канала, и значения IC50 составили 28 нМ для РаТх-1 и 71 нМ для РаТх-2 в случае ингибирования К каналов Kv 4.3 подтипа [11]. Ни один из известных подтипов калиевых каналов, таких как Kv ] /шег-подобные, Kv 2 s/mb-подобные, Kv 3 shaw-подобные, а также HERG каналы и KvLQTl/IsK каналы, не ингибировался приксотоксинами [9]. 2.3.4. Нейротоксины из яла паука Heteroscodra maculata Из яда африканского тарантула Н. maculata были выделены два полипептидных токсина (HmTxl и HmTx2) гетероскодратоксины, являющиеся блокаторами потенциал зависимых К+ каналов Kv 2. относящихся к $/ш&-подтипу и Kv 4. относящихся к 5Йа/-подтипу [3,7]. Эти нейротоксины, HmTxl и НтТх2, состоят из 35 и 38 а.о., соответственно, и характеризуются молекулярными массами 3994 Да -HmTxl и 4754 Да - НтТх2.
Нейротоксины из яда паука Hololena curia
Из яда паука Я. curta были выделены три высоко гомологичных нейротоксина, названных куртатоксинами (CT-I, СТ-П, СТ-Ш). Куртатоксин-1 состоит из 36 а.о. и обладает молекулярной массой 4103 Да, его вторичная структура стабилизирована четырьмя дисульфидными связями, образованными восемью остатками цистеина (рис. 6). Токсины СТ-И и СТ-Ш состоят из 38 а.о. и обладают молекулярными массами 4188 и 4237 Да, соответственно. Максимальная степень структурного родства внутри данного семейства наблюдается для СТ-Н и СТ-Ш (94.7%), когда различия имеются только в двух положениях 9 и 14. Куртатоксин-И содержит Arg-9 и А1а-14, в то время как куртатоксин-1 II - Lys-9 и Phe-14. Куртатоксин-1 является наиболее гетерологичным представителем данного семейства, степень структурного родства составила для него 44.7% с СТ-П и 42.1% с СТ-Ш [38]. Помимо высокого родства внутри семейства, куртатоксины обладают значительной гомологией первичных аминокислотных последовательностей с другими ингибиторами Na+ каналов, такими как р.-агатоксины I-VI, выделенными из яда паука A. aperta, причем куртатоксин-П является 100% гомологом ц-агатокеина III, а степень структурного родства других представителей данных семейств находится в пределах 33.4-94.3% [2]. Количество аминокислотных остатков цистеина и порядок замыкания дисульфидных связей аналогичен с ц-агатоксинами I-VI и характеризует все три молекулы как структуры, содержащие классический цистиновый узел (рис. 6) [38J. Куртатоксины вызывают быстрый и необратимый паралич у насекомых [2]. Механизм действия данных полипептидных токсинов неизвестен, но, по наличию высокой степени гомологии их с ц-агатоксинами и 6-палутоксинами, многие авторы относят их к нейротоксинам модуляторам потенциал зависимых Na+ каналов [3]. 2.4.6. Ней рото ксины из яда паука Paracoelotes luctuosus Из яда паука P. luctuosus было выделено семейство, состоящее из четырех высокогомологичных полипептидных нейротоксинов, палутоксинов, обладающих высокой степенью структурного родства с другими токсинами, ингибиторами Na+ каналов, из ядов пауков.
