Введение к работе
Актуальность проблемы
Пептидные соединения, функция которых связана с взаимодействием с биологическими мембранами или структура которых обеспечивает эффективность этих взаимодействий, получили общее название мембрано-активных пептидов (МАП). МАП представляют обширный и гетерогенный класс веществ, используемых живыми организмами от бактерий до человека в различных целях. В основе такой универсальности МАП лежит способность взаимодействовать не со специфическим белковым рецептором, а с липидным бислоем, неотъемлемым компонентом клеточных форм жизни. Благодаря этому свойству МАП являются вездесущими участниками внутри- и межвидовых отношений.
Наиболее характерная черта большого числа МАП - способность к дестабилизации мембраны-мишени, приводящей к клеточной гибели. МАП, функция которых состоит в разрушении мембраны и поражении клетки, называют цитолитическими пептидами (ЦП). ЦП представляют собой одно из наиболее простых по механизму действия и структурной организации, а также наиболее древних по происхождению и универсальных по сфере применения орудий в борьбе организмов друг с другом.
Разнообразные пептиды с выраженным антимикробным действием (т.н. антимикробные пептиды, АМП) проявляют также цитолитические свойства. У высших организмов (как животных, так и растений) АМП являются важнейшей частью системы врожденного иммунитета, характерного, в отличие от приобретенного, практически для всех многоклеточных, а не только для высших позвоночных. Таким образом, для многих ЦП (АМП) характерна защитная функция. Не менее эффективно ЦП могут быть использованы и в целях нападения. ЦП - распространенные эффекторные молекулы-участники в конкурентной борьбе микроорганизмов. Однако наиболее ярким примером служат ЦП, продуцируемые ядовитыми животными. Некоторые из этих молекул являются наиболее значимым компонентом их яда, выполняющим главную функцию убийства/парализации жертвы и/или отпугивания агрессора.
МАП являются удобной моделью для изучения белок-мембранных взаимодействий и, таким образом, представляют фундаментальный интерес. ЦП и АМП считают принципиально новым классом антибиотических веществ, которые будут введены в клиническую практику. Способность быстро поражать клетки-мишени, широкий спектр действия, активность в отношении штаммов, резистентных к другим антибиотикам, а также трудность в селекции устойчивых к ЦП и АМП мутантов позволяют рассматривать эти соединения в качестве основы для создания новых лекарств, особенно на фоне глобальной проблемы снижения эффективности обычных антибиотиков. ЦП и АМП представляют также инструмент инженерии устойчивости растений к патогенам и могут быть использованы в «зеленой» биотехнологии.
Цель и задачи работы
Цель настоящей работы состояла в изучении цитолитических и антимикробных пептидов (ЦП и АМП) из яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi. В соответствии с целью были поставлены следующие конкретные задачи:
а) Провести идентификацию и выделение ЦП и АМП из цельного яда;
б) Установить первичную структуру активных пептидов;
в) Осуществить функциональную характеристику новых веществ;
г) Изучить аминокислотную последовательность предшественников ЦП и
АМП;
д) Разработать систему гетерологичной экспрессии генов новых пептидов.
Научная новизна работы
Впервые проведен комплексный анализ МАП из яда паука. Установлена первичная структура 41 новых пептидов, образующих 13 новых семейств. Для восьми семейств ЦП и АМП проведена характеристика их биологической активности. Открыты уникальные компоненты яда паука, обладающие одинаково значимой цитолитической, антимикробной и инсектицидной активностью, формирующие новый класс ЦП и АМП - цито-инсектотоксины.
Обнаружено (впервые для паукообразных) широкое разнообразие строения молекул предшественников новых МАП. Предложена схема биосинтеза пептидов; показана функция пропоследовательности в нейтрализации активности зрелой цепи.
Выдвинута гипотеза о «биомолекулярном» разнообразии компонентов природных ядов, в частности, компонентов с цитолитическими свойствами. Предположено, что паук L. tarabaevi относится к новой группе ядовитых животных в классификации согласно молекулярному составу яда. Выдвинута гипотеза об эволюции компонентов яда с появлением «модульных» токсинов сложного строения.
Практическая ценность работы
Полученные в ходе выполнения данной работы АМП представляют большой практический интерес, поскольку могут быть использованы в качестве антибиотиков нового типа. По антимикробной активности полученные пептиды не уступают лучшим мировым аналогам. Серьезным препятствием к широкому применению АМП в клинике служит высокая стоимость производства. Альтернативой дорогостоящему химическому синтезу является биотехнологическое получение АМП. В рамках настоящей работы впервые проведено получение МАП из яда паука в бактериальной системе экспрессии. Результаты работы предполагается использовать для создания технологии производства АМП.
Новые АМП предполагается также использовать в сельскохозяйственной биотехнологии с целью инженерии устойчивости культурных растений к бактериальным и грибным патогенам.
Апробация работы
Основные материалы диссертации были представлены на 15-м мировом конгрессе по токсинам животных, растений и микробов (Глазго, Великобритания, 2006), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), 2-м симпозиуме по биофизике мембрано-активных пептидов (Лиссабон, Португалия, 2007), Гордоновской научной конференции «Механизмы мембранного транспорта» (Тилтон, США, 2007), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды». (Пущино, 2007), симпозиуме «Нейрорецепторы: структура, механизм действия и роль в патологиях» (Москва, 2007), XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 16-м собрании Европейской секции международного общества токсинологии (Левей, Бельгия, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано пять статей в международных журналах и глава в монографии.
Патенты
В рамках выполнения диссертационной работы получено шесть патентов Российской Федерации.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на страницах, содержит
рисунков и таблиц, имеет традиционную структуру и состоит из
следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов,
результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы,
включающего источников.