Процент гомологии первичных структур палутоксинов с другими блокаторами Na+ каналов достигал порядка 65-97%. Процент гомологии внутри семейства палутоксинов находился в пределах 98% [13]. Они состоят из 36-37 а.о. и характеризуются молекулярными массами: 5-Palu-ITl - 4038 Да, 5-Palu-IT2 -4115 Да, 5-PaIu-IT3 - 3926 Да, 5-РаШ-1Т4 - 4053 Да. Количество и порядок замыкания цистеиновых мостов у палутоксинов аналогичен таковому у ц-агатоксинов и куртатоксинов, что относит их к группе токсинов ингибиторов ионных каналов, обладающих мотивом цистинового узла (рис. 6) [39]. Электрофизиологические исследования показали, что данные неиротоксины действуют на Na+ каналы насекомых подобно 5-атракотоксинам или а-токсинам скорпионов, в частности, подобно LqhalT, но эффект действия токсинов в сравнении со скорпионовыми значительно ниже [13]. Это обусловлено тем, что 5-палутоксины взаимодействуют с сайтом связывания 3 на сс-субъединице Na+ канала, замедляя кинетику инактивации канала путем сдвига энергии активации канала в область более отрицательных потенциалов [13]. 2.4.7. Неиротоксины из яда паука Phoneutria nigriventer Из яда паука P. nigriventer было выделено несколько семейств нейротоксинов, являющихся ингибиторами Na+ каналов. Семейство токсинов, выделенных из токсичной фракции PhTx2, увеличивает время инактивации и как следствие, пролонгирует деактивацию Na+ каналов в миоцитах позвоночных [40,41]. Из токсической фракции PhTx2 было выделено новое высоко гомологичное семейство селективных ингибиторов Na+ каналов, названных фонеутоксинами: Тх2-1 состоит из 53 а.о., обладает молекулярной массой 5838.8 Да; Тх2-5 - из 49 а.о,, характеризуется молекулярной массой 5116.6 Да; Тх2-6 - 48 а.о,, с молекулярной массой 5291.3 Да; и Тх2-9 наиболее гетерогенный представитель данного семейства, состоит из 32 а.о., с массой 3742.1 Да. Степень структурного родства внутри группы находилась в пределах 21.9% для Тх2-1 и Тх2-9, до 85.4% для Тх2-5 и Тх2-6 (рис. 7) [42]. Данное семейство не имело значимой гомологии среди других токсинов ингибиторов Na+ каналов, сходство наблюдалось лишь в порядке расположения остатков цистеина и порядке замыкания цистешювых мостов. Другим токсином, также выделенным из яда P. nigriventer (токсичекая фракция PhTx4), ингибирующим потенциал активируемые Na+ каналы, стал нейротоксин Тх4(6-1) [43].
Этот нейротоксин имел максимальное гомологическое сходство с фонеутоксином Тх2-6 (31.2%), состоит из 48 а.о, и обладает молекулярной массой 5240 Да. Фонеутоксин Тх4(6-1) совместно с фонеутоксинами Тх2-1, Тх2-5, Тх2-6 и Тх2-9 формирует новое цистеин богатое семейство ингибиторов потенциал, активируемых Na+ каналов, характерной особенностью которого является аномально большое количество остатков цистеина, по 10 остатков в токсинах Тх2-1, Тх2-6, Тх4(6-1) и 11 остатков у Тх2-5 (рис. 5) [40-42]. Токсин Тх4(6-1) действует на периферическую нервную систему насекомых, вызывая секрецию глутамата в нервномышечных препаратах [43], Эффект, оказываемый Тх4(6-1) на Na+ каналы, аналогичен действию 5-палу-, и 5-атракотоксинов на потенциал активируемые Na+ каналы [13,38]. Основной отличительной чертой действия фонеутоксинов группы 2 от нейротоксина Тх4(6-1) является то, что первые действуют на Na+ каналы позвоночных, а Тх4(6-1) оказывает эффект на потенциал активируемые Na+ каналы насекомых [40, 41, 43]. Фонеутоксины группы 2 замедляют процесс инактивации потенциал активируемых Na+ каналов подобно «сайт 3» связывающимся токсинам, таким как, например, 5-атракотоксины, путем сдвига потенциал зависимой активации Na+ канала в область более негативных потенциалов, пролонгируя тем самым процесс инактивации этих каналов [41]. Было показано, что фонеутоксин Тх4(б-1) конкурентно ингибировал связывание меченного lbI-BomIV (а-токсин подобного токсина из яда скорпиона) с 1С50 25 нМ [43]. Такое действие, аналогичное действию робустотоксина, объясняется потенциал зависимым связыванием нейротоксина с рецепторным сайтом связывания 3 на а-субъединице Na+ канала, аналогичным для связывания а-токсинов скорпионов или токсинов морских анемон [3, 29]. Фонеутоксин Тх4(6-1) продлевал вызываемый в аксонах нервных клеток насекомых потенциал действия, замедляя процесс инактивации потенциал активируемых Na+ каналов насекомых [43]. Из яда паука S. huvena было выделено семейство полипептидных нейротоксинов, названных хувентоксинами. Характерной особенностью представителей данного семейства стал широкий спектр биологических активностей, проявляемых хувентоксинами [44]. Один из представителей, хувентоксин IV (HWTX-IV), действует на TTX-S Na4 каналы млекопитающих. Данный нейротоксин состоит из 35 а.о. и характеризуется молекулярной массой 4108 Да. Последовательность этого нейротоксина содержит шесть остатков цистеина, которые замыкаются в порядке 1-4, 2-5, 3-6, стабилизируя плотную пространственную укладку молекулы токсина, формируя структуру классического цистинового узла (рис. 8) [44, 45]. Несмотря на то, что этот нейротоксин относится к классу ингибиторов ионных каналов и имеет характерное для ингибиторов ионных каналов расположение и число остатков цистеина, HWTX-IV не обнаруживал значимой гомологии с ингибиторами Na+ каналов. Хувентоксин IV обладает гомологией только с хаинантоксинами, степень структурного сродства достигает порядка 80% [16, 46, 47].
Нейротоксины из яда паука Segestria florentina
Из яда паука S. florentina был выделен селективный блокатор Са2+ каналов N-типа, названный SNX-325. Этот нейротоксин состоял из 49 а.о., 8 из которых составляют остатки цистеина. Было показано, что эти остатки замыкаются в порядке 1-4, 2-5, 3-8 и 6-7, с образованием структуры цистинового узла [19]. Поиск структурной гомологии с известными токсинами блокаторами Са каналов показал, что данный токсин обладает низким уровнем структурного родства с известными токсинами. Так, например, степень структурной схожести SNX-325 с фонеутоксинами ТхЗ-3 и ТхЗ-5, являющимися ингибиторами L-типа Са2+ каналов, составила всего 26%. Степень структурного родства с w-Aga-IVA, селективным ингибитором Са2 каналов P/Q-типа, около 23% (рис. 15). Действие SNX-325 проверялось на различных типах Са2+ каналов, экспрессированных в ооцитах Xenopus. В концентрации 2мкМ SNX-325 блокировал N- (нейрональные) и L- (кардиальные) типы Са2+ каналов и показал слабое ингибирование P/Q-типа Са21" каналов. Таким образом, в физиологическом плане данный нейротоксин был охарактеризован как селективный ингибитор Са2+ каналов N-типа (IC5o 20 нМ) [19]. Специфичность действия этого нейротоксина тестировалась в серии экспериментов на различных типах катионных каналов, таких как Na+ и К+ каналы, экспрессированных в культуре клеток нейробластомы человека. В результате было показано, что SNX-325 не действовал на Na+ и К+ каналы в концентрации 2 мкМ, что охарактеризовало этот токсин как селективный ингибитор Са2+ каналов N-типа [19]. В физиологическом плане DW 13.3 был охарактеризован как селективный ингибитор N-типа Са2+ каналов. Он вызывал блок, как природных каналов, так и экспрессированных, что было показано на культуре крысиных нейронов и на оонитах шпорцевой лягушки Xenopus llaevis [86]. Исследования, проводимые на экспрессированных в ооцитах Са2+ каналах показали, что DW 13.3 обладал широким спектром физиологической активности. В концентрации 230 нМ DW 13.3 вызывал быстрое обратимое, близкое к полному, порядка 70% для Са2+ токов R-типа, 80% -для Са2 токов N-типа и 93% - для Са2+ токов L-типа, ингибирование Са2+ токов [86]. В случае с Ca2t токами P/Q-типа картина была немного иная.
Ингибирование токов, как и в первом случае, было быстрым, но ингибировались только 60% токов, а отмывка токсина и восстановление токов длилось гораздо дольше. Даже в концентрации 1.5 мкМ DW 13.3 не вызывал полного блока Са2+ токов всех тестируемых типов. Числовые значения 1С5о токсина для различных типов Са2+ каналов составили: 4.3 нМ для каналов P/Q-типа, 14.4 нМ для каналов N-типа, 26.8 нМ для каналов L-типа и 96.4 нМ для каналов R-типа [86]. Ингибирование DW 13.3 Са2+ каналов N-типа, экспрессированных в клетках млекопитающих, сильно отличалось от такового в ооцитах. Ингибирование было быстрым, практически полным ( 80%), но необратимым останавливалось менее 10% токов). Числовое значение IC50 токсина к данному типу каналов составило 2.3 нМ. Как уже было сказано, ранее DW13.3 блокировал нативные Са2+ токи N-типа в симпатических нейронах крыс. Блок, вызываемый DW 13.3, был устойчивым, но обратимым после продолжительной отмывки токсина. Этот нейротоксин, в высокой концентрации (порядка 320 нМ) блокировал co-CgTx GVIА-чувствительные Са2+ каналы N-типа на 80%, а числовое значение 1С50 токсина к данному типу каналов составило 22 нМ [86]. Заключение Все описанные в данном литературном обзоре нейротоксины, выделенные из ядов пауков, обнаруживают в различной степени структурное сходство первичных структур. Особенно высокий процент гомологии наблюдается среди токсинов, имеющих своими молекулярными мишенями ионные каналы одного типа. Как было показано, наиболее консервативное положение характерно для остатков цистеина, формирующих внутримолекулярные дисульфидные связи, стабилизирующие активную конформацию молекул токсинов. Для ряда токсинов был определен порядок замыкания дисульфидпых связей, стабилизирующих функциональную пространственную конформацию их полипептидных молекул. Оказалось, что этот порядок консервативен для подавляющего большинства полипептидных токсинов из ядов пауков, блокаторов ионных каналов. Он получил название цистинового узла, или «Ингибиториого цистинового узлового мотива» (ICK) [5]. Как было показано, в формировании цистинового узла принимают участие шесть остатков цистеина. Дисульфидные связи, образуемые первыми шестью остатками цистеина, замыкаются в порядке 1-4, 2-5, 3-6. В случае токсинов с большим количеством остатков цистеина, в формировании цистеинового узла принимают участие также шесть остатков, но порядок замыкания иной, а именно 1-4, 2-5 и 3-7. Первый порядок замыкания дисульфидных мостов обнаружен у ханатоксинов, гетераподатоксинов, гетероскодратоксинов, приксотоксинов [7-11]. Второй порядок замыкания был обнаружен, в частности, у со-агатоксинов четвертой группы, fi-агатоксинов, у фонеутоксина Тх2-1, у S-атракотоксина-АгІ [12, 14, 49, 53]. Учитывая высокую степень структурного родства первичных структур всех перечисленных нейротоксин о в, описанных выше, с токсинами, для которых был установлен порядок замыкания дисульфидных мостов, принимая во внимание сходства в механизмах действия описанных токсинов, с высокой долей вероятности можно предположить наличие цистинового узла у всех токсинов пауков ингибиторов или модуляторов ионных каналов. Это позволяет отнести их к суперсемейству структур, содержащих «ингибиторный цистиновый узловой мотив» (ICK) [5].
Для получения из цельного яда: активных соединений с искомой биологической активностью нами была использована многостадийная стратегия выделения. Яд подвергался хроматографическому разделениго, после чего каждая стадия фракционирования яда сопровождалась тестированием, получаеіиьіх фракций на наличие искомой биологической активности и в ряде случаев проводились масс-спектрометрические исследования [87], Количество доступного для работы яда было ограничено, поэтому вся схема выделения была оптимизирована для снижения возможных потерь активных компонентов при выделении. Цельный яд паука Lycosa Gen.l. sp.l тестировали на наличие функциональной активности к Са2+ каналам Р-типа на нейронах Пуркинье из мозга крысы. Цельный яд в концентрации -1 мкг/мл уменьшал амплитуду Р-токов и резко снижал кинетику активации канала. Для выделения активных компонентов было использовано гель-фил ьтраци о иное разделение цельного яда на колонке TSK-2000 SW (рис. 17). Фракции пиков I-VI были лиофилизованы и проанализированы на взаимодействие с Са2+ каналами Р-типа. Было установлено, что искомой активностью обладали фракции III-VI. Данные фракции выходили с хроматографической колонки, согласно профилю элюции, в объеме, превышающем свободный объем колонки, что говорит о плохом качестве разделения полипептидных компонентов в данной области. Поэтому фракции III-VI объединили и затем разделяли с помощью высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), на колонке с обращенной фазой (ОФ) Luna (Phenomenex) Cj8. Искомая активность, была обнаружена во фракции, соответствовавшей хорошо представленному на хроматографическом профиле пику LS (рис. 18). Исследование механизма действия токсина Lsp-І было проведено в совместной работе с сотрудниками лаборатории клеточной мембранологии Института физиологии им. А. А. Богомольца (Киев). На нейронах Пуркинье в наномолярных концентрациях Lsp-І вызывал резкое снижение энергии активации канала и уменьшал амплитуду Р-токов. Максимальный эффект достигался при концентрации около 7 нМ, но блокирование всегда было неполным: около 71±6% пика амплитуды остаточного тока (рис. 20). Быстрое действие Lsp-І на Р-токи (10 сек) было зафиксировано при высоких концентрациях токсина ( 7 нМ), а при низких концентрациях наблюдается более медленное развитие эффекта (около 300 сек при 0.7 нМ) [87].
Методы
Навеску 3 мг лиофильно высушенного яда паука Lycosa spl, растворяли в 60 мкл буфера для гель-фильтрационного разделения, содержащего 20 мМ натрий дигидр о фосфата (рН 4.5), 150 мМ NaCl. Фракционировали на колонке (7.6x600 мм, 10 мкм, 300 A) TSK 2000 SW (TOYO-SODA, Япония) вместе с предколонкой (7.6x100 мм, 10 мкм, 300 A) TSK 3000 SW (TOYO-SODA, Япония). Предварительно колонку уравновешивали в течение ночи элюирующим буфером и калибровали стандартами для гель-фильтрации при скорости элюции 0.5 мл/мин. Объём предварительно центрифугированного, наносимого на колонку образца составлял не более 20 мкл. Хроматографию проводили со скоростью 0.5 мл/мин в 20 мМ натрий дигидрофосфат, 150 мМ Nad (рН 4.5) буфере. Выход фракций определяли спектрофотометрически по поглощению при длине волны 280 нм. Сбор фракций осуществлялся при помощи автоматического коллектора фракций FC 203В (Gilson, США). Собранные на коллекторе фракции объединяли и далее диализовали (в случае с наиболее высокомолекулярными фракциями) при +4 С против 20 мМ натрий дигидрофосфатного буфера (рН 4.5) в течение 20 часов. Или обессоливали (в случае фракций с молекулярными массами менее 12 кДа) на колонке (7.8x300 мм, 300 А, 15 мкм) DeltaPak С4 (Waters, США) в ступенчатом градиенте ацетонитрила. Фракции после диализа и обессоливания тестировали на наличие искомой биологической активности. 4.2.2. Выделение активной фракции LS Фракцию, полученную после объединения активных фракций III и IV из нескольких гель-фильтрационных хроматографии и содержащую полипептиды в диапазоне молекулярных масс 0.3-7 кДа, наносили на микроаналитическую обращенофазную колонку (2x150 мм, 100 A) Luna С]8 (Phenomenex, США), предварительно уравновешенную в стартовом буфере А. Хроматографию проводили при скорости 0.15 мл/мин в градиенте концентрации ацетонитрила. Для оптимального по скорости и разрешению разделения использовали линейный градиент ацетонитрила: 0- 60% за 80 мин, 60-»70% за 0 мин. Выход фракций определяли спектрофотометрически по оптическому поглощению при длине волны 210 и 280 нм. Фракции, полученные после Luna С,8, частично упаривали на системе SpeedVac и дважды лиофилизовали, после чего проводили тестирование аликвот фракций на наличие искомой биологической активности, а также масс-спектрометр ически й анализ.
Активную, многокомпонентную (по данным масе-спектрометрии) фракцию LS, рехроматографировали на обращено фазной колонке (2x150 мм, 300 A) Jupiter С5 (Phenomenex, США), предварительно уравновешенную в стартовом буфере А. Хроматографию проводили при скорости 0.3 мл/мин в градиенте концентрации ацетонитрила. Для оптимального по скорости и разрешению разделения компонентов использовали линейный градиент ацетонитрила: 0 60% за 60 мин. Выход фракций определяли спектрофотометрически по оптическому поглощению при длине волны 210 и 280 нм. Фракции, полученные после Jupiter С5, частично упаривали на системе SpeedVac и дважды лиофилизовали, после чего проводили тестирование аликвот на наличие искомой биологической активности, а также масс-спектрометрический анализ. Выделенный в чистом виде токсин Lsp-І для дальнейшего использования хранили при температуре -70 С. 4.2.4. Восстановление дисульфидных связей и модификация SH-групп остатков цистеина Восстановление дисульфидных связей [128]: 100-200 пмоль лиофилизованного препарата белка растворяли в 10 мкл восстанавливающего буфера (0,3 М Трис-НС1, 6 М гуанидин хлорид, 2 мМ EDTA (рН 8.0)). Перед добавлением буфер насыщали 15 минут азотом для удаления растворенного кислорода, образец выдерживали при 60 С в течение 1 часа при перемешивании. К охлажденному до комнатной температуры образцу добавляли 10 мкл 60 мМ ДТТ (100 кратный избыток по отношению к количеству SH-групп) в восстанавливающем буфере, также предварительно насыщенного азотом. Реакцию восстановления проводили в темноте в течение 12-14 часов, при температуре 25 С. Модификация SH-групп 4-винил пиридином [128]: трехкратный избыток 4-винилпиридина по отношению к имеющемуся в реакционной смеси ДТТ растворяли в 10 мкл метанола и добавляли к восстановленному белку. Реакцию модификации проводили при комнатной температуре в течение 15 минут. Реакцию останавливали добавлением буфера А. Избыток не прореагировавших компонентов и продуктов полимеризации 4-винил пиридина удаляли хроматографией реакционной смеси на колонке с обращенной фазой Jupiter С5 (Phenomenex, США) 2 х 150 мм 300 А, предварительно уравновешенной 15% ацетонитрилом в 0.1% ТФУ. Модифицированные полипептиды элюировали с колонки в линейном градиенте ацетонитрила. _ 4.2.5. Определение частичной N-концевой аминокислотной последовательности Аминокислотные последовательности природного и рекомбинантного токсина Lsp-І .определяли,, .с.,помощью метода автоматической деградации белков на жидкофазном секвенаторе Procise модели 492 (Applied Biosystems, США). 4.2.6. Гидролиз природного токсина Lsp-І специфической эндперотеиназой Asp-N Для гидролиза природного токсина Lsp-І специфической энтеропротеиназой Asp-N брали аликвоту восстановленного и алкилированного 4-винил пиридином Lsp-1 (порядка 3 мкг (500 пмоль)).
Образец растворяли в 25-30 мкл 50 мМ NaPi буфера рН 8.0. Затем к образцу добавляли энтеропротеиназу в соотношении фермент/субстрат 1/40 по массе. Реакцию гидролиза проводили при температуре 37С в течение 6 часов. Реакцию останавливали добавлением 0.1% ТФУ в воде (буфер А для ВЭЖХ), и гидролизат наносили на микроаналитическую обращено фазную колонку (2x150 мм, 100 A) Luna Cig (Phenomenex, США), предварительно уравновешенную в стартовом буфере А, Хроматографическое разделение продуктов гидролиза проводили при скорости 0.15 мл/мин в градиенте концентрации ацетонитрила. Использовали линейный градиент ацетонитрила: 0- 60% за 80 мин, 60-»70% за 0 мин. Выход фракций определяли спектрофотометрически по оптическому поглощению при длине волны 210 и 280 нм. Суспензию агарозы в воде доводили до кипения при перемешивании, охлаждали до 55-60С, добавляли 50х буфер ТАЕ (до 1х) и раствор бромистого этидия (менее 1 мкг/мл), раствор заливали в пластинку для горизонтального фореза, вставляли гребенку и давали гелю застыть. Раствор ДНК смешивали с бх буфером для образцов и наносили в лунки. Электрофорез вели при 100-130 В. ДНК (плазмидную или полученную в процессе амплификации) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции в объеме 10-20 мкл реакционной смеси, содержащей 1х буферный раствор, соответствующий используемому ферменту (0.5-2 мкг ДНК и 1-3 ед. акт. фермента на 1 мкг ДНК). Гидролиз проводили при 37С в течение 1-3 часов. Полноту прохождения реакции контролировали электрофорезом в агарозном геле. Для очистки нужный фрагмент ДНК из агарозного геля переносили "на ДЕАЕ- NA45 [129], экстрагировали солевым раствором, содержащим 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ EDTA, 1М NaCl (рН 8.0) при 65С в течение 30-40 мин, водный раствор экстрагировали смесью фенол/хлороформ, затем хлороформом и высаживали этанолом в присутствии 0.3 М ацетата натрия (рН 5.2). 4.2.9. Лигирование фрагментов кДНК в линеаризованный вектор В реакционную смесь вносили 2 мкл 10х буфер для Т4 ДНК лигазы (300 мМ Трис-НСІ, рН 7.8,.100 мМ MgCl2, 100 мМ ДТТ, 5 мМ АТР), 2 мкл 10 мМ АТР, 50-100 нг линеаризованной векторной ДНК, фрагмент ДНК для клонирования в количестве в 5 раз большем (по соотношению пМ концов ДНК), 2-3 ед. Т4 ДНК лигазы. Объем реакционной смеси доводили до 20 мкл водой и лигировали при 14С в течение ночи.
